Agradecemos a drs. Yuh-Nung Jan e Wes Grueber para a prestação de stocks voar utilizados neste estudo, e Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin e Dr. Lance Liotta para assistência com LCM. Os autores agradecem o F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust para apoio a esta pesquisa (DNC) e George Mason University Provost Escritório s (EPRI).

Comentários gerais sobre LCM de Drosophila periférica Neurônios Permitir que a partir de 6 horas, até uma semana ou mais para LCM, dependendo do tipo de tecido eo número de células necessárias. Todos os procedimentos são realizados em estrita RNAse-free condições seguintes procedimentos padrão. Larvas expressar tanto 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP ou ppk-GAL4, UAS-mCD8:: Linhas repórter GFP transgênicas foram utilizados para esses experimentos. 1. Preparando as larvas <ol><li> Coletar 30-40 pareados por idade larvas de terceiro estádio e lave-os em DDH 2 O seguido por lavagens em breve Fora RNAse (Sigma-Aldrich), e uma lavagem final em DDH 2 O RNAse para remover Away. Wick o excesso DDH 2 O completamente com um Kimwipe limpa antes de incorporar as larvas em outubro </li><li> Tome um molde incorporação limpa tecido e camada com uma camada (1,5-2mm) fina de outubro, apenas o suficiente para cobrir uma única camada de larvas. </li><li> Antes de incorporar as larvas, se necessário, arrefecer o OCT para 0 ° C nos moldes de incorporação do tecido. Fazer isso colocando o molde contendo outubro em um bloco de gelo. Isto ajudará a reduzir o movimento larval durante o processo de incorporação. </li><li> Coloque as larvas limpa no outubro de pré-resfriado e organizá-los em paralelo um ao outro. Uma vez que as larvas foram organizados, lentamente preencher o molde com outubro, sem perturbar o arranjo larval. Snap congelar o molde, colocando-o em um bloco de gelo seco. [Passo Crítico:. Snap-congelante as larvas imediatamente para reduzir o movimento] Este método permitirá que as larvas de estar em um único plano, maximizando o número de células disponíveis por seção para captura. </li></ol> Se for necessário para preservar a morfologia do tecido para identificar as células de interesse, ou se o número esperado de células por seção é considerada satisfatória em seguida, avance directamente para o Passo 11. Alternativamente, se as células são rotulados especificamente e podem ser identificados com um marcador facilmente identificáveis, tais como GFP ou RFP, mas o número de células por seção for considerada baixa, então 5-10 passos podem ser úteis para aumentar o número de células disponíveis para a captura por seção. Estes são passos opcional e deve ser considerado apenas se for necessário, como um método para aumentar o número de neurônios da disponíveis para LCM por seção, quando o outro método não fornece resultados favoráveis. [Atenção: Este método pode perturbar a morfologia dos tecidos em geral e tornar a identificação de tecidos com base na localização espacial específica muito difícil.] <ol start="5"><li> Lavar 50-70 larvas de terceiro estádio como descrito na Etapa 1. Coloque as larvas em um microtubo de 1,5 ml contendo 500 mL de RNAse 1X PBS. </li><li> Dounce as larvas utilizando um pilão de polipropileno (EUA Científica), com 6-7 lento golpes poderosos. </li><li> Centrifugar a solução a 16.000 (x) g por 5-10 segundos (até as cutículas larval sossegar até o fundo do tubo de microcentrífuga]. Desprezar o sobrenadante. O pellet deve consistir principalmente de cutícula larval em que o PNS, incluindo os neurônios da , está fortemente aderido. </li><li> Lave a cutícula pellet 2-3 vezes em 1X PBS eo pellet ressuspender em 500 mL de 1X PBS. Girar a solução a 16.000 (x) g por 1 minuto para formar uma pelota compacta. Aspirar o sobrenadante completamente usando uma multa Pasteur pipeta. </li><li> Remova cuidadosamente o sedimento do tubo de microcentrífuga com uma espátula limpa, e pavio fora da PBS em excesso com um lenço de papel Kimwipe limpo. [Nota: É importante manter o pellet o mais compacto possível para aumentar o rendimento das células]. Coloque o compacto cutícula pellet em um molde de plástico contendo uma fina camada de outubro (aproximadamente 1mm). </li><li> Delicadamente espalhar-se o sedimento em uma área circular fina. Preencher o molde com outubro, e congelar o tecido, como descrito na Etapa 4. </li><li> Utilizando um criostato, cortar seções congeladas a espessura 5-8 mM na planície, rotulado, sem carga, RNAse lâminas de microscópio livre vidro. [Passo Crítico: Posicione a cortes de tecido, perto do centro do slide.] </li><li> Armazenar os slides diretamente em gelo seco ou a -80 ° C em um ambiente limpo deslize-box até que esteja pronto para microdissecção. Executar LCM de preferência dentro de uma semana após o corte do tecido. </li></ol> PONTO PAUSE 2. Remoção de desidratação e congelados a partir da cutícula larval Seções [Passo Crítico: Todas as soluções para a desidratação deve ser renovada antes de cada sessão LCM. Desidratação completa de cortes de tecidos congelados larval é essencial para alcançar a eficiência ideal microdissecção] <ol><li> Retire as lâminas contendo os cortes de tecidos congelados larval do freezer -80 ° C e colocá-los em gelo seco. </li><li> Remover um único slide de gelo seco e imediatamente colocá-lo diretamenteem um tubo de 50 ml cheio de fixador de etanol 70%, seguido por um curto enxágüe em RNAse DDH 2 O de acordo com os tempos recomendados apresentados na Tabela 1. </li><li> A presença de cutícula larval nas seções congeladas pode prejudicar a eficiência da captação eficiente, impedindo LCM contato cap células que podem levar à não-específica de captura. Se necessário, realizar os seguintes passos (4-5) para limpar a cutícula das seções do tecido. </li><li> Suavemente pipeta 50 ul de tripsina 2,5% diretamente sobre as secções de tecido e incubar por 5-30 segundos à temperatura ambiente. [Passo Critical: Esse passo pode exigir de otimização. O tempo de incubação depende do tecido a ser microdissecção e espessura de corte. Mais de incubação pode limpar tudo, incluindo as células de interesse, enquanto que uma incubação é curto, pode ser insuficiente para remover a cutícula] </li><li> Lave as seções brevemente em um tubo de 50 ml contendo RNAse-free DDH 2 O para remover tripsina, e fragmentos de cutícula frouxamente aderido. </li><li> Mergulhar as lâminas seqüencialmente em cada um dos restantes etanol e xileno soluções para os horários recomendados (Tabela 1) para completar o processo de desidratação. </li><li> Seguindo o gradiente de desidratação, as lâminas são brevemente seco sob uma corrente de ar suave para 60-120 segundos à temperatura ambiente antes de executar LCM. [Cuidado: Seque o xileno completamente as secções de tecido antes de realizar LCM. Xileno é conhecido por dissolver a LCM cap polímero resultando em insuficiência microdissecção]. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Etanol 70% (Fixação) </td><td> 10/03 Segundos </td></tr><tr><td> 2 O DDH </td><td> Segundos 10/05 </td></tr><tr><td> Incubação Tripsina 2,5% </td><td> Segundos 30/05 </td></tr><tr><td> 2 O DDH </td><td> Segundos 10/05 </td></tr><tr><td> Etanol 70% </td><td> 60 Seconds </td></tr><tr><td> Etanol 95% </td><td> 60 Seconds </td></tr><tr><td> O etanol 100% </td><td> 120 Seconds </td></tr><tr><td> O etanol 100% </td><td> 120 Seconds </td></tr><tr><td> Xileno 100% </td><td> 120 Seconds </td></tr><tr><td> Xileno 100% </td><td> 120 Seconds </td></tr><tr><td> Ar seco em um fluxo de ar leve </td><td> 60-120 Segundos </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Procedimento recomendado para a desidratação LCM de cortes de tecidos congelados larval. 3. Laser Microdissecção Captura PixCell IIe instrumento LCM equipado com Fluor 300 óptica de epifluorescência otimizado para EGFP foi usado para a realização do LCM. [Passo Crítico: Se possível, execute as microdissecção em uma sala com controle de umidade para evitar qualquer redução na eficiência microdissecção devido ao aumento da umidade. Humidade ambiente é um fator crítico que afetam a eficiência microdissecção. Humidade ambiente de baixa pode causar um aumento static-se apegam resultando em não-específico de captura, enquanto humidade ambiente elevada pode resultar em eficiência microdissecção baixo. Conseguimos eficiência LCM ideal entre 25-50% as condições de umidade relativa.] <ol><li> Ligue a energia para o microscópio e caixa de controle a laser. </li><li> Carregar o conjunto do suporte CapSure tampa com HS LCM tampas (dispositivos Molecular): Dois cartuchos de tampas LCM pode ser carregado em uma hora. </li><li> Abra o software de dispositivos moleculares e insira os detalhes experiência, incluindo número do slide e número de lote Cap. </li><li> Carregar um novo HS cap LCM do cartucho no instrumento PixCell LCM IIe e posicioná-lo corretamente com relação ao joystick para garantir o posicionamento adequado da tampa em relação à área de captura. </li><li> Coloque a lâmina de microscópio contendo fresco desidratado secções de tecido larval no palco microscópio para microdissecção. </li><li> Localizar as células fluorescente etiquetado com o oculares ou a tela do computador. Devido à elevada especificidade de ppk-GAL4, UAS-mCD8:: GFP linha repórter transgênicos, a classe IV da neurônios podem ser facilmente identificados por GFP fluorescência. </li><li> Assunto para o tecido usando LCM CapSure HS LCM tampas [para um conjunto detalhado de instruções para a configuração do instrumento, focalizando o laser e realizando LCM ver referência 22]. </li><li> Ajustar o &quot;Power&quot; e &quot;Duração&quot; parâmetros do laser de pulso para alcançar um ponto de polímero precisa derretido, cujo tamanho corresponde ao tamanho selecionado a laser spot. Ajustar as configurações para personalizar o tamanho da área de polímeros derretido. Os seguintes parâmetros foram usados ​​para microdissecting única classe IV da neurônios: Diâmetro 7,5 ponto M, a força do laser 30-50 mW, tempo de laser e 2-4 e 1-2 ms shots por célula foram utilizados. [Passo Crítico: os parâmetros do laser necessária para um local adequado pode variar com a espessura do tecido e as condições de umidade ambiente. Ajustar o &quot;Power&quot; e &quot;Duração&quot; configurações para alcançar o tamanho exigido local derreteu polímero para microdissecting células únicas ou múltiplas.] </li><li> Para maximizar a especificidade, microdissect células com sobreposição mínima e uma fluorescência forte. Cada cápsula é capaz de capturar corpos celulares numerosos. [Passo Crítico: Para evitar a degradação do RNA, limitar o tempo de análise total, incluindo a desidratação e microdissecção para menos de 45 minutos] </li><li> Uma vez que todas as células de interesse foram capturados, levante a tampa HS LCM com as células microdissecção e colocou-o sobre uma lâmina limpa para confirmar a presença das células capturado e inspecionar visualmente a tampa para a presença de células indesejáveis ​​ou detritos. </li></ol> 4. RNA isolamento de células derivadas LCM <ol><li> Coloque a tampa contendo as células microdissecção a um dispositivo (dispositivos Molecular) ExtracSure. Adicionar 12μl de extração de RNA buffer (PicoPure, Dispositivos Molecular) para a superfície cap contendo as células e conectar um tubo de reação invertida de paredes finas (GeneAmp, a Applied Biosystems) para o dispositivo ExtracSure. Coloque o conjunto em uma bandeja de alinhamento (dispositivos Molecular) e cobri-lo com um bloco de incubação (dispositivos Molecular) pré-aquecido a 42 ° C dentro de uma incubadora. </li><li> Após incubação de 30 minutos, centrifugar os tubos contendo os extratos a 800 (x) g por 2 minutos. Fechar os tubos e armazenar os extratos de células a -80 ° C até que esteja pronto para a purificação de RNA. </li></ol> PONTO PAUSE <ol start="3"><li> Extrair e purificar o RNA coluna de acordo com o PicoPure (dispositivos Molecular) RNA instruções do kit de extração. Tratamento DNAse é opcional, e pode ser realizada na coluna durante a purificação RNA, se necessário. Se necessário, as amostras de LCM múltiplos podem ser agrupados durante a depuração em uma única coluna para aumentar o rendimento final e RNA podem ser eluídos em um pequeno volume (11-30 mL) de tampão de eluição (PicoPure, Dispositivos Molecular) e armazenadas a -80 ° C até que esteja pronto para uso. Se desejar uma alíquota de 1 ml pode ser usado para avaliar a qualidade do RNA total em um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Resultados representante Laser microdissecção de captura (LCM) foi usado para isolar único, específico de classe ou múltiplos neurônios da Drosophila de larvas de terceiro estádio (Figura 1). LCM permite um alto grau de precisão e especificidade no isolamento de Drosophila da corpos celulares de neurônios (Figura 2a-c). Além disso, o RNA total purificado destas neurônios isolados da foi encontrado para ser de excelente qualidade, como indicado pela presença de 5.8S afiada, 18S e 28S ribossomal RNA picos quando analisado em um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) (Figura 2d). Para avaliar o enriquecimento neuronal específico de nossas células isoladas foi realizada quantitativa em tempo real transcrição reversa PCR (qRT-PCR), utilizando o gene marcador neuronal específica, elav. Para as análises qRT-PCR, foram calculados os níveis relativos de expressão elav no LCM microdissecado neurônios da expressão e esta normalizada para que do nosso controle endógeno (rp49) e relativamente ao RNA total isolado de larvas inteiro usando o método ΔΔCt 23. Essas análises revelaram mais de 2,5 vezes no enriquecimento dos níveis relativos de elav no LCM micro-dissecados amostras da neurônio, em comparação com animais inteiros (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: LCM de neurônios periféricos Drosophila. (A) Idade combinado larvas de terceiro estádio são selecionados, lavados e (b) incorporado em um cryomold com outubro e congeladas a -80 ° C, (c) 8μm cortes de tecido de série são criados utilizando um criostato padrão e (d) colocado uniformemente sobre lâminas de vidro limpo. As lâminas de vidro com as secções de tecido afixadas são armazenadas a -80 ° C antes da LCM processamento. (E, f) Imediatamente antes LCM, as secções de tecido são descongeladas e brevemente fixadas em etanol 70% seguido de enxágüe em breve DDH 2 O. (g) Os slides são brevemente incubadas com tripsina e lavadas com DDH 2 O para remover cutículas (preto) das seções larval. (h, i) seções do tecido sem cutícula larval são, então, desidratadas em gradiente de etanol e, finalmente, diafanizadas em xilol . (j) O cap LCM com um polímero termolábil é colocado na secção de tecido eo laser é pulsada sobre o corpo da célula selecionada fluorescente. O pulso de laser derrete o polímero e engole o corpo da célula selecionada. A tampa de polímero, juntamente com o corpo da célula capturada é levantado, e (k) </strong&gt; tampão de extração de RNA é adicionada à célula. A célula capturado, juntamente com o tampão de extração de RNA é incubada a 42 ° C por 30 minutos e podem ser armazenadas a -80 ° C, ou processado diretamente para a purificação de RNA. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: LCM facilita a captura de alta precisão de neurônios da. (A) Imagem representativa de um desidratados e tratados tripsina 8 secção de tecido antes da LCM micron desempenho, mostrando dois neurônios classe IV da rotulados com GFP pela ppk-GAL4, UASmCD8:: GFP tensão repórter. Note, um dos neurônios é destaque (seta) para a captura. (B) o corpo celular do neurônio destaque (seta) é limpa micro-dissecados com alta especificidade da secção de tecido. (C) Fim-de vista de uma única classe -IV da neurônio capturados na tampa da LCM. (d) Agilent 2100 Bioanalyzer electroferograma (Agilent Technologies, Inc.) de RNA total isolado de neurônios derivados da LCM-, mostrando qualidade RNA excelente como indicado pela presença de 5.8S afiada, 18S e 28S rRNA picos. <img src="/files/ftp_upload/2016/2016fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3:. QRT-PCR revela enriquecimento substancial de expressão neuronal gene marcador em neurônios da LCM capturado em relação ao animal inteiro qRT-PCR análises de neurônio-específica a expressão do gene marcador (elav) em LCM capturado da neurônios (21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP) e animais inteiros em idade correspondente larvas de terceiro instar foi realizado em triplicata. Níveis relativos de expressão em elav LCM capturado da neurônios foram normalizados para o controle endógeno (rp49) e em relação a larvas inteiro usando o método ΔΔCt 23. A enriquecimento de 2,5 vezes nos níveis relativos de elav no LCM capturado amostras da neurônio foi observada em relação a animais inteiros. Solução de problemas Problema: RNA degradado, ou de baixa qualidade. Garantir RNAse condição livre durante todo experimento. Tente reduzir quantidade de tempo gasto em LCM por slide a 30 minutos. Manter os slides e as amostras em gelo seco, exceto ao realizar LCM. Evitar o descongelamento das secções de tecido, uma vez que são cortadas. Problema: A maioria das células são perdidos a partir do slide durante a tripsina tratamento (etapa 17-18). Tente reduzir o tempo de tratamento de tripsina. Tente reduzir a concentração de tripsina. Problema: Presença de cutícula e outros restos de tecido não-específicos no polímero cap. Tente remover os escombros do tecido borrando a superfície do polímero com o lado brega de uma nota adesiva 22. Problema: a eficiência LCM Low. Tente aumentar o tempo de incubação em etanol 100% e xilenos. Reduzir a umidade do quarto usando desumidificadores.

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting,+for+use+in+gene+expression+profiling.">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li><li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting.">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li><li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS)+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes.">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li><li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry.">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li><li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS.">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li><li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li><li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging.">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li><li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4++and+CD8++Lineages.">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li><li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR:+An+emerging+technology+hits+the+mainstream.">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li><li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification.">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li><li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons.">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li><li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses.">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li><li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR.">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li><li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity.">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li><li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling:+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning.">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo aqui apresentado descreve o nosso método otimizado para o isolamento de neurônios periféricos Drosophila via LCM. Embora este protocolo LCM foi projetado para o isolamento específico de único, específico de classe ou múltiplos neurônios da Drosophila a partir da fase de terceiro instar larval de desenvolvimento, pequenas modificações do protocolo pode ser facilmente adaptado para a captura de outros tipos de células Drosophila desenvolvimento de todos os estágios usando...

Equipamento: <ul><li> Criostato </li><li> 50 tubo cônico ml para a fixação de slide, lavagem de tratamento, tripsina e etanol / xileno desidratação </li><li> -80 ° C freezer </li><li> Incubadora </li><li> PixCell IIe Instrumento LCM com Fluor 300 óptica de epifluorescência otimizado para EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) </li></ul>

laser capture microdissection of drosophila peripheral neurons

A arborização dendrítica (da) neurônios do sistema nervoso periférico Drosophila (PNS) fornecer um sistema modelo excelente para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à classe específico 1,2 morfogênese dendrite. Para facilitar a análise molecular de classe específico da neurônio desenvolvimento, é vital para obter essas células em uma população pura. Embora uma gama de células diferentes, e específicos do tecido técnicas de isolamento de RNA existem para células Drosophila, incluindo a purificação de células grânulo magnético baseado 3,4, separação de células fluorescentes Ativado (FACS) 5-8, e proteína RNA ligação estratégias baseadas 9, nenhum dos estes métodos podem ser facilmente utilizadas para isolar um ou vários de classe específica de neurônios da drosófila com um alto grau de precisão espacial. Laser Microdissecção Capture (LCM) emergiu como uma ferramenta extremamente poderosa que pode ser usado para isolar tipos específicos de células a partir de secções de tecido com um alto grau de resolução espacial e precisão. RNA obtido a partir de células isoladas podem então ser usados ​​para análises incluindo qRT-PCR e perfil de expressão microarray dentro de um tipo de célula dada 10-16. Até à data, LCM não tem sido amplamente aplicado na análise de tecidos e células Drosophila 17,18, incluindo os neurônios da na terceira fase larval estádio de desenvolvimento. Aqui apresentamos o nosso protocolo otimizado para o isolamento de neurônios da drosófila usando a classe infravermelho (IR) da LCM. Este método permite a captura de único, específico de classe ou múltiplos neurônios da alta especificidade e com resolução espacial. Pareados por idade larvas de terceiro estádio expressando um UAS-mCD8:: GFP transgene 19 sob o controle de qualquer um da classe IV da neurônio específico ppk-GAL4 20 driver ou o pan-da neurônio específico 21-7-21 GAL4 motorista foram utilizados para estes experimentos. RNA obtido a partir de neurônios isolados da é de qualidade muito alta e pode ser usado diretamente para aplicações a jusante, incluindo qRT-PCR ou microarray análises. Além disso, este protocolo LCM podem ser facilmente adaptadas para capturar outros tipos de células Drosophila um vários estágios de desenvolvimento depende do tipo específico de célula, padrão de expressão GAL4-driven da GFP.

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Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para isolar um ou vários<em&gt; Drosophila</emNeurônios&gt; da a partir de larvas de terceiro estádio usando a captura de infravermelho (IR) da classe Laser Microdissecção Capture (LCM). RNA obtido a partir de neurônios isolados podem ser facilmente usados ​​para aplicações a jusante, incluindo qRT-PCR ou microarray análises.

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

laser-capture-microdissection-of-drosophila-peripheral-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

13.4K visualizações.  George Mason University. Neste vídeo-artigo apresentamos um método para isolar um ou vários Drosophila da a partir de larvas de terceiro estádio usando a captura de infravermelho (IR) da classe Laser Microdissecção Capture (LCM). RNA obtido a partir de neurônios isolados podem ser facilmente usados ​​para aplicações a jusante, incluindo qRT-PCR ou microarray análises.

Vídeo: Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Neurociência

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, microvascular proliferation, mesenchymal transformation and necrosis characterize the histological heterogeneity of high-grade gliomas. Our laboratory has demonstrated that the presence of high densities of mesenchymal cells, named oncostreams, correlate with tumor malignancy. We have developed a unique approach to understand the mechanisms that underlie glioma&#39;s growth and invasion. Here, we describe a comprehensive protocol that utilizes laser capture microdissection (LMD) and RNA sequencing to analyze differential mRNA expression of intra-tumoral heterogeneous multicellular structures (i.e., mesenchymal areas or areas of tumor invasion). This method maintains good tissue histology and RNA integrity. Perfusion, freezing, embedding, sectioning, and staining were optimized to preserve morphology and obtain high-quality laser microdissection samples. The results indicate that perfusion of glioma bearing mice using 30% sucrose provides good morphology and RNA quality. In addition, staining tumor sections with 4% Cresyl violet and 0.5% eosin results in good nuclear and cellular staining, while preserving RNA integrity. The method described is sensitive and highly reproducible and it can be utilized to study tumor morphology in various tumor models. In summary, we describe a complete method to perform LMD that preserves morphology and RNA quality for sequencing to study the molecular features of heterogeneous multicellular structures within solid tumors.

Laser microdissection (LMD) is a sensitive and highly reproducible technique that can be used to uncover pathways that mediate glioma heterogeneity and invasion. Here, we describe an optimized protocol to isolate discrete areas from glioma tissue using laser LMD followed by transcriptomic analysis.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão