Este trabalho é financiado por R01 NS052532 (para HLH), a Fundação Moody, e do Departamento de Anestesiologia. Agradecemos Laurie Bolding, Christine Courteau Butler e Christy Perry para a sua assistência editorial, e Christy Perry para layout e excelente produção de todas as figuras, tabelas e ilustrações.

1. Procedimentos Cirúrgicos e Percussão Fluid TCE <ol><li> Todos os experimentos com animais são primeiro aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade do Texas Medical Branch, Galveston, Texas e do Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8 ª edição, Conselho Nacional de Pesquisa). </li><li> Os ratos (machos adultos Sprague-Dawley, 400-500 g obtido a partir do fornecedor de Charles Rivers, Portland, Maine) são alojados dois por gaiola e forneceu comida e água ad libitum num viveiro com estas condições constantes: ciclo de luz (600 a 1800 hr h), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e humidade (40% a 50%) uma semana antes da utilização. </li><li> Anestesiar ratos com 4% isoflurano, intubar e ventilar mecanicamente (NEMI Científico; New England Medical Instruments, Medway, MA) os ratos com 1,5-2,0% de isoflurano em oxigênio: o ar (70:30) e prepará-los para parassagital fluido-percussão ferimento, como descrito anteriormente. 8, 10 </li><li> Sacrificar ratos no ponto de tempo apropriado após a lesão, dependendo do desenho experimental. Remover rapidamente os cérebros, congelar imediatamente em gelo seco, e armazenar a -80 ° C em um tubo de 50 ml ou prosseguir imediatamente para incorporar em OCT para seccionamento congelado. </li></ol> 2. Corte e coloração do cérebro de ratos <ol><li> O tecido do cérebro que não é utilizado imediatamente pode ser mantido à temperatura de -80 ° C, durante até um mês, se mantidas a uma temperatura constante. Cérebros que são congelados a -80 ° C, depois descongelado a 20 ° C durante o corte, e em seguida, re-congeladas não produzem RNA de qualidade após a descongelação segundo. Uma vez que o cérebro é descongelado, montado em OCT e seccionadas, as lâminas devem ser coradas dentro de 24 horas e usados ​​para a LCM dentro de 30 minutos a uma hora de coloração. Isto irá assegurar RNA de boa qualidade. Seguindo LCM, as células capturadas no LCM tampas podem ser armazenados em tampão de lise a -80 ° C durante até uma semana, mas ARN deve ser isolado de uma forma atempada, para garantir a melhor qualidade. &lt;/ Li&gt; <li> Antes do corte do cérebro, limpe o criostato com RNase-Zap e limpar os pincéis com EtOH (substitua a lâmina descartável entre cada cérebro). </li><li> Recuperar o cérebro no tubo de 50 ml a partir do congelador -80 ° C; colocá-lo no criostato a uma temperatura de -22 ° C e descongelamento no tubo durante cerca de 10 min. Remover o cérebro do tubo e local para o palco em gaze, lado ventral para cima. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, a fatia de cérebro para remover a porção posterior do cérebro apenas rostral do cerebelo e da porção anterior no quiasma. Encha uma cryomold com outubro meio de montagem (Tissue Tek), e colocar o cérebro para o molde com o lado anterior para baixo. Permitir que o tecido cerebral de congelar no meio de montagem até que fique branco (aproximadamente 10 min). </li><li> Congele a amostra de disco (Tissue Tek) no cérebro com outubro Remover o cérebro do molde. Insira o cérebro na cabeça do espécime e aperte os parafusos. </li><li> Insira um Disposavel, lâmina de perfil baixo (Fisher Scientific) no porta faca e apertar a alavanca para baixo. </li><li> Começar a cortar o cérebro menos de 20 um para remover a camada exterior de outubro Uma vez que a região do hipocampo é atingido, coloque o disco a 10 mícron. Colete cortes seriados coronais, colocando uma placa de vidro ou de vidro deslizante mais para a secção de tecido (Fisher Scientific). As lâminas são conservados a -20 ° C em um suporte de coloração RNase até seccionamento é completa. </li><li> Para remover todas as RNases de vidro onde as seções de tecido são processados, limpe todos os recipientes de coloração e cilindros graduados com Eliminase (Fisher Scientific) e enxaguar em água Milli Q. Preparar todas as soluções com RNase isento de água e filtrar a violeta de cresilo (Sigma-Aldrich) e Fluoro-Jade (Histo-chem) mancha com um filtro de 0,2 um antes da utilização. </li><li> Descongelar secções do cérebro, à RT durante 30 seg e fixar em 75% ETOH (1 min). </li><li> Para LCM de neurónios individuais lesados ​​de fixação, lavar as lâminas em água isenta de RNase (1 min), Contracoloração com 1% de violeta de cresilo (15-20 seg), lavar em água isenta de RNase (2 x 30 s), a mancha com Fluoro-Jade (4 min), lavar em água isenta de RNase (3 x 1 min), desidratar com ETOH a 95% feito de água isenta de RNase (30 seg), 100% de ETOH (30 seg), e xileno (2 x 3 min). </li><li> Para LCM de faixas de neurónios após a fixação, lavar as lâminas em água isenta de RNase (1 min), com 1% de mancha violeta de cresilo (1 min), lavar em água isenta de RNase para (3 x 1 min), com 95% de desidratar ETOH (2 x 30 s), ETOH a 100% (2 x 30 segundos), e xileno (2 x 3 min). </li><li> Ar seco em todas as seções um exaustor por 15 min antes da LCM. Slides podem ser armazenados os lados, seção-se, em uma caixa de lâminas revestidas com dessecante, se eles precisam ser transferidos de sala em sala. No entanto, os melhores resultados são obtidos se LCM é realizada imediatamente após cortes são secos. LCM deve ser limitado entre 30 minutos e 1 hora. Na seção seguinte, descrevemos primeiro como capturar trechos contínuos de células, o que é eaSIEST de dominar para aqueles que estão aprendendo esta técnica. Em seguida, descrevemos como precisamente captar neurônios individuais. No nosso processo, identificamos neurónios moribundos por sua afinidade para Fluoro Jade-um marcador de neurónios em degeneração. Células Fluoro-Jade-negativos se presume estar sobrevivendo neurônios. </li></ol> 3. Laser Microdissecção Captura (LCM) LCM de faixas de populações enriquecidas de neurônios do hipocampo <ol><li> LCM é realizada usando um microscópio PixCell IIe com um laser de diodo infravermelho (Life Technologies). </li><li> Ajuste o joystick centro para a posição vertical. Gire e bloquear o objetivo 4X na posição. </li><li> Coloque um slide no centro da platina do microscópio e ajustar manualmente até que a região do hipocampo está em vista. Use os ajustes de foco grosso e fino para trazer a imagem em foco. </li><li> Activar o mandril de vácuo pressionando o botão de vácuo no controlador. Gire e bloquear a objetiva de 10X em place. Concentre-se novamente com ajustes grosso e fino. </li><li> Carregar o CapSure Macro LCM tampas (Life Technologies) para o módulo de cassete CapSure e a posição de um tampão na posição da linha de carga. Gire o braço Colocação Cap e posição ao redor da tampa. Elevar o braço de posicionamento Cap para remover a tampa do módulo CapSure cassete. </li><li> Gire o braço Colocação Cap sobre a lâmina e abaixar o braço para baixo sobre o slide, o que irá colocar a tampa no slide. Ajuste o foco fino e mova o joystick para verificar se as células estão dentro do círculo preto na tampa. Todas as capturas células devem estar dentro deste círculo preto. </li><li> Defina os parâmetros do laser. Primeiro, pressione o botão do laser habilitar no controlador. O local alvo laser será visível como um ponto-de-rosa no campo de visão do monitor do computador. </li><li> Definir o tamanho do ponto de laser de pequenos (7,5 mm) para focar o laser e ajustar a potência e duração de 65-75 mW, para 1,0-2,0 msec, conforme necessário para a captação celular óptimo. </li><li> Para teª a laser, utilize o joystick para mover o ponto de laser para uma área onde não existem células para pegar. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. Use o joystick para mover o ponto de laser de distância do local polímero fundido e verificar para ver se um anel visível escuro circunda uma área livre onde o laser foi disparado. </li><li> Para capturar as células, utilize o joystick para mover o ponto de laser sobre a área das células de capturar. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. Mover o joystick quando disparar o laser para capturar uma grande área de células. Quando o laser é disparado derrete a película de polímero termoplástico sobre a tampa para a superfície das células alvo. O polímero absorve a radiação laser, o que não altera o RNA do DNA, ou proteína assegurar a integridade da amostra para futuras aplicações moleculares. </li><li> Depois de disparar todas as células de interesse, levantar o braço Colocação Cap. As células capturadas irá separar-se da secção de tecido e adere à tampa CapSure. O tecido remanescente e células ausentes serão visvel no campo de visão. As células da tampa também pode ser visto através da colocação da tampa sobre uma parte vazia do slide. </li><li> Levante o braço Colocação Cap e girá-lo para o Cap Unload Station. Abaixe a tampa na estação e girar o braço Colocação Cap de volta à sua posição anterior. </li><li> Deslize a ferramenta de inserção CapSure ao longo da plataforma e no tampão. Levantar a ferramenta a partir da plataforma. A tampa permanecerá ligado. Tocar levemente a tampa para a almofada CapSure limpo para limpar o tecido indesejado. </li><li> Colocar a tampa no tubo de 0,5 ml de RNase livre preenchido com 100 ul de tampão de lise obtido a partir do kit de isolamento Micro-RNAqueous. Imediatamente a tampa de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e congelamento a -80 ° C até que o isolamento de ARN. </li></ol> LCM de um único FJ + neurônios no hipocampo <ol start="15"><li> Para capturar células individuais, coloque CapSure HS LCM tampas no módulo cassete CapSure e positisobre uma tampa na posição da linha de carga. Gire o braço Colocação Cap e posicioná-lo em volta da tampa. Elevar o braço de posicionamento Cap para remover a tampa do módulo CapSure cassete. </li><li> Definir o tamanho do ponto de laser de pequenos (7,5 mm) para focar o laser e ajustar a potência do laser e da duração de 65 mW para -75 0,45-0,50 msec para captura celular óptimo de células individuais. </li><li> Gire o braço Colocação Cap sobre a lâmina e abaixar o braço em direção ao slide. Isto irá colocar a tampa no slide. O Capsure HS superfície tampa senta elevada da amostra durante LCM. </li><li> Use o joystick para mover o laser mais simples FJ + células. Todas as células sendo capturados deve estar dentro do pequeno anel preto na tampa. Disparar o laser utilizando o botão do polegar. </li><li> Quando todas as células dentro da área do círculo preto foram disparados com o laser, levante o braço Colocação Cap. As células capturadas irá separar-se da secção de tecido e adere ao HS CapSure cap. </li><li> Coloque outro slide no microslidar fase e recolher FJ + células até que a tampa HS está cheio. Colocar a tampa no tubo de 0,5 ml de RNase livre preenchido com 40-50 ul de tampão de lise. Imediatamente a tampa de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e congelamento a -80 ° C até que o isolamento de ARN. </li></ol> 4. Isolamento de RNA total a partir de amostras de LCM (Esta secção será apenas descrito na apresentação de vídeo) <ol><li> O RNA total de células é isolado utilizando o Kit de RNAqueous-Micro (Ambion), seguindo os protocolos do fabricante. Todos os reagentes e soluções de lavagem são fornecidos no kit. Pré-molhado o micro filtro conjunto de cartucho por adição de 30 ul de tampão de solução de lise para o filtro. Após 5 minutos, centrifugar o filtro durante 30 segundos a 10.000 x g. </li><li> Adiciona-se 3 uL de aditivo LCM ao lisado de amostra, pipeta para misturar e centrifugar. </li><li> Adicionar 52 ul de EtOH a 100% (1/2 volume) ao lisado de amostra; pipeta para misturar e transferir o lisado para o filtrocoluna. </li><li> Centrifugar a coluna de filtro a 10.000 × g durante 1 minuto para se ligar ao ARN para a coluna. Se existirem vários tampões para uma amostra, girar cada ligado através da mesma coluna separadamente. </li><li> Completar o processo de isolamento de ARN, tal como descrito no kit de RNAqueous Micro. </li><li> Realizar um tratamento com DNase e DNase inactivação das amostras de LCM de ARN, tal como descrito no kit, transferir os ARN a um tubo de RNase e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 5. RNA Quantificação e aplicações a jusante Avaliação da qualidade do RNA e quantificação é realizada com um Agilent Bioanalyzer utilizando os reagentes do kit de Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) seguindo o protocolo do fabricante. <ol><li> O RNA total é analisado num Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies). O software avalia a concentração e a integridade da amostra de ARN através da atribuição de um número de integridade do RNA (NIR) para cada f amostra variandorom 1 a 10. 1-5 indica RNA degradado e 7-10 indica RNA de boa qualidade. </li><li> Não degradados RNA intactas será usado para o Real-Time PCR; ensaios individuais Taqman ou RT2 matrizes de perfil utilizando Sybr-química verde. O ARN também pode ser utilizado para a análise de mRNA e análise microarray microarray microRNA. </li></ol>

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Os autores declaram não ter nenhum conflito de interesse.

Esta técnica LCM nos permitiu fazer avanços significativos na compreensão dos mecanismos moleculares de TCE. 8,10,11,12,13 Fomos os primeiros a utilizar esta técnica para demonstrar que as sub-regiões distintas do hipocampo de ratos têm perfis de expressão de genes que correlacionam-se com a sua vulnerabilidade selectiva de lesões. Nossos estudos mostraram que podemos quantificar a expressão de genes, por qPCR, de apenas 10 células de laser capturados e que poderíamos realizar genoma análise de microarranjo de tão poucos como 600 células capturadas. LCM seria uma ferramenta útil em estudos semelhantes de outras regiões do cérebro que se sabe estarem implicados em diversos distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos. Por exemplo, estudos utilizando LCM lançaram luz na patogênese da doença de Parkinson em neurônios dopaminérgicos da substância negra, 14 e ajudado estudos do genoma de perfil de núcleo accumbens, que está envolvida em circuitos de recompensa implicados no substance desordens de abuso. 15 Heterogeneidade neuronal é reflectida ao nível do genoma e 16 podem contribuir para a falta de sucesso dos tratamentos experimentais para o TCE em ensaios clínicos. Assim, o nosso objetivo é utilizar essa técnica para investigar os elementos críticos que influenciam a sobrevivência neuronal após o TCE. O nosso estudo profiling recente do genoma de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo após TBI sugerido que um reostato celular que reflecte a proporção dos níveis de expressão de genes para a sobrevivência das células de morte celular regula o destino da célula após TBI. Estes estudos em curso vai contribuir para a concepção e desenvolvimento de estratégias farmacoterapêuticas que podem influenciar positivamente o reostato sobrevivência celular. Além disso, usamos atualmente LCM para rastrear e monitorar os efeitos de potenciais tratamentos com drogas terapêuticas em neurônios do hipocampo após TCE. Assim, nossos estudos demonstram que dadas cuidadosas técnicas de RNase de manipulação e algunsmodificações dos protocolos existentes, é possível a obtenção de amostras de ARN de alta qualidade a partir de LCM para análise quantitativa de expressão génica precisas. No entanto, existem algumas armadilhas associados a técnicas de LCM. Por exemplo, a recolha de apenas células neuronais sem qualquer contaminação microglia pode ser quase impossível. Na camada de células piramidais do hipocampo foi estimado que 95% das células são neurónios, com 90% desta população de células piramidais ser e interneurônios 10%, deixando uma pequena percentagem de tipos de células da glia e outros. 8,17, 18 Em nossos estudos, utilizamos Fluoro-jade um corante fluorescente que, especificamente, somente etiquetas neurônios lesados ​​no tecido cerebral. Uma mancha diferente que é um marcador para a GFAP seria necessária para corar microglia 19. Recolha apenas as Fluoro-jade coradas individuais corpos neuronais assegura uma população mais homogénea de neurónios. Outro problema comum que pode exigir a resolução de problemas é um círculo que hát definido quando o laser é disparado. Se isto ocorre, é necessário controlar os ajustes do laser e ajustar a potência e duração, conforme necessário. Também é importante para garantir que a tampa é colocada sobre o tecido liso e assentado corretamente no braço. Consultando o manual da LCM técnico ou ligar para o suporte técnico, por vezes, ser necessário. Seguindo LCM e isolamento de ARN, a qualidade do RNA devem sempre ser avaliada utilizando um Bioanalyzer antes de qualquer análise da expressão do gene. Existem vários tipos de instrumentos de captura a laser atualmente no mercado, incluindo o corte a laser (Life Technologies, Leica Microsystems) e laser catapultando (Zeiss) instrumentos. O nosso sistema LCM funciona bem para a captura de pequenos números de células. Outros sistemas de alto rendimento e mais automatizado pode ser mais adequada para a obtenção de um maior número de células para a análise genómica e proteómica particularmente. Na verdade, LCM usando esses sistemas automatizados tem um grande potencial para a análise de protein expressão em células identificadas ou populações enriquecidas de células. 20 Além disso, LCM podem facilitar a análise de expressão de genes de células immunolabeled, 21, permitindo-nos a investigar a expressão de genes em tipos de células definidas independentemente da complexidade nos tecidos mais heterogéneos. Assim, LCM é uma excelente ferramenta para a ponta estudos moleculares de populações simples ou enriquecido de células.

A análise da expressão do gene de tecidos heterogéneos tem sido problemático,. Isto é particularmente verdadeiro no cérebro dos mamíferos, que possui cerca de 5.000 tipos de células diferentes de 4 Antes do desenvolvimento da microdissecação de captura laser (LCM), a técnica, os estudos genômicos dos efeitos da TBI in vivo foram baseadas na análise da expressão de genes de uma população mista de células cerebrais compreendidos, não só de diferentes tipos de células neuronais, mas também de células gliais de apoio e imunomoduladores. Os perfis de expressão resultantes complexos de genes obtidos a partir desses tecidos heterogéneos e os padrões frequentemente contraditórios de lesões induzidas por sinais celulares, pode ser uma explicação para a falha em ensaios clínicos humanos de estratégias terapêuticas mostrado eficaz em estudos pré-clínicos de TBI 5. Para se obter uma compreensão clara da lesão induzida pela expressão do gene em populações vulneráveis ​​de neurónios de rato a partir do quadrilpocampus, foi adotada a técnica de LCM, pela primeira vez por et al Emmert-Buck. 3 Posteriormente, modificado e aperfeiçoado esta técnica de microdissecção para captura eficiente de populações enriquecidas de neurônios e neurônios individuais para perfis mRNA usando quantitativa PCR em tempo real e análise de microarray . Para manter a integridade do mRNA em secções congeladas de tecido cerebral de análise genómica, modificamos protocolos existentes para a fixação, a coloração e captura rápida de neurónios de secções de cérebro de rato congelados. Para identificação e isolamento de feridos e moribundos neurônios do hipocampo, também otimizou a técnica de coloração Fluoro Jade-para LCM. Fluoro-Jade não faz distinção entre a morte celular por apoptose e necrose. Assim, todos os tipos de neurónios em degeneração pode ser detectada por esta mancha 6,7. Aqui, descrevemos o protocolo utilizado em nosso laboratório para obter piscinas de neurônios morrem ou sobrevivem, assim como trechos de enriquecido populatiComplementos de diferentes tipos de células neuronais (ou seja, CA1-CA3 neurônios para análise de expressão gênica após TCE). O procedimento para a lesão de percussão fluido cérebro realizado no nosso laboratório é descrito em detalhe em Shimamura et al., 8 e é muito semelhante ao protocolo de lesão de percussão lateral do fluido, em ratos publicadas em JoVE por Alder et al. 9 Uma vez que a técnica tem LCM mostrado ter um efeito mínimo ou nulo sobre a integridade do DNA, RNA e proteínas nos tecidos, esta é uma excelente ferramenta para a análise molecular da proteína e de tipos de células definidas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PixCell IIe Laser Capture Microscope</td>
 <td>Life Technologies (Arcturus)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAqueous Micro- Kit</td>
 <td>Life Technologies (Ambion)</td>
 <td>AM1931 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capsure LCM caps</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>LCM0211/LCM0214</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoro-Jade</td>
 <td>Histo-chem Inc.</td>
 <td>#1FJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cresyl Violet Acetate</td>
 <td>Sigma-aldrich</td>
 <td>C5042-10G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene (Histological grade)</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>X3P-1GAL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
 <td>UTMB pharmacy</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free barrier pipette tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)</a> 
 <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection The PALM family </a> 
 <a href="http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica DM6000 B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury

De longo prazo da deficiência cognitiva após TCE está associada com lesão induzida neurodegeneração na região do hipocampo, uma no lobo temporal medial, que é fundamental para a aprendizagem, memória e função executiva. 1,2 Daí nossos estudos se concentrar na análise de expressão gênica de neuronal específica populações em sub-regiões distintas do hipocampo. A técnica de captura de laser microdissecção (LCM), introduzido em 1996 por Emmert-Buck et al., 3 permitiu avanços significativos em análises de expressão de genes de células individuais e as populações de células enriquecidas a partir de tecidos heterogéneos, como o cérebro dos mamíferos que contém milhares de tipos de células funcionais. 4 Usamos LCM e um modelo de rato bem estabelecido de lesão cerebral traumática (TCE) para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à patogênese do TCE. Seguindo fluido percussão-TBI, os cérebros são removidos em tempos pré-determinados após a lesão, imediatamente congeladas em gelo seco,e preparados para seccionamento num criostato. Os cérebros de rato pode ser incorporado em OCT e seccionados imediatamente ou armazenados durante vários meses à temperatura de -80 ° C, antes de seccionamento por microdissecção captura laser. Adicionalmente, nós utilizamos LCM para estudar os efeitos do TCE sobre os ritmos circadianos. Para isso, vamos capturar os neurônios do núcleo supraquiasmático que contêm o relógio mestre do cérebro de mamíferos. Aqui, demonstramos a utilização de LCM para obter neurónios individuais identificados (lesionado e degeneração, Fluoro-Jade-positivo, ou não lesionado, Fluoro-Jade-negativa) e as populações enriquecidas de neurónios do hipocampo para subsequente análise da expressão do gene por PCR em tempo real e / ou todo genoma microarrays. Estes estudos LCM habilitados têm revelado que a vulnerabilidade selectiva de regiões anatomicamente distintos do hipocampo do rato são reflectidos nos perfis de expressão de genes diferentes de diferentes populações de neurónios obtidos por LCM destas regiões distintas. Os resultados dos nossos estudos de célula única, quandoComparando os perfis de transcrição de morrer e adjacente sobrevivente neurónios do hipocampo, sugerindo a existência de um reostato sobrevivência da célula que regula a morte celular e sobrevivência após TBI.

Em nosso estudo LCM primeiro, fomos capazes de mostrar que as sub-regiões funcionalmente distintas (CA1 e CA3) do hipocampo de ratos têm perfis de expressão gênica que refletem a sua vulnerabilidade ao TCE. Figura 8 1A-1C mostra captura a laser de neurônios piramidais do hipocampo (CA1- CA3), os neurônios giro dentado e neurônios SCN antes, e após LCM. Limpas de captura piramidal grânulo, ou neurónios do NSQ, respectivamente, são mostrados nas tampas de macro. Figura 2A-2B ilustra a morrer, Fluoro-Jade positivos neurónios piramidais e sobreviver, Fluoro-Jade negativos neurónios piramidais antes e depois LCM. A captura limpa do morrer ou sobreviver neurônios é mostrado exibindo as células capturadas nas tampas LCM. Depois de LCM, o RNA total pode ser utilizado para uma gama diversificada de estudos moleculares, incluindo a análise quantitativa por PCR em tempo real da expressão génica utilizando TaqMan ou químicas de SYBR Green (Figura 3A), pequeno focused matrizes de PCR com sondas de SYBR Green (Figura 3B) ou de estudos de genomas inteiros de microarranjos (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figura 1. Laser microdissecção captura de trechos de populações de células definidas a partir do cérebro do rato. Congelados 10 secções coronais uM do cérebro do rato são fixadas em etanol, coradas com um (violeta de cresilo) mancha Nissl e preparados para LCM. São mostradas fotografias de hipocampo de rato e no núcleo supraquiasmático, antes e depois de os neurónios e as células LCM capturados como visualizado nas tampas de macro. A. piramidais de os subcampos CA1-CA3 do hipocampo de rato. Células granulares no giro B. hipocampo denteado. C. Bilateral núcleos supraquiasmáticos localizados em cada lado do terceiro ventrículoe localizada acima do quiasma óptico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figura 2. Laser microdissecção captura de neurônios do hipocampo de ratos. Mostrado são A. degenerando, Fluoro-Jade-positivos (com detalhes) CA3 do hipocampo neurônios e B. sobreviventes, Fluoro-Jade-negativo (sem manchas) CA3 neurônios antes e depois da LCM. Células capturados são visualizados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Análise de expressão gênica de RNA total isolado de neurônios a laser capturados. A. Dados quantitativos PCR em tempo real de expressão circadiano relógio gene em SCN. B. Heatmap da expressão gênica em morrer e sobreviver neurônios do hipocampo mostrando a expressão de genes relacionados com a apoptose, utilizando matrizes focados PCR . C. Agilent todo o genoma análise de microarray da expressão gênica em hipocampais CA1-CA3 neurônios de ratos que receberam ferimentos farsa, TBI ou TCE, além de um vírus recombinante siRNA adeno-associado projetado para knockdown expressão de genes induzidos por lesão cerebral (óxido nítrico neuronal sintase e glutationa peroxidase-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

laser-capture-microdissection-enriched-populations-neurons-or-single

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.1K visualizações.  University of Texas Medical Branch. Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.

Vídeo: Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy. 
Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell1. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies4,6 or in vitro experiments on neurogenesis3,7.
The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)11.
Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease4. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma12,13, a cochlear damage14 or in an animal models of Parkinson's disease15 or amnesia16.
In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

We describe here a method for biopsying olfactory mucosa from rat and human nasal cavities. These biopsies can be used for either identifying molecular anomalies in brain diseases or isolating multipotent adult stem cells that can be utilized for cell transplantation in animal models of brain trauma/disease.

Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.