This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

NOTA: Os experimentos foram realizados em conformidade com o Manual do canadense para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê da Université Laval Proteção Animal. Preparação 1. Amostra NOTA: Neste exemplo, usamos o cérebro do rato no dia pós-natal 1. <ol><li> Use anestesia hipotermia em gelo picado durante 3 a 4 minutos para crias, em seguida, dissecar cérebros tão rapidamente quanto possível, em meio L15 gelado. Execute esta etapa dentro de 2 min. </li><li> Transferência dissecado cérebros incorporação molde (cf. Lista de material) e encha com media tecido congelado incorporação tendo o cuidado de orientar a amostra na posição desejada. Congelar as amostras imediatamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Execute esta etapa dentro de 30 segundos. NOTA: As amostras podem ser armazenadas alguns meses, sem comprometer a qualidade do RNA. </li></ol> 2. Seccionamento <ol><li> Coa membrana Treatlâminas de vidro (ted cf. Lista de material) com solução RNAse superfície descontaminação para eliminar qualquer vestígio de RNAses. Lavar as lâminas em água DEPC e deixe-os secar. Alternativamente, as lâminas durante a noite cozer a 200 ° C. </li><li> Transferir as amostras congeladas em criostato previamente limpas com uma solução de superfície RNAse descontaminação. Defina a temperatura da câmara de criostato a -20 ° C e fatia amostras a 10 espessura mm. Recolha cortes de tecidos nas lâminas de membrana revestida e deixe-os secar 10 min antes da coloração. Alternativamente, desliza armazenamento a -80 ° C até à coloração. </li></ol> 3. Preparação de Soluções de Coloração <ol><li> Preparar todas as soluções imediatamente antes do início da experiência, e usar inibidor de RNAse em todas as soluções de coloração (excepto para as soluções de lavagem) para evitar a degradação de ARN. </li><li> Preparar a solução tampão. Utilizar o mesmo em todas as soluções tampão (composta de solução salina tamponada com fosfato isenta de RNase (PBS) suplementada com 1% de BSA,0,2% de triton e 2% de inibidor de RNAse). Para cada slide, preparar 400 ml de solução tampão (200 mL para o primário e 200 mL para os anticorpos secundários). </li><li> Preparar a solução fixadora: utilizar etanol a 70% conservado a -20 ° C. Mantenha procedimento fixação do tecido mínima para evitar uma redução drástica no rendimento de extração de RNA. NOTA: Como alternativa, usar uma solução de etanol 95% suplementado de ácido acético a 5% mantida à temperatura de -20 ° C. </li><li> Preparar a solução de anticorpo primário por diluição do anticorpo primário na solução tampão. Para neurônios dopaminérgicos rotulagem, use um anticorpo visando a tirosina hidroxilase (TH, enzima limitante para a produção de dopamina). Usar uma elevada concentração de anticorpo para compensar o tempo de incubação rápida. Use anticorpo TH a uma diluição de 1:25. NOTA: No protocolo de imunofluorescência normal, este anticorpo é um sinal forte quando incubadas durante a noite a uma diluição de 1: 1000. Neste protocolo, ele é usado mais 40X concentrated devido ao curto tempo de incubação. Devido à elevada concentração de anticorpo utilizada para este método, executar uma imunomarcação padrão em paralelo, a fim de verificar qualquer aumento da marcação não-específica. </li><li> Preparar a solução de anticorpo secundário através da diluição do anticorpo secundário na solução tampão. Usar um anticorpo secundário biotinilado numa concentração de 1: 100. NOTA: Neste exemplo, foi utilizado um anticorpo biotinilado anti-coelho. </li><li> Preparar a solução para a detecção de anticorpos secundários biotinilados complexo avidina-biotina (ABC). Adicione solução ABC pela adição do composto A e o composto B a uma concentração de 1: 100 diluído em DEPC PBS suplementado com 2% de inibidor de RNAse. Prepare a avidina-biotina complexo 30 min antes de adicionar os slides. </li></ol> 4. Coloração <ol><li> Descongelar uma ou duas lâminas no momento de -80 ° C por um movimento súbito los rapidamente no ar (ou usar um ventilador de ar). Seções surround com um hidrofóbicocaneta barreira e deixe secar por alguns segundos. <ol><li> Colocar as lâminas em solução de fixação a frio para não mais de 5 min a -20 ° C. Agite uma vez no ar para remover o excesso de solução de fixação, em seguida, rapidamente mergulhar as lâminas em DEPC PBS 6-8 vezes para a lavagem. </li><li> Flick os slides para remover o excesso de DEPC PBS. Certifique-se de que os slides descongelamento etapa não exceda 5 min. </li></ol></li><li> Colocar as lâminas em uma bandeja limpo (pré-tratado com uma solução de descontaminação da superfície de ARNase para eliminar qualquer vestígio de RNAses) e colocar a 200 ul de solução de anticorpo primário sobre cada lâmina (coelho anti-TH) durante 10 min à temperatura ambiente. Dip desliza rapidamente em DEPC PBS 3 vezes para lavar e agite as lâminas uma vez para remover o excesso de DEPC PBS. </li><li> Colocar 200 mL da solução de anticorpo secundário sobre cada lâmina, durante 6 minutos à temperatura ambiente. Dip desliza rapidamente três vezes em DEPC PBS para lavagem e agite as lâminas para remover o excesso de DEPC PBS. </li><li> Coloque 200 mL da solu ABCção em cada lâmina durante 4 minutos à temperatura ambiente. Dip desliza rapidamente em DEPC PBS 3 vezes para lavar e passar rapidamente os slides para remover o excesso de DEPC PBS. </li><li> Preparar a solução durante 4 minutos de incubação na solução ABC DAB (3,3 &#39;diaminobenzidina). Utilizar os reagentes fornecidos no kit (Kit DAB Peroxidase Substrate). Misturar 1 gota de tampão fornecido, 1 gota de solução de DAB e 1 gota de 30% de H 2 O 2 em 2,5 ml de água DEPC. Misture a solução por inversão. </li><li> Tome 196 ul da solução de DAB e adicionar 4 mL (2%) de solução de inibidor de RNAse apenas antes de se espalhar sobre as lâminas. Colocar as lâminas em uma bandeja limpa (pré-tratados com uma solução de descontaminação RNAse superfície) e colocar os 200 ml de solução de DAB em slides. Nota: A solução DAB deve reagir within1 ou 2 min. </li><li> Dip desliza rapidamente em DEPC PBS 3 vezes para lavar e colocar as lâminas durante alguns segundos em etanol absoluto. Seque as lâminas sacudindo-los no ar (ou usar um ventilador de ar). &lt;br /&gt; NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C para uso futuro ou processados ​​para LCM. </li></ol> Captura 5. Laser Microdissection <ol><li> Descongele os slides rapidamente sacudindo-los no ar (ou usar um ventilador de ar). Certifique-se de que os slides descongelamento etapa não exceda 5 min. </li><li> Prossiga para a LCM. Colocar a lâmina no microscópio com o lado da amostra de frente para a tampa do tubo de coleta. Escolha o melhor de ampliação para a amostra. Ajuste o foco para ver as células de interesse. <ol><li> Definir a área de corte e começar a cortar com o laser. Recolhe células dissecadas ou pedaço de tecido na tampa do tubo de recolha cheio com 50 uL de tampão de lise (Kit de extracção de ARN). Certifique-se de que o passo de GCV não exceda 30 min. </li></ol></li><li> Extrato de RNA total a partir de células isoladas usando um kit de extração de RNA (cf. Lista de materiais). Seguir o protocolo do fabricante. <ol><li> Incubar as células recolhidas durante 30 min a 42 ° C alisar as células. Pré-condição a coluna de purificação de ARN por adição de 250 ul de tampão de condicionamento. Carga 50 ul de etanol a de células lisadas. Carregar os 100 ul de células lisadas numa coluna de purificação pré-condicionada. </li><li> Centrifuga-se a coluna a 16.000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lava-se a coluna duas vezes com tampão de lavagem. Eluir no volume mínimo recomendado (11 ul) de RNAse-livre de água (não tratada com DEPC, uma vez que podem interferir com o Bioanalyzer). Mantenha 2 ul a qualidade do teste. NOTA: Todas as soluções e reagentes são fornecidos no kit. </li></ol></li></ol> 6. Síntese de cDNA e por RT-PCR quantitativa <ol><li> Reverse-transcrever as amostras de ARN a partir de células dopaminérgicas a laser capturado em ADN complementar utilizando transcriptase reversa e o oligo (dT). Seguir o protocolo do fabricante (cf. Lista de material). </li><li> Use 1 ul de ADNc para amplificação de qRT-PCR com iniciadores específicos para o gene. Configure rea PCRCÇÕES em volume de 20 ul com uma mistura de reacção de arranque a quente de um componente para a PCR quantitativa, como recomendado pelo fabricante. Realizar cada reação em triplicado. <ol><li> Para as experiências aqui descritas, utilizar os seguintes pares de iniciadores: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC TGG AGA CTG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG GTT CCT TCC GTA ACC TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG CTC TGT-3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC-F (5&#39;CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / AADC-R (5&#39;GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG 3&#39;). </li></ol></li><li> Realizar quantitativo de amplificação por RT-PCR utilizando os seguintes parâmetros de ciclagem rápida: 95 ° C durante 5 min, seguido de 45 ciclos de 10 seg 95 ° C, 10 seg a 60 ° C e 10 seg a 72 ° C. Realizar análise de curva de fusão usando a configuração padrão do instrumento para determiformação de produto homogêneo ne. </li><li> Analisar os dados usando o software embutido. <ol><li> Normalizar os valores de genes marcadores da DA e Th AADC expressão com a expressão dos dois genes de referência GAPDH e Rpl13a para se obterem níveis de expressão relativa, conforme descrito anteriormente 14. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+methods+and+applications.">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li><li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+technology.">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection.">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li><li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository.">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li><li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR.">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li><li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons.">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938 (2013).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons:+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism.">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li><li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Endogenous+Serine/Threonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor,+G-Substrate,+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson's+Disease.">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li><li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Quantification+strategies+in+real-time.">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , (2004).</li><li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction).">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li><li>Podgorny&#301;, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+for+biology+and+medicine.">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li><li>Vandewoestyne, M., ewoestyne &amp; Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li><li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies:+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry.">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li><li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O ponto mais crítico deste método consiste na marcação das células de interesse, evitando a degradação do RNA. Como RNAses estão ativos em soluções aquosas, diminuindo os tempos de incubação melhora a conservação RNA 11,15. Todas as soluções utilizadas devem ser tratada com DEPC para inactivar ARNases. Todos os materiais e as superfícies devem ser tratados com uma solução de ARNase a descontaminação de superfície para evitar a contaminação ARNases. Finalmente, em estas condições, a a...

O cérebro é composto de uma grande variedade de diferentes tipos de neurónios, formando redes complexas. Esses neurônios são organizados em grupos e subgrupos distintos de acordo com a sua morfologia, conectividade e expressão gênica padrão 1. O desenvolvimento de microarrays, sequenciamento de próxima geração, e qRT-PCR oferecida a possibilidade de comparar os perfis de populações neuronais de expressão gênica em diferentes contextos biológicos 1,2. Estas análises sensíveis exigem a identificação precisa e isolamento de tipos de células de interesse, mantendo a integridade do RNA 2-4. De células (FACS) activada fluorescente técnica tem sido amplamente utilizada para isolar tipos específicos de células com base em marcadores da superfície celular e / ou morfologia. FACS requer um passo de dissociação de células antes da separação, o que resulta numa perda total de resolução espacial 5. Muitos subpopulações neuronais são distinguidas uma da outra de acordo com sua distribuição anatômica em the cérebro. Microdissection captura Laser aplicado em seções cerebrais finas oferece uma opção adequada para o isolamento específico de células com alta resolução espacial 6-8. Uma das principais limitações da LCM tem sido a necessidade de identificar as células de interesse com base em critérios morfológicos ou repórteres fluorescentes em proteína geneticamente em modelos animais. O desenvolvimento de novas técnicas para realizar métodos de imunomarcação rápidas que preservaram a integridade de ARN, em combinação com LCM, agora permite o isolamento de subpopulações de células para continuar com as experiências de perfilação de genes. Esta abordagem foi realizada previamente e brevemente descrito em poucas publicações 1,9-13. Aqui, demonstramos um procedimento detalhado para a obtenção de RNA de alta qualidade a partir de um subconjunto específico de células de uma estrutura de tecido complexo pela combinação rápida de imunomarcação com GCV. Mostramos como executar passos fundamentais essenciais para obter a recuperação RNA máxima e evitar a degradação do RNA, pois pode sigcativamente gene impacto perfil de expressão. Para a demonstração deste protocolo, os neurônios dopaminérgicos de um dia de idade, mesencéfalo rato foram alvejados. Neurónios dopaminérgicos pode ser immunolabeled utilizando um anticorpo dirigido contra a tirosina hidroxilase (TH), a enzima limitante da velocidade para a síntese de dopamina. Após imunocoloração TH, individuais ou grupos de neurónios dopaminérgicos pode, então, ser isolado usando LCM. Microdissecadas células são recolhidos no tampão de lise, e o ARN é extraído usando um kit de isolamento de ARN. Qualidade e quantidade do RNA extraído são medidos usando um Bioanalyzer 5. Uma análise mais aprofundada da expressão gênica usando: RNA seqüenciamento, microarray, ou qRT-PCR pode, posteriormente, ser realizada 2,4,6. Como um exemplo, um de dois passos de qRT-PCR é demonstrado nos domínios de laser capturado isolado dopaminérgicos. A quantificação relativa dos níveis de genes marcadores neurônio dois dopaminérgicos expressão ilustra a seletividade deste protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

Captura laser microdissecação (LCM) permite o isolamento de células específicas a partir de secções de tecido fino com uma elevada resolução espacial. LCM eficaz requer a identificação precisa das células as subpopulações de um tecido heterogêneo. Identificação de células de interesse para LCM é geralmente baseada em critérios morfológicos ou em repórteres proteína fluorescente. A combinação de LCM e imunomarcação rápida oferece um meio alternativo e eficientes para visualizar tipos específicos de células e para isolá-los do tecido circundante. ARN de elevada qualidade pode então ser extraído a partir de uma população de células pura e adicionalmente processados ​​para aplicações a jusante, incluindo a sequenciação de ARN, ou de microarray de qRT-PCR. Esta abordagem foi realizada previamente e brevemente descrito em poucas publicações. O objetivo deste artigo é ilustrar como realizar imunomarcação rápida de uma população de células, mantendo a integridade do RNA, e como isolar essas células específicas usando LCM. Nisto, nós ilustrard este processo multi-passo por imunomarcação e captura das células dopaminérgicas em tecido cerebral de ratos de um dia de idade. Destacamos etapas críticas fundamentais que merecem uma atenção especial. Este protocolo pode ser adaptado a uma variedade de tecidos e células de interesse. Pesquisadores de diferentes áreas provavelmente serão beneficiados com a demonstração desta abordagem.

Este procedimento permite a rápida visualização de imunomarcação de células de interesse, mantendo a integridade de ARN. A Figura 1 ilustra os passos da preparação do tecido antes da extracção do ARN. Após cryosectioning, neurónios dopaminérgicos são etiquetados usando um anticorpo dirigido contra a tirosina hidroxilase (neurónios marcados aparecer em castanho). Dependendo da causa experimental, células individuais ou maior região de interesse pode ser isolado utilizando LCM (Fi...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection.

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K visualizações.  Université Laval.  Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection. 

Vídeo: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biologia

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Extração de RNA a partir de células Neuroprecursor Usando o Bio-Rad Total de RNA Kit

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Transcrição in vitro e nivelamento de Gaussia mRNA luciferase Seguido por HeLa transfecção celular

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

O Utilitário de Estágio específico-Mid-de-final<em&gt; Drosophila</em&gt; Folículo Isolamento

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Um protocolo da microdissecção da captação do laser que rende o RNA da alta qualidade dos ossos frescos-congelados do rato

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...