Esta abordagem guiada por linhagens permite a análise proteômica de eventos importantes do desenvolvimento com resolução espacial e temporal dentro do embrião vertebrado, transmitindo informações que não seriam acessíveis através de medidas embrionárias inteiras. Esta abordagem pode ser prontamente estendida para estudar proteínas, metabólitos e transcritos de diferentes células embrionárias à medida que se diferenciam durante o desenvolvimento. Este método pode avançar nossa compreensão dos mecanismos moleculares que controlam o desenvolvimento normal e da doença, incluindo mecanismos de indução tecidual e comprometimento do destino celular durante o desenvolvimento inicial.
Use um laço de cabelo para guiar cada embrião em um poço e posicione-os suavemente de modo que a célula-alvo de interesse esteja no ângulo certo com a microagulha. Siga os mapas de destino do tecido xenopus laevis para identificar a célula precursora da linhagem de interesse. Use duas pinças afiadas para remover suavemente a membrana vitelínica ao redor do embrião.
Isolar as células isoladas do embrião por dissecção manual com pinças. Comece por configurar a agulha de injeção que contém a solução traçadora de linhagem. Monte a agulha de microinjeção em um suporte de micropipeta controlado por um micromanipulador multieixo.
Conecte o suporte da micropipeta a um microinjetor e encha a agulha com o traçador de linhagem aplicando pressão negativa. Calibrar a agulha e ajustar o tamanho da ponta da agulha e o tempo de injeção para fornecer aproximadamente um nanolitro da solução traçadora de linhagem medida em óleo mineral. Certifique-se de que o tamanho da gota que está sendo injetada seja preciso e ajuste as configurações do injetor, se necessário.
Inundar a placa de argila de microinjeção com uma solução de 3%fCAL e transferir aproximadamente 10 embriões para a placa de argila usando uma pipeta de transferência. Injetar nas células de interesse aproximadamente um nanolitro do dextran fluorescente ou 200 picogramas de mRNA GFP. Usando um microscópio estéreo, confirme o sucesso da marcação celular.
Certifique-se de que apenas a célula pretendida é injetada. Descartar embriões contendo células lesionadas ou rotuladas incorretamente seguindo políticas institucionais. Transferir os embriões injetados para uma placa de Petri contendo solução de Steinberg 0,5x.
Cultivá-los entre 14 a 25 graus Celsius até atingirem o estágio de desenvolvimento desejado. Transferir de três a cinco embriões para uma placa de ágar contendo solução de Steinberg 0,2x para microdissecções. Use fórceps para dissecar o clone marcado do embrião.
Coletar o tecido dissecado com pipeta de 0,5 a 10 microlitros e depositá-lo em uma lima de microcentrífuga. Usando uma pipeta, aspirar o meio ao redor do tecido coletado para limitar os sais na amostra para evitar interferência na análise da EMAR. Congelar imediatamente as células isoladas, colocando o frasco para injetáveis da amostra em gelo seco ou azoto líquido.
Conservar as amostras a menos 80 graus Celsius até à análise por espectrometria de massas. Para o processamento de amostra de célula única por CE, desnature as proteínas aquecendo a amostra a 60 graus Celsius por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, equilibre a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos e adicione tripsina às amostras para digestão.
Para análise por NanoLC, lisar até cinco tecidos dissecados em 50 microlitros de tampão de lise. Facilite o processo pipetando a amostra para cima e para baixo. Para processar os tecidos dissecados, incubar o lisado a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, pellet os restos celulares e plaquetas gema a quatro graus Celsius por centrificação a 4.500 RCF. Transfira o sobrenadante para um frasco de microcentrífuga limpo e adicione 10% SDS para obter uma concentração final de 1% SDS no lisado. Para os tecidos, adicionar 0,5 molar ditiotreitol ao lisado para obter uma concentração final de aproximadamente 25 milimolares.
Em seguida, incube o lisado por 30 minutos a 60 graus Celsius para reduzir quimicamente as ligações dissulfeto nas proteínas. Adicionar iodoacetamida 0,5 molar para obter a concentração final de aproximadamente 75 milimolares no lisado e incubar a mistura por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Adicionar ditiotreitol 0,5 molar igual ao volume inicial para extinguir os reagentes remanescentes da reação de alquilação.
Precipitar proteínas em acetona durante a noite como descrito no protocolo de texto e reconstituir em bicarbonato de amônio 0,5 molar. Adicione tripsina para digestão da amostra e incube os frascos para injetáveis a 37 graus Celsius. Para separar os peptídeos usando CE, reconstitua a proteína digerida em um a dois microlitros do solvente da amostra.
Vórtice a amostra mista e a centrifusão a 10.000 RCF por dois minutos a quatro graus Celsius para detritos de células pelletizadas. Inicialize o instrumento CE-ESI lavando o capilar CE com o BGE. Coloque um microlitro de amostra no frasco para injetáveis da amostra e injete de um a 10 nanolitros da amostra no capilar de separação CE por injeção hidrodinâmica.
Transfira a extremidade de entrada do capilar de separação CE para o BGE. Inicie a separação eletroforética aumentando gradualmente a tensão de separação CE do aterramento. Potenciais de 20 a 28 quilovolts com corrente abaixo de 10 microamperes garantem desempenho instrumental estável e reprodutível para análise.
Para separar usando Nano LC, ressuspenda a amostra de peptídeo na fase móvel A.A concentração e o volume de injeção da amostra dependem do sistema e da coluna LC disponíveis. Transfira a amostra para um frasco para injetáveis LC. Carregue aproximadamente 200 nanogramas a dois microgramas de amostra de peptídeo na coluna analítica C18 e separe os peptídeos a uma taxa de fluxo de 300 nanolitros por minuto usando eluição de gradiente conforme descrito no manuscrito do texto.
Usando uma câmera, verifique o fluxo de líquido através do emissor de eletrospray e inspecione visualmente a configuração em busca de possíveis vazamentos. Adquirir eventos de espectrometria de massa e sequenciar os peptídeos conforme descrito no manuscrito do texto. Diferenças na translação gênica foram detectadas entre células D11 dissecadas de diferentes embriões usando CE-ESI-HRMS.
Clones de células dissecadas marcados com linhagem foram analisados por LC-HRMS. A análise da via das proteínas mostrou upregulated da tradução proteica e do metabolismo energético no organizador de Spemann com o neuroectoderma. O neuroectoderma prodeum foi enriquecido em proteínas associadas ao transporte nuclear de carga proteica na célula, provavelmente indicando eventos a jusante após sinalização.
A análise de enriquecimento das funções moleculares indicou upregulation na iniciação da tradução, ligação do RNA e ligação do complexo proteassoma, sugerindo um papel para o turnover dinâmico de proteínas desenvolvendo o organizador de Spemann. Selecionar apenas embriões estereotipados para este protocolo para melhorar a reprodutibilidade e interpretação dos resultados. O tecido dissecado deve ser transferido para um frasco para injetáveis e imediatamente congelado contendo o mínimo possível de tampão de meio para minimizar a contaminação por sais tampão.
Esta abordagem nos permitiu estudar a dinâmica de proteínas em células identificadas e linhagens celulares em embriões vivos. As novas informações que obtivemos sobre a produção espaço-temporal de proteínas importantes em tecidos em desenvolvimento nos permitiram projetar experimentos direcionados para avaliar sua função biológica.
