Os autores agradecem ao Dr. Thomas Rademacher por fornecer o ppam planta vetor de expressão e Ibrahim Al Amedi para cultivar as plantas de tabaco utilizados neste estudo. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Richard M. Twyman por sua ajuda com a edição do manuscrito. Este trabalho foi em parte financiado pelo Conselho Europeu de Investigação Avançada Grant &quot;Future-Pharma&quot;, número da proposta 269110 eo Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer Fundação Futuro).

<ol>
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A taxa de publicação foi parcialmente patrocinado pelas empresas Statease, Inc. (EUA) e Statcon (Alemanha), que não estavam envolvidos no envolvidos na preparação do manuscrito ou responsáveis ​​por qualquer dos seus conteúdos.

Cada experimento requer um planejamento cuidadoso, porque os recursos são muitas vezes escasso e caro. Isto é particularmente verdadeiro para as estratégias DoE porque erros durante a fase de planejamento (por exemplo, a seleção de um modelo de base que não cobre todas as interações fator significativo) pode diminuir substancialmente a capacidade de previsão dos modelos resultantes e, assim, desvalorizar todo o experimento. No entanto, esses erros podem ser facilmente evitado, seguindo procedimentos b?...

A produção de proteínas biofarmacêutica em plantas é vantajoso porque as plantas são baratos a crescer, a plataforma pode ser aumentado apenas por crescimento mais plantas, e os agentes patogénicos humanos são incapazes de se replicar de 1,2. Estratégias de expressão transitória por exemplo com base na infiltração das folhas com Agrobacterium tumefaciens proporciona benefícios adicionais, porque o tempo entre o ponto de libertação de ADN e a entrega de um produto purificado é reduzida de anos a menos do que 2 meses 3. A expressão transiente é também utilizado para a análise funcional, por exemplo, para testar os genes para a sua capacidade para complementar os mutantes de perda de função ou para investigar interacções proteína 4-6. No entanto, os níveis de expressão transiente tendem a mostrar maior variação de lote para lote do que os níveis de expressão em plantas transgénicas 7-9. Isto reduz a probabilidade de que os processos de fabricação de produtos biofarmacêuticos com base na expressão transitória wivai ser aprovada no contexto de boas práticas de fabricação (BPF), pois a reprodutibilidade é um atributo essencial de qualidade e está sujeita a avaliação de risco 10. Essa variação também pode mascarar qualquer interação que os pesquisadores pretendem investigar. Por isso, nos propusemos a identificar os principais fatores que afetam os níveis de expressão transiente em plantas e para a construção de um modelo preditivo quantitativa de alta qualidade. O (OFAT) abordagem de um fator-em-um-tempo é muitas vezes usado para caracterizar o impacto (efeito) de certos parâmetros (fatores) sobre o resultado (resposta) de um experimento 11. Mas isso é sub-ótima, pois os testes individuais (executado) no decurso do inquérito (experimento) serão alinhados como pérolas em um colar com a área potencial gerado por fatores que são testados (espaço de projeto). A cobertura do espaço de projeto e, portanto, o grau de informações derivadas da experiência ébaixo, como mostrado na Figura 1A 12. Além disso, as interdependências entre as diferentes factores (interacções do factor) pode permanecer oculto, resultando em modelos pobres e / ou a previsão de falsa óptimos, como mostrado na Figura 1B 13. As desvantagens acima descritas podem ser evitados através da utilização de uma concepção de experiências (DOE) de aproximação na qual as pistas de uma experiência são dispersas mais uniformemente por todo o espaço de criação, o que significa que mais do que um factor é variada entre duas pistas 14. Há projetos especializados para misturas, fatores (fatoriais) ea quantificação dos impactos do fator sobre as respostas (métodos de superfície de resposta, RSM s) 15 de triagem. Além disso, RSMs pode ser realizado como projetos centro-composto, mas também pode ser conseguido, usando software especializado que pode aplicar diferentes critérios para a seleção de pistas. Por exemplo, o assim chamado D-optimalitcritério y irá selecionar corridas de modo a minimizar o erro nos coeficientes do modelo resultante, enquanto que o critério IV-optimality seleciona corridas que atingem o menor previsão de variação ao longo do espaço de design 15,16. O MSE descrito aqui permite a quantificação precisa da expressão da proteína transiente em plantas, mas que pode ser facilmente transferido para qualquer sistema envolvendo vários (~ 5-8) factores numéricos (por exemplo, temperatura, tempo, de concentração) e alguns (~ 2 - 4) fatores categóricas (por exemplo, promotor, cor), em que uma descrição mecanicista não está disponível ou demasiado complexas para modelar. A abordagem DoE origem nas ciências agrícolas, mas se espalhou para outras áreas porque é transferível para qualquer situação em que é útil para reduzir o número de execuções necessárias para a obtenção de dados confiáveis ​​e gerar modelos descritivos de processos complexos. Isto, por sua vez, levou-se à inclusão de corça no &quot;Orientação paraIndústria, Q8 (R2) Pharmaceutical Development &quot;, publicado pela Conferência Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) 17. DoE é agora amplamente utilizado na investigação científica e na indústria 18. Contudo, cuidados devem ser tomados durante o planejamento e execução do experimento, pois a seleção de um polinômio de grau impróprio para o modelo de regressão linear múltiplo (modelo básico) pode apresentar uma necessidade de corridas adicionais para modelar todos os efeitos do fator corretamente. Além disso, dados corrompidos ou perdidos gerar modelos incorretos e falho previsões, e pode até mesmo impedir qualquer tentativa de construção do modelo, conforme descrito nas seções de protocolo e discussão 18. Na seção de protocolo, que inicialmente irá definir as etapas de planejamento mais importantes para uma experiência baseada em RSM e, em seguida, explicar o design baseado no DoE DesignExpert v8.1 software. Mas projetos similares podem ser construídas com outros includi softwareng JMP, Modde e STATISTICA. Os procedimentos experimentais são seguidas por instruções para a análise de dados e avaliação. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1.jpg" /> Figura 1. Comparação de OFAT e DoE. Uma. Variação sequencial de um fator de cada vez (OFAT) em um experimento (círculos pretos, vermelhos e azuis) atinge uma baixa cobertura do espaço de projeto (regiões nascidos). Em contraste, a variação de mais do que um factor de cada vez utilizando o desenho de experiências de estratégia (DOE) (círculos verdes) aumenta a cobertura e, assim, a precisão dos modelos resultantes. B. A cobertura do espaço de projeto tendencioso significa que as experiências OFAT (círculos pretos) também pode deixar de identificar as regiões operacionais ótimas (vermelho) e prever soluções sub-ótimas (grande círculo preto), enquanto DoE estrategicamentees (estrelas negras) são mais propensos a identificar as condições preferíveis (grande estrela preta).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Design-Expert(R) 8</td>
			<td style="width:195px;">Stat-Ease, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:272px;">DoE software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tryptone</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">8952.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">2363.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">P029.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">K029.2</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Agar-Agar</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">5210.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Escherichia coli K12 DH5a</td>
			<td style="width:195px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">18263-012</td>
			<td>Microorganism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">pPAM</td>
			<td style="width:195px;">GenBank</td>
			<td style="width:119px;">AY027531</td>
			<td>Cloning/expression vector;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NucleoSpin Plasmid&#160;</td>
			<td style="width:195px;">MACHEREY-NAGEL GmbH</td>
			<td style="width:119px;">740588.250</td>
			<td>Plasmid DNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td style="width:195px;">MACHEREY-NAGEL GmbH</td>
			<td style="width:119px;">740609.250</td>
			<td>Plasmid DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NcoI</td>
			<td style="width:195px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">R3193L</td>
			<td>Restrictionendonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">EcoRI</td>
			<td style="width:195px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">R3101L</td>
			<td>Restrictionendonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">AscI</td>
			<td style="width:195px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">R0558L</td>
			<td>Restrictionendonuclease</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">NEB 4</td>
			<td style="width:195px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">B7004S</td>
			<td>Restrictionendonuclease buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TRIS</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">4855.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium tetraborate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">4403.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">EDTA</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">8040.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Agarose</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">6352.4</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">A512.1</td>
			<td>Color indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">A513.1</td>
			<td>Color indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Glycerol</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">7530.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Mini-Sub Cell GT Cell</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">170-4406</td>
			<td>Gel electrophoresis chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK</td>
			<td style="width:195px;">DSMZ</td>
			<td style="width:119px;">12365</td>
			<td>Microorganism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">4307000.658</td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Beef extract</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">X975.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Peptone</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">2365.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sucrose</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">4621.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">0261.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">6344.2</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">T832.3</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">4163.2</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FWD primer</td>
			<td style="width:195px;">Eurofins MWG Operon</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>CCT CAG GAA GAG CAA TAC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">REV primer</td>
			<td style="width:195px;">Eurofins MWG Operon</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>CCA AAG CGA GTA CAC AAC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2720 Thermal cycler</td>
			<td style="width:195px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4359659</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">RNAfold webserver</td>
			<td style="width:195px;">University of Vienna</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:195px;">Kammlott</td>
			<td style="width:119px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:195px;">Grodan</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:195px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Phytotron</td>
			<td style="width:195px;">Ilka Zell</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Omnifix-F Solo</td>
			<td style="width:195px;">B. Braun</td>
			<td style="width:119px;">6064204</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Murashige and Skoog salts</td>
			<td style="width:195px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">M 0222.0010</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Glucose</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">6780.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td>Phytohormon analogon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">&#160;BioPhotometer plus</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">&#160;6132 000.008</td>
			<td>Photometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:195px;">Osram</td>
			<td style="width:119px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">&#160;4984.3&#160;</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424 000.410</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Synergy HT</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SIAFRT</td>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Protein A</td>
			<td style="width:195px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10-1006</td>
			<td>Antibody binding protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9105.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9127.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2G12 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Polymun</td>
			<td style="width:119px;">AB002</td>
			<td>Reference antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study

As plantas fornecem benefícios múltiplos para a produção de biofármacos incluindo os custos baixos, escalabilidade e segurança. A expressão transiente oferece a vantagem adicional de curto desenvolvimento e tempos de produção, mas os níveis de expressão podem variar significativamente entre os lotes, dando assim origem a preocupações regulatórias no contexto das boas práticas de fabrico. Foi utilizado um planejamento de experimentos (DoE) abordagem para determinar o impacto dos principais fatores, como elementos reguladores na construção de expressão, o crescimento das plantas e os parâmetros de desenvolvimento e as condições de incubação durante a expressão, sobre a variabilidade de expressão entre os lotes. Foram testadas as plantas que expressam um anticorpo modelo anti-HIV anticorpo monoclonal (2G12) e uma proteína de marcador fluorescente (DsRed). Discutimos a justificativa para a seleção de certas propriedades do modelo e identificar suas possíveis limitações. A abordagem geral pode ser facilmente transferido para outros problemas, porque os princípios do modelo de umre amplamente aplicável: seleção de parâmetros baseada no conhecimento, a redução da complexidade, dividindo o problema inicial em módulos menores, de configuração guiada por software de combinações experimentais óptimas e aumento do projeto passo a passo. Portanto, a metodologia é útil não só para caracterizar a expressão da proteína em plantas, mas também para a investigação de outros sistemas complexos que faltam uma descrição mecanicista. As equações de previsão que descrevem a interligação entre os parâmetros podem ser utilizados para estabelecer modelos mecanísticos para outros sistemas complexos.

Um modelo descritivo para acumulação durante DsRed expressão transitória utilizando diferentes promotores e 5&#39;UTRs DsRed fluorescência nos extractos de folhas foi utilizado para indicar o nível de expressão da proteína recombinante e, assim, foi utilizada como a resposta na estratégia DOE. A diferença mínima detectável foram consideradas relevantes foi de 20 ug / ml e o desvio padrão estimado do sistema foi de 8 ug / ml com base em experiências iniciais. Fa...

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Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Descreve-se um desenho de experiências abordagem que pode ser utilizada para determinar e modelar a influência dos elementos de regulação de transgenes, de crescimento e de desenvolvimento de parâmetros de planta, e as condições de incubação sobre a expressão transiente de anticorpos monoclonais e proteínas repórter em plantas.

Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

characterization-complex-systems-using-design-experiments-approach

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.4K visualizações.  RWTH Aachen University.  Descreve-se um desenho de experiências abordagem que pode ser utilizada para determinar e modelar a influência dos elementos de regulação de transgenes, de crescimento e de desenvolvimento de parâmetros de planta, e as condições de incubação sobre a expressão transiente de anticorpos monoclonais e proteínas repórter em plantas. 