Gostaríamos de agradecer Jürgen Soll para discussões úteis e Chris Carrie para a leitura crítica do manuscrito. Este projecto foi financiado pelo DFG e Fonds der chemischen Industrie (números concede SFB 1035, projeto A04 para SS e Do 187/22 para RS).

1. Transformação de BiFC Constrói em Agrobacteria <ol><li> Clonagem das construções BIFC <ol><li> Amplificar o gene de interesse a partir de um molde adequado, utilizando os oligonucleótidos que contêm locais attB que flanqueiam-. Realize uma PCR utilizando uma polimerase de revisão. Adaptar o comprimento do passo de recozimento para a combinação de iniciadores concebidos e o comprimento do passo de alongamento de acordo com o tamanho do fragmento. Verifique o produto de PCR por electroforese em gel de agarose e purificá-lo por meio de um kit de PCR Clean-up. </li><li> Realizar a reação BP com o fragmento obtido eo vetor de entrada usando uma recombinase BP. Misturar 15-150 ng de produto attB-PCR com 150 ng do vector de entrada, adicionar 2 mL da recombinase BP e encher-se com tampão TE para um volume total de 8 mL. Incubar a reacção durante 1 hora à temperatura ambiente e parar a reacção pela adição de 2 ul de proteinase K durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Transformar toda a reacção em E. competente coli DH5ct, Células e triagem das colônias obtidas por colônia PCR para a correta inserção do fragmento de DNA no vetor. A sequenciação de ADN de plasmídeos positivos é realizada para verificar a ausência de mutações. </li><li> Use o clone entrada obtido para recombinação LR com o vetor destino adequado usando uma recombinase LR. Misturar 50-150 ng do vector de entrada, com 150 ng do vector de destino, adicionar 1 ul LR recombinase e encher-se com tampão TE para um volume total de 5 mL. Incubar a reacção de 1 hora à temperatura ambiente e parar a reacção pela adição de 1 ul de proteinase K durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Transformar toda a reacção em células de E. coli DH5a competentes e as colónias obtidas tela por colónia de PCR para a correcta inserção do fragmento de ADN no vector. A sequenciação de ADN não é necessária para esta etapa. </li><li> Isolar DNA de plasmídeo com um kit de plasmídeo mini para assegurar um elevado grau de pureza. </li></ol></li><li> Preparação de Agrobacterium quimicamente competentes (AGL1 tensão, Rifampicina e resistência Carbenicilina) <ol><li> Streak fora Agrobacterium de uma cultura estoque e crescer por 24 horas a 28 ° C. </li><li> Inocular 5 ml de meio LB com uma única colónia e incubar durante a noite a 28 ° C. </li><li> Inocular 50 ml de meio LB com 2 ml da cultura durante a noite e crescer durante cerca de 4 horas a 28 ° C até um OD600 de 1,0. </li><li> Centrifugar as células a 3000 xg durante 15 min a 4 ° C e ressuspender o pellet em 1 ml esterilizados gelada de CaCl2 (10 mM). Manter as células em gelo, após este passo. </li><li> Preparar alíquotas (100 L) de células, congelar imediatamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> A transformação de Agrobacterium quimicamente competente <ol><li> Descongele uma alíquota de células AGL1 competentes no gelo. Adicionar 1-2 ug de ADN de plasmídeo para as células. Incubar durante 5 min em gelo, de 5 min, em azoto líquido e 5 min a 37 ° C. Adicionar 600 ul de meio LB para as células e spescada a 650 rpm durante 4 h a 28 ° C. </li><li> Centrifugar as células durante 1 min a 8000 xg e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 50 mL de meio de LB e restante placa em placas de LB contendo os antibióticos apropriados. Selar as placas e incubar durante 2 dias a 28 ° C. Colônias de tela para a presença do plasmídeo por colônia PCR. </li><li> Inocule uma colónia positiva, em 5 ml de meio LB contendo os antibióticos adequados e incubar a 28 ° C durante a noite. Misturar 500 mL da cultura durante a noite com 500 ul de glicerol a 50% esterilizada e congelar a -80 ° C. </li><li> Inocular o Agrobacterium em meio LB contendo os antibióticos apropriados diretamente a partir do estoque de glicerol para a transformação transitória de folhas de tabaco. </li></ol></li></ol> 2. Transformação transiente de folhas de tabaco <ol><li> Agrobacteria crescimento <ol><li> Preparar as seguintes soluções de reserva: acetosiringona (150 mM, dissolvem-se em 70% De EtOH), armazenada como alíquotas a -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5,7, armazenar a 4 ° C (filtro estéril através de um filtro de 0,2 | iM para prevenir o crescimento bacteriano durante o tempo de armazenamento), MgCl2 (1 M) estoque, armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Inocular 10 ml de meio LB contendo os antibióticos adequados com 50 ul da cultura de reserva AGL1 glicerol contendo o plasmídeo de interesse em um tubo de 50 ml estéril e incubar a 28 ° C durante pelo menos 24 horas com agitação a 190 rpm até uma OD 600 entre 1,0 -2.0 é atingido. </li><li> Bactérias centrifugar a 3.000 g durante 15 min. Ressuspender o sedimento em meio de infiltração fez recém [MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5,7, acetossiringona (150 ^ M)] e ajustar a suspensão para uma DO 600 de 1,0. </li><li> Incubar as células Agrobacterium em um agitador vertical por 2 horas na escuridão. As células podem então ser utilizadas para a infiltração. </li></ol></li><li> Infiltração de folhas de tabaco <ol><li> Use trêssemana de tabaco velho (Nicotiana benthamiana) plantas. Escolha várias folhas mais velhas para a infiltração. </li><li> Mistura de volumes iguais de os Agrobacteria que transportam as construções de interesse (3 ml cada). Dê uma seringa de 5 ml sem agulha para a infiltração. Infiltrar-se na suspensão de células cuidadosamente as folhas de tabaco, pressionando a seringa no lado inferior das folhas em vários lugares. </li><li> Regue as plantas e deixá-los no escuro por dois dias. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de protoplastos Preparação de protoplastos de folhas de tabaco foi adaptado de Koop et al. 16 e ligeiramente modificada. <ol><li> Preparação de buffer <ol><li> Prepare meio F-PCN: Macro-sais [KNO 3 (1012 ug / ml), CaCl2 • 2H 2 O (440 ug / ml), MgSO 4 7H 2 O • (370 ug / mL), KH 2 PO 4 ( 170 ug / ml), NH 4-succinato de [(20 mM; preparar um sol de estoque 2 Mbuição (succinato (236 ug / ml) e NH 4 Cl (106 ng / mL), ajustado a pH 5,8 para dissolver)], Micro-sais [EDTA-Fe (III) x Na-sal (40 ug / ml), KJ (0,75 ug / ml), H 3 BO 3 (3 ug / ml), MnSO4 • H2O (10 ug / ml), ZnSO4 • 7H 2 O (2 ug / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 ug / ml), CuSO4 • 5H 2 O (0,025 g / ml), CoCl2 • 6H 2 O (0,025 g / ml)], MES (390 ug / ml), glucose (cerca de 80 ug / ml) osmolaridade de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Loja em alíquotas a -20 ° C. </li><li> Prepare meio F-PIN: Todos os ingredientes tal como F-PCN mas em vez de sacarose glicose utilização (cerca de 110 ug / ml), a osmolaridade de 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Loja em alíquotas a -20 ° C. </li><li> Prepare meio W5: 150 mM de NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM de KCl, 2 mM de MES, osmolaridade 550-580 mOsm, pH 5,7 (KOH). Guarde-o em 4 °; C (filtro estéril através de um filtro de 0,2 um para impedir o crescimento bacteriano durante o tempo de armazenamento). </li><li> Preparar solução enzimática fresca para o isolamento de protoplastos (0,1 g de celulase, 0,03 g macerozym em 10 ml F-PIN). Incubar a solução a 55 ° C durante 10 min e arrefecer à temperatura ambiente. Adicionar 100 ul de BSA a 10% para 10 ml de solução. </li></ol></li><li> Isolamento de protoplastos <ol><li> Coloque uma folha infiltrado em uma placa de Petri e adicionar a solução de enzima fresco. Use uma nova lâmina de barbear para cortar a folha em aproximadamente 0,5 cm 2 pedaços de tamanho. Transferir as peças em folha com a solução de enzima para um balão de vácuo de infiltração e infiltrar-se vácuo durante cerca de 20 segundos até que as bolhas de ar emergem a partir das folhas (libertação de vácuo muito cuidadosamente). </li><li> Agitar o frasco durante 90 minutos a 40 rpm em escuridão. </li><li> Soltar protoplastos por agitação durante 1 min a 90 rpm. Filtrar a solução através de uma gaze (100 uM) num tubo de centrifugação de 15 ml (fundo redondo). </li&gt; <li> Sobrepor a solução de protoplastos com 2 ml de tampão F-NCP e centrifuga-se durante 10 min a 70 x g (aceleração lenta e desaceleração) a TA. </li><li> Protoplastos intactos acumular na interface da solução de enzima e F-PCN. Tome uma grande orifício 1 ml ponta da pipeta para transferir os protoplastos intactos em um novo tubo de centrífuga e encher-se com tampão W5. Centrifugar durante 2 minutos a 100 x g (aceleração e desaceleração lentas) para sedimentar os protoplastos. </li><li> Retirar o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta e ressuspender o pellet em cerca de 200 ul de tampão W5, dependendo da quantidade de protoplastos. </li><li> Sempre use dicas de orifício de largura para evitar ruptura de protoplastos intactos. </li></ol></li></ol> 4. Laser Scanning Microscopy <ol><li> A preparação das amostras <ol><li> Cole duas pequenas tiras de vedação em torno de uma lâmina de microscópio (2 cm de distância). Colocar 20 mL de solução de protoplasto entre as tiras e colocar uma tampa de vidro cuidadosamenteno topo. As tiras de vedação se certificar de que os protoplastos não são esmagados pela tampa de vidro. </li><li> Para as amostras totais de folhas cortadas de uma peça de 1 cm da folha e colocá-la sobre uma lâmina de microscópio com o lado de baixo da folha virada para cima. Adicionar cerca de 30 mL de H 2 O, coloque uma tampa de vidro em cima e fixe-o firmemente com fita adesiva em ambos os lados. </li></ol></li><li> Configurações de imagem e microscópio confocal <ol><li> Imagem é realizada com um microscópio confocal a laser da Leica, Tipo: TCS SP5. Para ampliação usar uma lente objetiva (HCX PL APO CS) com uma magnitude de 63X com glicerol como meio de geração de imagens. Defina a abertura numérica para 1,3. Use o software Leica Application Suite / Avançado de fluorescência para avaliação (ver Suplementar Dados S1). </li><li> Definir o laser de Árgon de 30% e a potência do laser de 488 nm a uma intensidade de 18% para controlar o sinal BiFC reconstituído em 515 nm, e definir uma largura de banda de emissão do detector PMT 495-550. </li&gt; <li> Para monitorar a clorofila autofluorescência definir um segundo de largura de banda de emissão detector PMT 650-705. </li><li> Para monitorizar o sinal mCherry utilizar o laser de HeNe 561, definir a intensidade do laser 561-18% e a largura de banda de emissão de um terceiro detector PMT 587-610. </li><li> Certifique-se de que as imagens de todos os canais de detector PMT são tomadas com os mesmos ajustes de ganho (ganho deve ser entre 800-900 para excluir sinais de fundo). </li><li> Tirar fotos em um formato de largura / altura de 1024 x 1024 pixels com uma velocidade de varredura de 100 Hz. </li><li> Para Z-stackings utilização de uma distância máxima de 0,5 m entre cada pilha. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Ao planejar um experimento BiFC vários pontos devem ser considerados. Embora não haja informação estrutural sobre as proteínas de interesse é necessária, a topologia tem que ser conhecida quando se trabalha com as proteínas da membrana que mede. As proteínas fluorescentes têm de residir no mesmo compartimento subcelular ou enfrentar o mesmo lado de uma membrana para permitir a interacção. Naturalmente, quando a análise de proteínas que requerem uma sequência de direccionamento do terminal N, apenas uma et...

Estudando a formação de complexos de proteínas e a sua localização em células de plantas in vivo é essencial para investigar redes celulares, a sinalização e os processos metabólicos. BiFC permite a visualização de interações proteína-proteína em seu ambiente natural diretamente dentro da célula vegetal vida 1-5. No BiFC aproximar a complementação de dois fragmentos N-e C-terminais não fluorescentes de uma ligação de proteína fluorescente para uma proteína fluorescente reconstituído. Fragmentos de muitas proteínas fluorescentes diferentes têm sido utilizados para detectar interacções de proteínas, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP), o cromóforo de que é quimicamente formado por três resíduos distintas 6. As proteínas fluorescentes pode ser reduzido para metade dentro de um loop ou ß-fio para resultar nos dois fragmentos não fluorescentes, que podem ser fundidos para ambas as proteínas de interesse. O ensaio pode ser utilizado para detectar interacções, em qualquer compartme subcelularnt em qualquer organismo cresce aerobicamente ou células que podem ser geneticamente modificados para expressar as proteínas de fusão. Se as duas proteínas de entrar em estreita proximidade no interior da célula, a fluorescência é reconstituído e pode ser monitorizada por microscopia, sem a adição de corantes ou fluoróforos exógenos 3. Tabaco (Nicotiana benthamiana) provou ser um organismo modelo conveniente para visualizar a interacção de proteínas de plantas, uma vez que as proteínas podem ser facilmente expressas utilizando a transformação mediada por Agrobacterium de folhas de tabaco com as construções gerados. Agrobacterium usar um assim chamado plasmídeo Ti (indução de tumores) que codificam para as enzimas que medeiam a transdução do gene de interesse em células de plantas. BiFC é também aplicável para a solúvel, bem como para as proteínas de membrana dentro de todos os compartimentos celulares e tem sido utilizado com êxito nos últimos anos para identificar proteínas que interagem in vivo, bem como para analisar os sítios de interacçãodentro das proteínas 7-9. Após a expressão dos genes introduzidos, a interacção das proteínas fluorescentes podem ser visualizados directamente nas folhas, o que é adequado para estruturas celulares maiores, tais como o retículo endoplasmático (ER), a membrana plasmática ou cloroplastos. No entanto, para controlar a localização de estruturas mais refinados, por exemplo, o invólucro do cloroplasto, é aconselhável para visualizar fluorescência em protoplastos isolados a partir de folhas de tabaco transformadas. Um conjunto de vectores BIFC contendo quer um C-terminal ou uma etiqueta fluorescente do terminal-N tem que ser utilizado para a abordagem BiFC em plantas 10. O protocolo descrito a seguir foi usado para estudar a interação de citosólica proteína de choque térmico 90 (HSP90), com o tetratricopeptide repetição (TPR) de domínio que contém proteínas de encaixe Toc64 e AtTPR7 que residem no envelope exterior cloroplastos e retículo endoplasmático, respectivamente 11-13. Para esta finalidade, a HSP90 foi fundido com o Ctparte erminal de SCFP (SCFP C). A marca foi N-terminal fundido com a chaperona para garantir a acessibilidade do motivo C-terminal de ligação MEEVD de HSP90 a braçadeira do tipo com domínios TPR. Em paralelo, a parte N-terminal de Vênus (Venus N) foi fundido com os domínios citosólicos do domínio TPR contendo proteínas de encaixe Toc64 e AtTPR7, respectivamente. Como um controlo negativo, clonado a parte C-terminal solúvel de SCFP C unicamente que reside no citossol e é, por conseguinte, um controlo apropriado. As marcas fluorescentes das proteínas estudadas têm que enfrentar o mesmo compartimento celular para permitir a proximidade e, assim, a reconstituição do sinal fluorescente. Para determinar a localização do sinal de fluorescência de uma proteína marcador reconstituído fundido com uma etiqueta fluorescente diferente podem ser co-transformados para demonstrar a localização subcelular da interacção. Uma proteína marcadora ER fundido com mCherrry foi transformada simultaneamente nocaso do PS localizado AtTPR7 14. A autofluorescência de clorofila serviu como marcador de cloroplasto em caso de Toc64. Por isso, não só a interacção in vivo da Toc64 AtTPR7 e, respectivamente, com o acompanhante citosólico HSP90 pode ser monitorizada directamente nas folhas de tabaco, mas também a localização subcelular da interacção pode ser investigada. BiFC é bem adequado como uma abordagem complementar a outros métodos que estudam as interações proteína-proteína. Comparado com coimmunoprecipitation ou em experiências de pull-down in vitro, por exemplo, não há anticorpos específicos têm de estar disponíveis para as proteínas de interesse, e as proteínas não tem que ser expresso de forma recombinante, in vitro, que pode ser um desafio, em especial para as proteínas de membrana. Além disso, também as interacções transiente pode ser monitorizada utilizando BiFC, uma vez que as proteínas são capturadas pela interacção dos marcadores fluorescentes com fusíveis 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
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protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

Muitas proteínas interagir transientemente com outras proteínas ou são integrados em complexos multi-proteína para desempenhar a sua função biológica. Complementação fluorescência bimolecular (BiFC) é um método in vivo para monitorizar estas interacções em células vegetais. No protocolo apresentou as proteínas candidatas investigados são fundidas com as metades complementares de proteínas fluorescentes e as respectivas construções são introduzidas em células de plantas por meio de transformação mediada por Agrobacterium. Subsequentemente, as proteínas são expressas transitoriamente em folhas de tabaco e os sinais fluorescentes restaurado pode ser detectada com um microscópio confocal de varrimento laser nas células intactas. Isto permite não só a visualização da própria interacção, mas também a localização subcelular dos complexos de proteína pode ser determinada. Para esta finalidade, genes marcadores que contêm um marcador fluorescente pode ser co-expresso juntamente com as construções BIFC, visualizando, assim, estruturas celulares, tais como tele retículo endoplasmático, mitocôndria, o aparelho de Golgi ou na membrana plasmática. O sinal fluorescente pode ser monitorada, quer directamente na epiderme foliar ou em protoplastos individuais, que podem ser facilmente isolados a partir de folhas de tabaco transformadas. BiFC é ideal para estudar as interações proteína-proteína em seu ambiente natural dentro da célula viva. No entanto, isso tem de ser considerado que a expressão tem de ser accionada por promotores fortes e que os parceiros de interacção são modificadas devido à fusão das marcações de fluorescência relativamente grandes, o que pode interferir com o mecanismo de interacção. No entanto, BiFC é uma abordagem complementar excelente para outros métodos vulgarmente utilizados para investigação de interacções proteína-proteína, tais como coimmunoprecipitation, os ensaios in vitro suspensos ou experiências de levedura de dois híbridos.

Neste exemplo foi utilizado o método BiFC para monitorar a interação do HSP90 chaperone molecular citosólica com as proteínas de ancoragem de membrana AtTPR7 e Toc64. AtTPR7 faz parte do translocon Sec e interage com acompanhantes citosólicos, que possivelmente entregar pré-proteínas secretoras para translocação pós-translacional para a membrana do RE. Da mesma forma, Toc64 no envelope exterior cloroplasto atua na importação de pós-translacionais, recebendo pré-proteínas HSP90 cloroplastos associados. Am...

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K visualizações.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas. 

Vídeo: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biologia

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrosoldável célula visualizado com microscopia de fluorescência

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Complementação de fluorescência bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...