O ensaio de dupla adição de fluorescência de cálcio de triagem de alto rendimento permite a identificação de novos ligantes de moléculas pequenas de um receptor acoplado à proteína G que sinaliza através da cascata de cálcio intracelular. A principal vantagem do ensaio de adição dupla é a detecção de HTS agonista e antagonista em um único ensaio com as mesmas células, desde que o sinal de fluorescência dure dure dois minutos. Este método pode ser aplicado a qualquer GPCR que sinalize através da cascata de cálcio, que inclui a maior parte da família de peptídeos de neurônios artrópodes, um GPCRs.
Para a reprodutibilidade do ensaio, é importante otimizar a densidade celular, a velocidade de injeção e a concentração do agonista conhecido para a segunda edição. A demonstrar o procedimento estará Bianca Henriques-Santos, investigadora associada de pós-doutoramento no meu laboratório. Iniciar o ensaio de fluorescência de cálcio removendo o meio gasto do balão T-75 contendo 70 a 90% de células BMLK confluentes.
Lave as células com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou DPBS da Dulbecco. Depois de remover o DPBS, desprenda as células usando dois mililitros de ácido etilenodiaminotetracético a 0,25% de tripsina ou EDTA e incube por três a cinco minutos a 37 graus Celsius. Adicione oito mililitros de meio seletivo e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros.
Antes de centrifugar a suspensão da célula a 1000 x g durante três minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio F-12K contendo 1% de soro bovino fetal ou FBS e 400 microgramas por mililitro de sulfato G418. Para determinar a densidade celular da suspensão para diluição adicional, misture 20 microlitros de suspensão celular em 20 microlitros de azul de tripano a 0,4% e, em seguida, carregue a mistura de 20 microlitros em uma câmara de contagem de células para ser lida por um contador de células para a densidade celular.
Diluir a suspensão celular usando o mesmo meio F-12K e compor o volume final para 15 mililitros a uma densidade de quatro vezes 10 para a quinta célula por mililitro. Para semear as células na placa de poli-D lisina ou PDL codificada 384 poços. Adicionar 25 microlitros da suspensão de células diluídas em 384 poços da placa usando um sistema de manuseio de líquidos.
Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na incubadora umidificada. No dia seguinte, inverta rapidamente a placa de poço 384 90% confluente. Para remover o meio gasto e suavemente manchado em toalhas de papel estéril duas a três vezes para remover todo o líquido da placa.
Execute os próximos passos na luz fraca e suave dentro do gabinete de biossegurança. Em seguida, adicione 25 microlitros do corante de carga em cada poço usando um sistema de manuseio de líquidos, dispensando 12,5 microlitros em cada poço com uma velocidade de aspiração e distribuição de 3,8 microlitros por segundo. Repita esta etapa de pipetagem para atingir um volume final de 25 microlitros em cada poço.
Uma vez feito, cubra a placa com papel alumínio para protegê-la da luz ambiente e incube a 37 graus Celsius na incubadora umidificada de dióxido de carbono por 30 minutos. Depois de equilibrar a placa coberta por mais 30 minutos, as células estão prontas para triagem de alto rendimento ou HTS. Em seguida, centrifugar a placa de droga a 1200 x g em uma centrífuga de placa por um minuto.
Transfira a solução de peptídeo agonista 10x de Rhimi-K-1 para um reservatório auto-amigável de 150 mililitros. No leitor de placas, clique em gerenciar protocolos. Em seguida, no protocolo de intensidade fluorescente do ponto final, selecione Flow Forte pré-lido, clique em iniciar medição para medir o sinal de fundo para todo o ensaio HTS.
Insira a placa celular no leitor de placas. No painel de instrumentos, clique em um poço aleatório na placa e, em seguida, clique em nova altura de foco. Clique em ajuste de foco.
Clique em ajuste de ganho. Atribua-o como 5% a 10% do valor máximo mensurável de fluorescência. Clique em iniciar ajuste.
Clique em iniciar medição para ler toda a placa para o sinal de fluorescência de fundo em unidades de fluorescência relativa ou RFU. Enquanto a placa está lendo, clique no estado atual para ver o valor de leitura em tempo real. Para o ensaio de adição dupla, pipetar 10 microlitros da solução do medicamento para cima e para baixo três vezes usando o sistema de manuseio de líquidos e aspirar 1,5 microlitros de cada poço da placa do medicamento a uma velocidade de aspiração de 1,0 microlitros por segundo.
Dispensar 0,5 microlitros dos compostos no ensaio celular para atingir uma concentração final de dois micromolares em 0,2% de sulfóxido de dimetilo ou DMSO. Depois de adicionar os compostos de peneiramento, coloque a placa de ensaio imediatamente no leitor de placas. Clique no programa de leitura predefinido e leia a placa nas direções de leitura para frente e para trás.
Descarte um microlitro de solução de droga restante nas pontas, imergindo as pontas em um reservatório de resíduos de 150 mililitros contendo aproximadamente 50 mililitros de DPBS. Incubar os compostos de triagem com as células por um total de cinco minutos, incluindo o tempo dentro do leitor de placas no gabinete de biossegurança com as luzes apagadas. Em seguida, adicione três microlitros do peptídeo agonista Rhimi-K-1 do reservatório na placa de ensaio usando o sistema de manuseio de líquidos usando 384 pontas de 12,5 microlitros.
Coloque a placa no leitor de placas imediatamente. Clique no programa de leitura predefinido e leia a placa nas direções de leitura para frente e para trás. Uma vez feito manualmente, calcule o fator Z para o controle de qualidade de cada ensaio de placa.
Selecione manualmente as moléculas de acerto dos mapas de calor na plataforma de dados HTS on-line e calcule a porcentagem normalizada de ativação ou NPA e atividade inibitória, ou I0 para os acertos agonistas e antagonistas atingidos. Uma placa de droga interna SAC2-34-6170 composta por 320 pequenas moléculas aleatórias foi usada para demonstrar este ensaio de HTS. O HTS apresentou excelente qualidade do ensaio com um fator Z de 0,7 refletindo que a qualidade do ensaio independente dos compostos testados.
É essencial ler a placa imediatamente após a adição do agonista, porque o sinal de fluorescência é de curta duração. Após este procedimento, a molécula atingida identificada deve ser validada através de ensaios de resposta à dose e testada em células que não expressam o GPCR alvo para excluir acertos fora do alvo.
