Os autores agradecem Nick Kathman para sugestões e ajudar na preparação para o manuscrito. Esta técnica foi desenvolvida em conjunto com o trabalho apoiado pela AFOSR sob concessão FA9550-10-1-0054 e da National Science Foundation, Grant No. IOS-1120305 para RER.

1. Preparação de Fios TETRODE <ol><li> Puxe um fio de nicromo muito fina (12 mM de diâmetro, revestimento PAC) de cerca de 1,1 m de comprimento. Prenda uma etiqueta de fita para cada extremidade. Pendurar o fio ao longo de um varão roscado horizontal de tal modo que as duas extremidades estão à mesma altura perto da bancada. </li><li> Repita o passo 1.1 para um segundo fio, fazendo mais duas extremidades para um total de 4, e colocá-lo ao lado do primeiro fio (cerca de 1 cm entre eles). </li><li> Fure as quatro pontas com uma etiqueta de fita e coloque a tag para um dispositivo de enrolamento rotativo motorizado. Este dispositivo pode ser feito a partir de um motor de corrente contínua de baixo custo. </li><li> Enrole o tetrode em uma direção por 2 min (60 rpm) e descontrair-lo na direção oposta para 30 seg. </li><li> Use uma pistola de calor para fundir os fios juntos. Não toque nos fios com a arma. Use três para cima e para baixo, passa a partir de direções alternadas, a cada passagem, tendo cerca de 10 seg. </li><li> Cortar a parte superior e a parte inferior dos fios enrolados. Os quatro fios são trançados umd fundidos juntos numa extremidade, mas separam-se do outro. </li><li> Adicionar o tubo de suporte. Corte um comprimento 30 centímetros de tubo de polietileno (diâmetro: dentro de 0,28 milímetros, 0,61 milímetros fora). Passe o tetrodo muito lentamente e cuidadosamente para dentro do tubo de apoio, de modo que ele não dobre. </li><li> Uma vez que a extremidade fundida aparece para o outro lado, puxá-lo de forma a que haja um comprimento igual de fios em ambas as extremidades do tubo de guia. </li><li> Agarre a final em separado de cada fio com uma pinça. Utilizando a base da chama de um queimador de gás, queimar cuidadosamente o material isolante do último 2 ou 3 mm de cada um dos fios. Aqueça o fio até que ele brilha, mas não enrolar. </li><li> Conecte o tetrode com um adaptador de tomada IC masculino-feminino que se encaixa o seu dispositivo de gravação. Coloque a extremidade deinsulated de cada fio em uma tomada diferente do adaptador com uma pinça. Estabilize o fio no soquete com um pequeno pino de metal. Use um ferro de solda ponta fina e preencha o soquete com a solda derretida. Tenha cuidado para não entrar em contatoo fio frágil com o ferro de solda. </li><li> Verificar a impedância de cada fio e a entre a impedância de cada par de fios. <ol><li> Coloque a fundido, a extremidade torcido em um recipiente de solução salina e conectar um condutor de fio de cobre a partir da solução salina para o medidor de ohm. </li><li> Ligar a outra extremidade do medidor para o pino encaixe contendo o arame. A impedância de cada fio deve ser inferior a 3 mohms. </li><li> Se os valores acima não são atingidos, tente novamente as conexões de solda. </li><li> Retire os fios do soro fisiológico, lavar as pontas com água, e testar a impedância entre fio para cada par (n = 6). As inter impedância deve estar acima de 5 mohms. </li><li> Se os valores acima não são atingidos, corte uma pequena quantidade da ponta off no final fundido e teste novamente. </li><li> Descarte qualquer conjunto de arame que não atende às exigências de impedância para todos os fios. </li></ol></li><li> Fixe o tetrode. <ol><li> Dobre uma pequena caixa de papel rectangular slightly maior do que o adaptador de tomada. </li><li> Transfira o adaptador na caixa com o lado macho na parte inferior. Penetram na caixa de tal forma que todos os pinos de o lado macho estão fora da caixa, enquanto o resto da placa está dentro da caixa. </li><li> Tape os cantos da caixa do lado de fora. Use pequenos pedaços de fita adesiva de dupla face no lado de dentro da caixa para estabilizar quaisquer fios individuais de fios. O fio deve ser fundida à medida que sai da caixa. </li><li> Misture rapidamente definir epóxi 2 parte e despeje na caixa para garantir o adaptador e todos os fios. </li><li> Anexar a extremidade próxima do tubo de guia para um lado da caixa, com impressões dentárias, mas deixam o tubo de tal forma que abra o tetrodo pode ser puxado através livremente em ambas as extremidades. </li></ol></li><li> Afie a tetrode. <ol><li> Antes de cada experiência, corte a ponta do tetrodo com uma lâmina de bisturi afiada, não tesoura. Isto impede de esmagamento e espalhamento de as extremidades dos fios, proporcionando uma borda plana limpa para o próximo passo. <ol&gt; <li> Use uma pequena ferramenta rotativa montado verticalmente, com discos de lixa média e fina (estes podem ser combinados em uma única plataforma) para polir a tetrode e remover algum isolamento ponta. Segure o pacote perto do fim com uma pinça. Inclinar a definir a extremidade do fio para um ângulo de 45 ° em relação ao disco de lixar e suavemente tocá-lo para o disco giratório a velocidade moderada durante cerca de 1 ou 2 segundos cada um no meio e em seguida os grãos finos. Repita este mais três vezes, axialmente rotativo o feixe 90 ° de cada vez. É crítico que a direcção de rotação dos discos de lixar é afastado do ângulo raso de as extremidades do cabo, de outro modo a separação dos cabos pode ocorrer. </li><li> O resultado desejado transforma o pacote final a partir de um bordo rectilíneo a uma ponta aguçada, com pequenas quantidades de isolamento removido da extremidade de cada fio. Verifique o ponto de usar um microscópio de dissecação antes do plaqueamento o tetrode. Se algum desgaste ocorre na ponta, recut e repolir. </li><li> Se o teste de impedância durante o subsequpasso ent chapeamento mostra extremamente baixos valores inter-fio (menos do que 4 mohms), que indica muito material removido durante a etapa de polimento. Recorte e repolir o tetrode. </li></ol></li><li> Placa do tetrode. Colocar a ponta da tetrodo em uma solução saturada de sulfato de cobre (85 ml de água, de ácido sulfúrico a 5 ml, 50 g de sulfato de cobre). Placa de cada arame com uma corrente de 2,5 mA, com um isolador de estímulo. Injetar a corrente por 1 segundo, pause por 1 segundo e repita este processo de 4x. </li><li> Verificar a impedância de cada fio e a interimpedance de cada par de fios. A impedância de cada fio deve estar compreendida entre 0,5-1 mohms e inter impedância deve ser acima de 4 mohms. </li><li> Monte o adaptador na headstage de um sistema de gravação multicanal. </li><li> Anexar um pino inseto se inclinou para um micromanipulador. Prenda a ponta do tetrode ao pino inseto com cera dental </li></ol></li></ol> 2. Preparação animal <ol><li> Anestesiar oBarata com gelo. </li><li> Após a barata pára de se mover, conter a barata verticalmente contra uma superfície plana de cortiça com grandes pinos de sela que estendem o inseto, mas não penetrar em qualquer parte de seu corpo. </li><li> Transferir a preparação em um recipiente de plástico e colocá-gelo à volta do animal para minimizar os movimentos do corpo do fluxo sanguíneo e. </li><li> Coloque um colar de plástico no pescoço para apoiar a cabeça e colocar cera dental em torno da cabeça para estabilizá-lo. </li><li> Corte uma pequena janela entre o ocelos com uma lâmina de barbear e remover a cutícula da cabeça. </li><li> Remover tecidos conjuntivos e gordura com uma pinça para expor o cérebro. </li><li> Colocar um pouco de soro fisiológico barata na cápsula cabeça para cobrir o tecido cerebral. </li><li> Para desheath o cérebro, utilizar uma pinça fina para agarrar suavemente a bainha na parte superior do cérebro e utilizar outro pinça fina para rasgar o invólucro para além de fios da área de implante. </li><li> Abra um pequeno buraco na cabeça cápsula anterior à sagacidade cérebroh um pino de inseto. Insira uma trança de três diâmetros maiores (56 um) com isolamento de fios de cobre no furo para servir como um eletrodo de referência / chão. </li><li> Abaixe a ponta do tetrode à superfície do cérebro com o micromanipulador e posicioná-lo próximo a região do cérebro de interesse. </li><li> Com cuidado, coloque dois pequenos pedaços de folha de acetato fino (2 mm x 1 mm), ligeiramente maior do que o buraco na cápsula cabeça, anterior e posterior à tetrode. </li><li> Ligue o sistema de gravação. </li><li> Lentamente abaixe o tetrode 150-250 mM abaixo da superfície do cérebro, dependendo da qualidade de gravação. </li><li> Desligue o sistema de gravação. </li><li> Mover os dois pedaços de chapa de etilo como perto do tetrodo possível sem tocá-lo (Figura 1A). </li><li> Aquece-se uma pequena espátula ou agulha hipodérmica achatada e colocá-lo em cera dentária tal que existe cera líquida na ponta da espátula. Tocar com cuidado a extremidade de cada pedaço de folha de acetato a partir doTETRODE com a espátula de modo a que a cera líquida pode fluir para cada pedaço e vedar a folga entre ele e a cabeça da cutícula. </li><li> Repita o passo 2.16. Largar uma pequena quantidade de cera líquida sobre a folha de acetato de cada vez. Inicie o processo longe da tetrode e mover-se gradualmente em direção a ela. Eventualmente o tetrode será ancorado por cera dental. Evite ficar cera quente para dentro da cavidade e para o cérebro. </li><li> Use o mesmo método que os passos 2.16 e 2.17 para ancorar o eletrodo de referência / chão com cera. </li><li> Aquece-se a cera que se liga a tetrodo para o micromanipulador para libertar o tetrodo a partir dele. </li><li> Passe o tetrode na cera dental na cabeça para proporcionar um alívio de tensão (Figura 1B). </li><li> Cubra o ciclo de alívio de tensão com cera dental (Figura 1C). </li><li> Retire cuidadosamente as restrições e transferir a preparação para uma placa de Petri. Contenha lado a preparação dorsal com grandes pinos de sela. </li><li> Anexaruma haste ao pronotum usando uma pistola de cola. Este é um pedaço de madeira que se estende do pronoto sobre o abdome. </li><li> Anexar a ponta do tubo tetrodo para a extremidade posterior da haste com cera dental. </li><li> Ancorar a tetrodo eo eletrodo de referência / terra até à extremidade anterior da haste com cera dental. </li><li> Puxar o tetrodo da extremidade de encaixe do tubo, tanto quanto possível, mas não puxar nela, a fim de eliminar a possibilidade de que o animal pode danificar a parte do tetrodo fora do tubo (Figura 1D). </li><li> Remover todas as restrições. Conecte o eletrodo de referência / terreno para a tubulação tetrode com cera dental. </li><li> Espere pelo menos 60 minutos para que o animal se recuperar da anestesia gelo antes de qualquer experiência. </li></ol> 3. Procedimentos Experimentais <ol><li> Conecte um PC tanto com o sistema de gravação e uma luz LED usando um cabo USB para porta serial. </li><li> Comece gravações neurais. </li><li>Iniciar gravações de vídeo em 20 quadros por segundo para andar experimentos usando o pacote de aquisição de imagem Motmot 16 ou 120 fps para subir experimentos usando uma câmera de alta velocidade. </li><li> Coloque a barata em um 40 cm x 40 cm Plexiglas arena para andar experiências ou de 58 centímetros de comprimento, 5 cm de largura e 5 cm de altura de arena para subir experimentos. A arena curta tem uma barreira transparente que se estende desde o centro da parede do lado direito para o centro da arena, acima do qual está localizado o andar de entrada. A barreira é usado para evitar que os animais de andar em áreas onde a visão da câmera é bloqueada pela headstage. A arena de escalada tem um bloco de acrílico (ambos 1,2 centímetros ou 1,8 cm de altura e 5 cm de largura) ou uma prateleira localizada a uma altura comparável no centro. </li><li> Gerar um pulso TTL a partir do PC usando um comando personalizado MATLAB. (S = de série (&quot;COM4 &#39;); fopen (s); s.RequestToSend =&#39; desligado &#39;/ s.RequestToSend =&#39; on &#39;/; fclose (s); excluir (s) ;). O pulso TTL gera vezestamp para o sistema de gravação e ou liga ou desliga a luz LED. </li><li> Permitir a barata para explorar a arena até que ele pára de se mover por mais de 30 segundos para andar experimentos. Permitir a barata, quer subir ao longo do bloco / prateleira ou um túnel através da plataforma para subir experimentos. </li><li> Pare de gravações de vídeo. </li><li> Pare gravações neurais. </li><li> Anote o timestamp gerado pelo pulso TTL. </li><li> Remover a barata da arena e esperar pelo menos 3 min. </li><li> Repita os passos 3,2-3,10 para a próxima prova. </li><li> Uma vez que todas as gravações de ter sido concluída, passar 5 seg de corrente de 5 mA DC através de uma das pontas de fio (ânodo) e o eléctrodo de referência (cátodo) para depositar o cobre no cérebro na ponta do fio. </li></ol> 4. Análise off-line <ol><li> Sincronizar vídeo e dados neurais ligando o quadro onde a luz do LED é ligado eo timestamp registrado pelo sistema de gravação emnesse momento. </li><li> Marcar locais ponta do fio. Use procedimentos de intensificação Timms para precipitar e observar o cobre em 12 mM cortes seriados 17. Proeminentes depósitos devem ser visíveis em 3-8 secções adjacentes (cerca de 18-48% do comprimento da placa ventral dorsal da área que gravar a partir de) (Figura 2). </li><li> Correlacionar impulsos elétricos específicos para a atividade de neurônios individuais. Siga pico procedimentos de classificação estabelecidos em detalhe em outro lugar 10,14,18. Use o programa KlustaKwik (versão 1.5, autor K. Harris, da Universidade Rutgers) para gerar, clustering automatizada inicial. Importá-los para o programa MClust (versão 3.5, os autores AD avermelhado et al., Da Universidade de Minnesota), para posterior refinamento e análise (Figura 3). </li><li> Acompanhe os movimentos da barata. Para experiências que anda, extrair a posição (visual), o centro da barata da massa e a sua orientação do corpo em cada quadro da vidEO gravações usando o Caltech múltipla Fly Tracker (versão 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) ea caixa de ferramentas FixErrors associado para MATLAB 19. Para subir experiências, extrair a posição do bloco e cabeça da barata e pronoto em cada quadro do vídeo usando o pacote de software de análise de movimento. </li></ol>

<ol>
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Biol. 15, 1473-1478 (2005).</li><li>Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+targeting+of+motor+actions+in+climbing+Drosophila.">Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila.</a> Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).</li><li>Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+polarized+light+information+in+the+central+complex+of+the+locust.">Transformation of polarized light information in the central complex of the locust.</a> J. 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Neurol. 511, 454-478 (2008).</li><li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+input+to+the+output:+new+sets+of+neurons+complement+the+polarization+vision+network+in+the+locust+central+complex.">Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex.</a> J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).</li><li>Heinze, S., Reppert, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sun+compass+integration+of+skylight+cues+in+migratory+monarch+butterflies.">Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies.</a> Neuron. 69, 345-358 (2011).</li><li>Brill, M. 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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Enquanto os estudos eletrofisiológicos anteriores sobre o CC ou de outras regiões do cérebro do inseto nos forneceu insights sobre a central de controle do comportamento, a maioria deles foram realizados tanto em preparações contido 9,11 ou aqueles amarrados 10,14. Como resultado, o animal de experiência sensorial e estado fisiológico pode ser muito diferentes daqueles em um ambiente natural. Além disso, as tarefas de comportamento que o animal pode realizar são limitados a um avião nessa...

Este artigo descreve um sistema bem sucedido para a gravação de neurônios dentro do complexo central (CC) da barata, discoidalis Blaberus, como o inseto entra em uma arena e lida com objetos que fazem com que se virar, túnel sob, ou passar por cima de obstáculos. Os fios podem também ser ligados a um estimulador de evocar actividade no neuropil circundante, com as consequentes alterações comportamentais. Na última década, considerável atenção tem sido direcionada para os papéis desempenhados por várias regiões do cérebro em controlar o comportamento de insetos. Grande parte desse foco foi direcionado para as neuropils cerebrais da linha média que são referidos coletivamente como o complexo central (CC). Registaram-se progressos, como resultado de uma ampla variedade de técnicas que visam questões sobre o papel do CC no comportamento. Essas técnicas variam de manipulações neurogenéticos, principalmente em Drosophila, juntamente com behavianálise oral, 1-3, a técnicas eletrofisiológicas que monitoram a atividade neural dentro do CC e tentativa de relacionar a atividade com os parâmetros comportamentais relevantes. Técnicas eletrofisiológicas incluem gravação intracelular de neurônios individuais identificados 4-9 e gravação extracelular, muitas vezes com múltiplas sondas canal 10,11. Estas duas técnicas são gratuitos. Gravação intracelular com eléctrodos cortantes ou remendo célula completa fornece dados muito pormenorizados sobre neurónios identificados, mas está limitada a uma ou duas células ao mesmo tempo, requer pouco ou nenhum movimento, e pode ser mantido durante períodos relativamente curtos de tempo. Gravações extracelular pode ser facilmente configurado, não necessitam de restrição, e pode ser mantido por horas. Com tetrodes multicanal e corte cluster, bastante grandes populações de neurônios podem ser analisados ​​simultaneamente 9,12. Enquanto PATC célula inteirah foi usado com sucesso em insetos amarrados 13, sentimos que há também uma necessidade de técnicas que nos permitem gravar a atividade neural no cérebro por longos períodos de tempo em se comportando livremente insetos como eles lidam com as barreiras ao movimento para a frente. A necessidade de gravar como os insetos se move e salta para cima e para baixo nos empurrou em direção a métodos de gravação extracelulares. Tivemos sucesso em boa gravação preparações contido com comercialmente disponíveis sondas 16 canais de silício 11, no entanto, o tamanho pequeno do mesmo grandes baratas significa que as sondas têm de ser montados fora do corpo. Isso, juntamente com a delicadeza dos dentes sonda, fez uma preparação inadequada para andar livre. Em dois projetos anteriores, foram utilizados feixes de fios finos, formando uma tetrodo para realizar propriedades de gravação semelhantes, mas em um arranjo mais robusto. Estes pacotes tetrode nos permitiu gravar a partir de baratas amarrados umd relacionar atividade unidade CC às mudanças na velocidade de andar 14 e virando comportamento resultante do contato da antena com uma haste 10. Por mais útil que estas preparações amarrados foram e continuarão a ser, eles apresentam algumas limitações. Em primeiro lugar, os comportamentos que o inseto pode executar são limitados a um avião. Ou seja, poderíamos facilmente evocar mudanças na velocidade de caminhada ou de viragem, mas as ações de escalada e túnel não fosse possível, pelo menos com o arranjo típico corda. Em segundo lugar, os preparativos estão amarrados &quot;circuito aberto&quot;. Ou seja, eles não permitem o retorno normal de movimento relacionado ao sistema. Assim, como a barata ligado a corda, o mundo visual não foi alterado em conformidade. É possível construir sistemas de amarrar em malha fechada para introduzir este tipo de feedback. No entanto, eles são limitados pela complexidade da programação e de hardware do ambiente visual simulada. Nevertheless, sentimos que poderíamos melhorar nossos métodos de gravação amarrados existentes através da gravação a partir do animal, uma vez que andava livremente em uma arena ou pista e objetos encontrados como faria em seu ambiente natural. Embora os sistemas sem fios para registo da actividade do cérebro 15 seria o ideal, os sistemas actuais têm limitações no número de canais de gravação, o tempo de aquisição de dados, a duração da bateria e do peso. Nós, portanto, optou por tentar adaptar o nosso sistema de gravação tethered para uso em preparações se movendo livremente. Como melhores sistemas sem fios tornar-se disponíveis, esta técnica pode ser facilmente adaptado a esses dispositivos. O sistema que é descrito neste artigo é leve, funciona muito bem e parece ter pouco efeito deletério sobre o comportamento da barata. Com uma câmara de alta velocidade e de baixo custo de software de corte de cluster, actividade em neurónios individuais do cérebro pode ser relacionada com o movimento. Aqui nós descrevemos a preparção dos fios tetrode e sua implantação no cérebro do inseto, bem como as técnicas de gravação de atividade elétrica e movimento e como esses dados podem ser reunidos para análise posterior.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="728">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Nichrome wire&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sandvik Heating Technology</td>
			<td style="width:137px;">Kanthal RO-800</td>
			<td style="width:205px;">Use for tetrode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biomedical polyethylene tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>800700</td>
			<td>Use for tetrode tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lynx-8</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td></td>
			<td>Use for multi-unit recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cheetah 32</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td></td>
			<td>Use for multi-unit recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High speed camera</td>
			<td>Basler</td>
			<td>A602f</td>
			<td>Use fir video recording for walking experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High speed camera</td>
			<td>Casio</td>
			<td>EX-FC150&#160;</td>
			<td>Use for video recording for climbing experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WINanalyze</td>
			<td>Winanalyze</td>
			<td>version 1.4 3D</td>
			<td>Use for video tracking&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>MATLAB R2012b</td>
			<td>Use for TTL pulse generation and off-line data analysis</td>
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extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects

O crescente interesse no papel de atividade cerebral no controle motor inseto exige que sejamos capazes de monitorar a atividade neural enquanto insetos executar o comportamento natural. Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permitiram gravar a atividade de vários neurônios simultaneamente, enquanto uma barata amarrados virou velocidade de caminhada ou alterado. Enquanto um grande avanço, os preparativos amarrados fornecer acesso a comportamentos limitados e muitas vezes não têm os processos de feedback que ocorrem em animais movendo-se livremente. Apresentamos agora uma versão modificada do que a técnica que nos permite gravar a partir do complexo central da movendo-se livremente baratas como andam em uma arena e lidar com as barreiras, transformando, escalada ou tunelamento. Juntamente com o vídeo de alta velocidade e de corte cluster, agora podemos relacionar a atividade cerebral de vários parâmetros do movimento de insetos comportando livremente.

Gravamos a atividade neural de 50 unidades do CC em 27 preparações para experiências de locomoção. Para 15 dessas preparações (23 unidades), as experiências de escalada também foram realizadas. Unidades individuais são nomeados de acordo com números de preparação e de unidade (por exemplo, unidade de 1-2 indica preparação 1, unidade 2). Instantâneos do vídeo de um ensaio de escalada são mostrados na Figura 4. Todo o vídeo está disponível em <str...

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Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permite monitorar a atividade em unidades individuais de baratas amarrados. Aqui apresentamos uma versão modificada do que a técnica que nos permite também gravar a atividade cerebral em insetos se movendo livremente.

Extracelular Fio Tetrode Gravação em Cérebro de Livremente Andando Insetos

Increasing interest in the role of brain activity in insect motor control requires that we be able to monitor neural activity while insects perform ...

extracellular-wire-tetrode-recording-brain-freely-walking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K visualizações.  Case Western Reserve University.  Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permite monitorar a atividade em unidades individuais de baratas amarrados. Aqui apresentamos uma versão modificada do que a técnica que nos permite também gravar a atividade cerebral em insetos se movendo livremente. 

Vídeo: Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Neurociência

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed single-neuron activity while animals are acquiring an operantly conditioned response, or when that response is extinguished. But even in these cases, observation periods usually encompass only a single stage of learning, i.e. acquisition or extinction, but not both (exceptions include protocols employing reversal learning; see Bingman&#160;et al.1 for an example). However, acquisition and extinction entail different learning mechanisms and are therefore expected to be accompanied by different types and/or loci of neural plasticity.
Accordingly, we developed a behavioral paradigm which institutes three stages of learning in a single behavioral session and which is well suited for the simultaneous recording of single neurons&#39; action potentials. Animals are trained on a single-interval forced choice task which requires mapping each of two possible choice responses to the presentation of different novel visual stimuli (acquisition). After having reached a predefined performance criterion, one of the two choice responses is no longer reinforced (extinction). Following a certain decrement in performance level, correct responses are reinforced again (reacquisition). By using a new set of stimuli in every session, animals can undergo the acquisition-extinction-reacquisition process repeatedly. Because all three stages of learning occur in a single behavioral session, the paradigm is ideal for the simultaneous observation of the spiking output of multiple single neurons. We use pigeons as model systems, but the task can easily be adapted to any other species capable of conditioned discrimination learning.

Learning new stimulus-response associations engages a wide range of neural processes which are ultimately reflected in changing spike output of individual neurons. Here we describe a behavioral protocol allowing for the continuous registration of single-neuron activity while animals acquire, extinguish, and reacquire a conditioned response within a single experimental session.

Registro do potencial de ação simples Neurônios &#39;de livremente mover Pombos em três estágios da aprendizagem

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Gravação de EEG em Ratos Neonatais de Movimentação Livre Usando um Novo Método

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Construção de um Hyperdrive melhorado de multi Tetrode para gravação Neural em grande escala em comportar-se ratos

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, conventional microdrive designs often only allow use of one type of electrode to record from single or multiple regions, limiting the yield of single-unit or depth profile recordings. It also often limits the ability to combine electrode recordings with optogenetic tools to target pathway and/or cell type specific activity. Presented here is a hybrid microdrive array for freely moving mice to optimize yield and a description of its fabrication and reuse of the microdrive array. The current design employs nine tetrodes and one opto-silicon probe implanted in two different brain areas simultaneously in freely moving mice. The tetrodes and the opto-silicon probe are independently adjustable along the dorsoventral axis in the brain to maximize the yield of unit and oscillatory activities. This microdrive array also incorporates a set-up for light, mediating optogenetic manipulation to investigate the regional- or cell type-specific responses and functions of long-range neural circuits. In addition, the opto-silicon probe can be safely recovered and reused after each experiment. Because the microdrive array consists of 3D-printed parts, the design of microdrives can be easily modified to accommodate various settings. First described is the design of the microdrive array and how to attach the optical fiber to a silicon probe for optogenetics experiments, followed by fabrication of the tetrode bundle and implantation of the array into a mouse brain. The recording of local field potentials and unit spiking combined with optogenetic stimulation also demonstrate feasibility of the microdrive array system in freely moving mice.

This protocol describes the construction of a hybrid microdrive array that allows implantation of nine independently adjustable tetrodes and one adjustable opto-silicon probe in two brain regions in freely moving mice. Also demonstrated is a method for safely recovering and reusing the opto-silicon probe for multiple purposes.

Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Extracelular Fio Tetrode Gravação em Cérebro de Livremente Andando Insetos

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Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados