Gli autori ringraziano Nick Kathman per suggerimenti e aiuto a preparare per il manoscritto. Questa tecnica è stata sviluppata in collaborazione con il lavoro sostenuto dal AFOSR in concessione FA9550-10-1-0054 e la National Science Foundation sotto Grant No. IOS-1120305 RER.

1. Preparazione dei Fili tetrodo <ol><li> Estrarre un nichelcromo filo molto sottile (12 micron di diametro, rivestimento PAC) di circa 1,1 m di lunghezza. Applicare un tag nastro ad ogni estremità. Appendere il filo su una barra orizzontale filettata tale che le due estremità sono alla stessa altezza vicino al banco. </li><li> Ripetere passo 1.1 per un secondo filo, rendendo più due estremità per un totale di 4, e posizionarlo accanto al primo filo (circa 1 cm intermedie). </li><li> Attaccare le quattro estremità insieme con un tag nastro e allegare il tag a un dispositivo motorizzato rotante di avvolgimento. Questo dispositivo può essere costituito da un motore a corrente continua economico. </li><li> Avvolgere il tetrodo in una direzione per 2 min (60 rpm) e rilassarsi nella direzione opposta per 30 sec. </li><li> Utilizzare una pistola di calore per fondere i fili insieme. Non toccare i fili con la pistola. Utilizzare tre su e giù passa da direzioni alterne, con ogni passaggio prendendo circa 10 sec. </li><li> Tagliare la parte superiore e la parte inferiore dei cavi ferita. Le quattro fili sono intrecciati und fuse ad una estremità ma separare all&#39;altra. </li><li> Aggiungere il tubo portante. Tagliare una lunghezza di 30 centimetri di tubo di polietilene (diametro interno 0,28 millimetri, al di fuori 0,61 millimetri). Infilare il tetrodo molto lentamente e con attenzione nel tubo di supporto in modo da non piegare. </li><li> Una volta che l&#39;estremità fusa appare dal lato opposto, tirarlo attraverso modo che ci sia una lunghezza uguale di filo ad entrambe le estremità del tubo di guida. </li><li> Afferra la fine separata di ciascun filo con una pinza. Utilizzando la base della fiamma di un bruciatore a gas, bruciare con attenzione l&#39;isolamento off dell&#39;ultimo 2 o 3 mm di ciascun filo. Riscaldare il filo fino a quando non brilla, ma non arricciare. </li><li> Collegare il tetrodo con un maschio-femmina IC presa adattatore che si inserisce il dispositivo di registrazione. Mettere fine deinsulated di ciascun filo in una presa diversa della scheda con una pinza. Stabilizzare il filo nella presa con un piccolo perno in ottone. Utilizzare una punta fine saldatore e riempire il portalampada con la saldatura fusa. Fare attenzione a non contattareil filo fragile con il saldatore. </li><li> Controllare l&#39;impedenza di ciascun filo e l&#39;inter impedenza di ciascuna coppia di fili. <ol><li> Posizionare il fuso, fine ritorto in un contenitore di soluzione fisiologica e collegare un filo conduttore di rame dalla soluzione salina allo strumento ohm. </li><li> Collegare l&#39;altra estremità del metro al pin presa contenente il filo. L&#39;impedenza di ciascun filo deve essere inferiore a 3 mW. </li><li> Se i valori di cui sopra non vengono raggiunti, riprovare le connessioni di saldatura. </li><li> Rimuovere i fili dal salino, sciacquare le punte con acqua, e testare l&#39;impedenza del filo tra per ogni associazione (n = 6). L&#39;impedenza tra deve essere superiore a 5 mW. </li><li> Se i valori di cui sopra non vengono raggiunti, tagliare una piccola quantità della punta fino alla fine fuso e ripetere il test. </li><li> Scartare qualsiasi insieme filo che non soddisfa entrambi i requisiti di impedenza per tutti i fili. </li></ol></li><li> Fissare il tetrodo. <ol><li> Piegare una piccola scatola di carta rettangolare SLIGhtly più grande della presa adattatore. </li><li> Trasferire l&#39;adattatore nella scatola con il lato maschio in basso. Penetrazione dell&#39;acqua in modo tale che tutti i pin del lato maschio sono fuori area mentre il resto della scheda è all&#39;interno della scatola. </li><li> Nastro angoli della scatola all&#39;esterno. Utilizzare piccoli pezzi di nastro adesivo a doppia facciata all&#39;interno della scatola per stabilizzare eventuali singoli fili di filo. Il filo deve essere protetta in quanto esce dalla scatola. </li><li> Mescolare velocemente set 2 parte epossidica e versare nella casella per fissare l&#39;adattatore e tutti i cavi. </li><li> Attaccare l&#39;estremità vicina del tubo resoconto di un lato della scatola con cera dentale ma lasciano il tubo aprire tale che il tetrodo può essere tirato attraverso banche alle due estremità. </li></ol></li><li> Contrasta il tetrodo. <ol><li> Prima di ogni esperimento, tagliare la punta del tetrodo con una lama di bisturi affilato, non forbici. Questo impedisce frantumazione e divaricazione del filo termina fornendo un bordo piatto per la fase successiva. <ol&gt; <li> Utilizzare un piccolo utensile rotante montato verticalmente con i dischi di levigatura media e fine grana (questi possono essere combinati su una piattaforma) per lucidare il tetrodo e rimuovere alcuni isolamento punta. Tenere il fascio vicino alla sua estremità con una pinza. Inclinare la fine impostare legare ad un angolo di 45 ° rispetto al disco abrasivo e toccare delicatamente il disco rotante velocità moderata per circa 1 o 2 sec ciascuno sul supporto e poi le belle grane. Ripetere questo tre volte di più, la rotazione assiale del fascio di 90 ° ogni volta. E &#39;fondamentale che la direzione di rotazione dei dischi abrasivi è fuori l&#39;angolo delle estremità del filo superficiale, altrimenti separazione dei fili può verificarsi. </li><li> Il risultato desiderato trasforma l&#39;estremità fascio da un regolo di una punta con piccole quantità di isolante rimosso dall&#39;estremità di ciascun filo. Verificare il punto utilizzando un microscopio da dissezione prima placcatura tetrodo. Se qualche sfilacciamento si verifica sulla punta, ripassare e rilucidare. </li><li> Se il test di impedenza durante il subsequpasso placcatura ent mostra valori filo interrelazioni estremamente basse (meno di 4 mW), indica troppo materiale rimosso durante la fase di lucidatura. Recut e rilucidare il tetrodo. </li></ol></li><li> Piatto tetrodo. Mettere la punta del tetrodo in una soluzione satura di solfato di rame (acqua 85 ml, 5 ml di acido solforico, 50 g di solfato di rame). Piastra ogni filo con una corrente di 2,5 μA con un isolatore stimolo. Iniettare la corrente per 1 sec, una pausa di 1 sec e ripetere questo processo 4x. </li><li> Controllare l&#39;impedenza di ciascun filo e la interimpedance di ciascuna coppia di fili. L&#39;impedenza di ciascun filo deve essere compresa tra 0,5-1 mW e tra l&#39;impedenza deve essere superiore a 4 mW. </li><li> Montare l&#39;adattatore sulla headstage di un sistema di registrazione multicanale. </li><li> Collegare un pin insetto piegato per un micromanipolatore. Fissare la punta del tetrodo al pin insetto con impronte dentarie </li></ol></li></ol> 2. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare l&#39;scarafaggio con ghiaccio. </li><li> Dopo lo scarafaggio smette di muoversi, frenare lo scarafaggio verticale su una superficie di sughero piatta con grandi perni sella a cavallo che l&#39;insetto, ma non penetrano qualsiasi parte del suo corpo. </li><li> Trasferire il preparato in un contenitore di plastica e posizionare ghiaccio intorno all&#39;animale di minimizzare il flusso di sangue e movimenti del corpo. </li><li> Posizionare un collare di plastica al collo per sostenere la testa e mettere la cera dentale intorno alla testa per stabilizzarlo. </li><li> Tagliare una piccola finestra tra il ocelli con una lama di rasoio e rimuovere la cuticola dalla testa. </li><li> Rimuovere i tessuti connettivi e grassi con una pinza per esporre il cervello. </li><li> Mettere un po &#39;di soluzione salina scarafaggio nella capsula testa per coprire il tessuto cerebrale. </li><li> Per desheath cervello, utilizzare una pinza sottile per afferrare delicatamente la guaina sulla parte superiore del cervello e utilizzare un altro pinza sottile strappare la guaina a parte nella zona impiantato filo. </li><li> Aprire un piccolo foro nella testa capsula anteriore per l&#39;arguzia cervelloh un pin insetto. Inserire una treccia di tre diametri più grandi (56 micron) isolati fili di rame nel foro per servire come un elettrodo di riferimento / massa. </li><li> Abbassare la punta del tetrodo alla superficie del cervello con micromanipolatore e posizionarlo vicino alla regione del cervello di interesse. </li><li> Posizionare con cura due piccoli pezzi di foglio di acetato sottile (2 millimetri x 1 mm), leggermente più grande del foro nella capsula testa, anteriore e posteriore al tetrodo. </li><li> Accendere il sistema di registrazione. </li><li> Abbassare lentamente il tetrodo 150-250 micron sotto la superficie del cervello a seconda della qualità di registrazione. </li><li> Spegnere il sistema di registrazione. </li><li> Spostare i due pezzi di lamiera acetato più vicino al tetrodo possibile senza toccarlo (Figura 1A). </li><li> Scaldare una piccola spatola o appiattita ago ipodermico e metterlo in cera dentale tale che vi sia cera liquida sulla punta della spatola. Toccare con attenzione il fondo di ogni pezzo di foglio di acetato dallatetrodo con la spatola in modo che la cera liquida può affluire su ogni pezzo e sigillare il divario tra essa e la cuticola testa. </li><li> Ripetere passo 2.16. Drop un piccola quantità di cera liquida sul foglio di acetato di volta in volta. Avviare il processo lontano dal tetrodo e muoversi gradualmente verso di esso. Alla fine il tetrodo sarà ancorato da impronte dentarie. Evitare di entrare cera calda nella cavità e sul cervello. </li><li> Utilizzare lo stesso metodo passaggi 2.16 e 2.17 per ancorare l&#39;elettrodo di riferimento / terra con cera. </li><li> Riscaldare la cera che attribuisce tetrodo al micromanipolatore per rilasciare il tetrodo da esso. </li><li> Loop tetrodo nella cera dentale sulla testa per fornire un sollievo strain (Figura 1B). </li><li> Coprire il ciclo antistrappo con cera dentale (Figura 1C). </li><li> Rimuovere con attenzione i vincoli e trasferire la preparazione su una piastra di Petri. Frena la parte di preparazione dorsale con grandi perni sella. </li><li> Allegareun&#39;asta per il pronoto utilizzando una pistola per colla. Questo è un bastone di legno che si estende dal pronoto sopra l&#39;addome. </li><li> Fissare la punta del tubo tetrodo alla estremità posteriore della barra con cera dentale. </li><li> Ancorare il tetrodo e l&#39;elettrodo di riferimento / terra per l&#39;estremità anteriore della canna con la cera dentale. </li><li> Estrarre il tetrodo dal terminale del tubo, per quanto possibile, ma non tirare su di esso, in modo da eliminare la possibilità che l&#39;animale può danneggiare la parte del tetrodo fuori del tubo (Figura 1D). </li><li> Rimuovere tutti i vincoli. Fissare l&#39;elettrodo di riferimento / terra per il tubo tetrodo con cera dentale. </li><li> Attendere almeno 60 minuti per consentire all&#39;animale di riprendersi dall&#39;anestesia ghiaccio prima di ogni esperimento. </li></ol> 3. Procedure sperimentali <ol><li> Collegare un PC sia con il sistema di registrazione e di una luce a LED utilizzando un cavo USB per porta seriale. </li><li> Iniziate le registrazioni neurali. </li><li>Inizia registrazioni video a 20 fotogrammi al secondo per camminare esperimenti utilizzando il pacchetto di acquisizione di immagini Motmot 16 o 120 fps per salire esperimenti utilizzando una telecamera ad alta velocità. </li><li> Posizionare lo scarafaggio in un 40 centimetri x 40 centimetri plexiglas arena per esperimenti a piedi o A 58 cm di lunghezza, 5 cm di larghezza e 5 cm di altezza arena per l&#39;arrampicata esperimenti. Il walking arena ha una barriera trasparente che si estende dal centro della parete destra al centro dell&#39;arena, sopra il quale si trova il headstage. La barriera è usato per impedire agli animali di camminare in zone in cui la telecamera è bloccata dal headstage. L&#39;Arena arrampicata ha un blocco acrilico (sia 1,2 centimetri o alta 1,8 centimetri e larga 5 cm) o una mensola situata ad un&#39;altezza paragonabile al centro. </li><li> Genera un impulso TTL dal PC utilizzando un comando MATLAB personalizzata. (S = di serie (&#39;COM4&#39;); fopen (s); s.RequestToSend = &#39;off&#39; / s.RequestToSend = &#39;on&#39; /; fclose (s), delete (s) ;). L&#39;impulso TTL genera voltetamp per il sistema di registrazione e sia accende o si spegne la luce del LED. </li><li> Lasciare lo scarafaggio per esplorare la scena fino a quando non si ferma per più di 30 secondi per esperimenti a piedi. Lasciare lo scarafaggio a uno scavalcare il blocco / scaffale o tunnel attraverso la piattaforma per l&#39;arrampicata esperimenti. </li><li> Smettere di registrazioni video. </li><li> Smettere di registrazioni neurali. </li><li> Annotare il timestamp generato dal impulso TTL. </li><li> Rimuovere lo scarafaggio dall&#39;arena e attendere almeno 3 minuti. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,10 per la prova successiva. </li><li> Una volta che tutte le registrazioni sono state completate, passare 5 sec di corrente 5 μA DC attraverso una delle estremità del filo (anodo) e l&#39;elettrodo di riferimento (catodo) per depositare rame nel cervello sulla punta del filo. </li></ol> 4. Analisi Offline <ol><li> Sincronizzare video e dati neurali collegando il fotogramma in cui si accende la luce LED e il timestamp registrato dal sistema di registrazione aquel momento. </li><li> Segna località punta del filo. Utilizzare le procedure intensificazione Timms per precipitare e osservare il rame in 12 sezioni micron di serie 17. Depositi prominenti dovrebbero essere visibili in 3-8 sezioni adiacenti (circa 18-48% della lunghezza del piano ventrale dorsale della zona abbiamo da registrare) (Figura 2). </li><li> Correlare specifici impulsi elettrici per l&#39;attività dei singoli neuroni. Seguire picco procedure di selezione indicate nel dettaglio altrove 10,14,18. Utilizzare il programma KlustaKwik (versione 1.5, autore K. Harris, Rutgers University) per generare iniziale, clustering automatico. Importarli nel programma MClust (versione 3.5, gli autori AD Redish et al., University of Minnesota) per un ulteriore affinamento e l&#39;analisi (Figura 3). </li><li> Seguire i movimenti del scarafaggio. Per camminare esperimenti, estrarre la posizione di (visivo), il centro di scarafaggio della massa e del suo orientamento corpo in ogni fotogramma del vidregistrazioni eo utilizzando il Caltech multipla Fly Tracker (versione 0.1.5.6, http://ctrax.sourceforge.net/) e il FixErrors toolbox associato per MATLAB 19. Per l&#39;arrampicata esperimenti, estrarre la posizione del blocco e la testa del scarafaggio e pronoto in ogni fotogramma del video utilizzando il pacchetto software di analisi del movimento. </li></ol>

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Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

Mentre precedenti studi elettrofisiologici sulla CC o di altre regioni del cervello dell&#39;insetto ci hanno fornito intuizioni nella centrale di controllo del comportamento, la maggior parte di loro sono stati eseguiti sia in preparazioni trattenuti 9,11 o quelli frenati 10,14. Come risultato, dell&#39;animale esperienza sensoriale e lo stato fisiologico potrebbe essere molto diverse da quelle in un ambiente naturale. Inoltre, i compiti comportamentali che l&#39;animale può eseguire soltanto un ...

Questo articolo descrive un sistema di successo per la registrazione dai neuroni all&#39;interno del complesso centrale (CC), della scarafaggio, discoidalis Blaberus, come l&#39;insetto entra in un&#39;arena e si occupa di oggetti che causano a girarsi, tunnel sotto o scavalcare ostacoli. I fili possono essere collegati ad uno stimolatore per evocare attività nel neuropil circostante con cambiamenti comportamentali conseguenti. Negli ultimi dieci anni grande attenzione è stata rivolta ai ruoli svolti dalle varie regioni del cervello a controllare il comportamento degli insetti. Gran parte di questa attenzione è stata rivolta verso la linea mediana neuropils cerebrali che sono indicate collettivamente come il complesso centrale (CC). Progressi sono stati compiuti a seguito di ampia varietà di tecniche rivolte domande sul ruolo del CC nel comportamento. Tali tecniche vanno da manipolazioni neurogenetici, principalmente in Drosophila, accoppiato con behavianalisi orale 1-3, a tecniche elettrofisiologiche che monitorano l&#39;attività neurale all&#39;interno del CC e il tentativo di mettere in relazione tale attività ai parametri comportamentale rilevanti. Tecniche elettrofisiologiche includono la registrazione intracellulare da singoli neuroni identificati 4-9 e registrazione extracellulare, spesso con sonde multicanale 10,11. Queste due tecniche sono gratuiti. Registrazione intracellulare con elettrodi taglienti o cerotto cellula intera fornisce dati molto dettagliati sui neuroni identificati, ma si limita a una o due celle contemporaneamente, richiede limitato o nessun movimento, e può essere mantenuta per periodi relativamente brevi di tempo. Registrazioni extracellulari possono essere facilmente impostati, non richiedono moderazione, e può essere mantenuta per ore. Con tetrodi multicanale e taglio cluster, abbastanza grandi popolazioni di neuroni possono essere analizzati simultaneamente 9,12. Mentre tutta PATC cellulareh è stato utilizzato con successo negli insetti tethered 13, riteniamo che ci sia anche la necessità di tecniche che ci permettono di registrare l&#39;attività neurale del cervello per lunghi periodi di tempo in banche comportarsi insetti hanno a che fare con le barriere al movimento in avanti. La necessità di registrare come l&#39;insetto si muove e rimbalza su e giù ci ha spinto verso metodi di registrazione extracellulari. Abbiamo avuto successo in buona registrazione preparazioni trattenuto con commercialmente disponibili sonde 16 canali silicio 11, tuttavia le piccole dimensioni anche di grandi scarafaggi significa che le sonde devono essere montati dal corpo. Questo, insieme con la delicatezza dei denti sonda, fatta inadeguate per una preparazione gratuita piedi. In due precedenti progetti, abbiamo utilizzato fasci di fili sottili che formano un tetrodo per compiere proprietà di registrazione simili, ma in una disposizione più robusto. Questi bundle tetrode ci ha permesso di registrare da scarafaggi frenati und riguardano l&#39;attività dell&#39;unità CC ai cambiamenti nella velocità di marcia 14 e girando comportamento risultante dal contatto antenne con una canna 10. Utile come queste preparazioni tethered sono stati e continueranno ad essere, fanno presentare alcune limitazioni. In primo luogo, i comportamenti che l&#39;insetto può eseguire soltanto un piano. Cioè, potremmo facilmente evocare cambiamenti nella velocità di camminata o di svolta, ma le azioni di arrampicata e tunnel non fosse possibile, almeno con la disposizione tipica cavezza. In secondo luogo, la nostra preparazione frenati sono &quot;a ciclo aperto&quot;. Cioè, non consentono il normale movimento correlata feedback al sistema. Così, come lo scarafaggio acceso nostra tether, il suo mondo visivo non è stata modificata di conseguenza. E &#39;possibile costruire sistemi ad anello cavezza chiusi per introdurre questo tipo di feedback. Tuttavia, essi sono limitate dalla complessità della programmazione e hardware dell&#39;ambiente visivo simulato. Nevertheless, abbiamo sentito che potevamo migliorare i nostri metodi di registrazione frenati esistenti registrando dall&#39;animale mentre camminava liberamente in un&#39;arena o pista e oggetti che si incontrano come sarebbe nel suo ambiente naturale. Sebbene sistemi wireless per registrare l&#39;attività cerebrale 15 sarebbe ideale, sistemi attuali hanno limitazioni nel numero di canali di registrazione, il tempo di acquisizione dei dati, la durata della batteria e peso. Abbiamo, quindi, deciso di provare a migliorare il nostro sistema di registrazione tethered per l&#39;uso in muoversi liberamente preparati. Poichè i migliori sistemi wireless saranno disponibili, questa tecnica può essere facilmente adattato a tali dispositivi. Il sistema che viene descritto in questo articolo è leggero, funziona molto bene e sembra avere un effetto deleterio sul comportamento del scarafaggio. Con una telecamera ad alta velocità poco costoso e software di taglio cluster, l&#39;attività di singoli neuroni del cervello può essere legato al movimento. Qui si descrive la prepazione dei fili tetrode e il loro impianto nel cervello dell&#39;insetto nonché tecniche di registrazione per attività elettrica e di movimento e come tali dati possono essere riuniti per successive analisi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="728">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:207px;">Nichrome wire&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Sandvik Heating Technology</td>
			<td style="width:137px;">Kanthal RO-800</td>
			<td style="width:205px;">Use for tetrode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biomedical polyethylene tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>800700</td>
			<td>Use for tetrode tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lynx-8</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td></td>
			<td>Use for multi-unit recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cheetah 32</td>
			<td>Neuralynx</td>
			<td></td>
			<td>Use for multi-unit recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High speed camera</td>
			<td>Basler</td>
			<td>A602f</td>
			<td>Use fir video recording for walking experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High speed camera</td>
			<td>Casio</td>
			<td>EX-FC150&#160;</td>
			<td>Use for video recording for climbing experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WINanalyze</td>
			<td>Winanalyze</td>
			<td>version 1.4 3D</td>
			<td>Use for video tracking&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>MATLAB R2012b</td>
			<td>Use for TTL pulse generation and off-line data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects

Crescente interesse per il ruolo di attività cerebrale nel controllo degli insetti motore richiede che saremo in grado di monitorare l&#39;attività neurale, mentre gli insetti eseguono comportamento naturale. Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci hanno permesso di registrare l&#39;attività da più neuroni contemporaneamente, mentre uno scarafaggio tethered acceso o la velocità alterata piedi. Mentre un grande passo avanti, preparati frenati fornire l&#39;accesso a comportamenti limitati e spesso non hanno processi di feedback che si verificano nel muoversi liberamente animali. Presentiamo ora una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare dal complesso centrale di muoversi liberamente scarafaggi mentre camminano in un&#39;arena e affrontare le barriere ruotando, arrampicata o tunneling. Accoppiato con video ad alta velocità e taglio cluster, ora possiamo riguardare l&#39;attività cerebrale di vari parametri del movimento degli insetti banche si comportano.

Abbiamo registrato l&#39;attività neurale di 50 unità dal CC in 27 preparazioni per esperimenti a piedi. Per 15 di questi preparati (23 unità), sono stati eseguiti esperimenti di arrampicata. Le singole unità sono denominati in base ai numeri di preparazione e di unità (ad esempio unità 1-2 indica di preparazione 1, 2 unità). Istantanee del video di una prova arrampicata sono mostrati in Figura 4. L&#39;intero video è disponibile in supplementare Vid...

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Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci permette di monitorare l&#39;attività in singole unità di scarafaggi frenati. Qui vi presentiamo una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare anche l&#39;attività cerebrale nel muoversi liberamente insetti.

Extracellulare Wire Tetrode registrazione in Brain di Liberamente Walking Insetti

Increasing interest in the role of brain activity in insect motor control requires that we be able to monitor neural activity while insects perform ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K Views.  Case Western Reserve University.  Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci permette di monitorare l'attività in singole unità di scarafaggi frenati. Qui vi presentiamo una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare anche l'attività cerebrale nel muoversi liberamente insetti. 

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Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Ricerca

Neuroscienze

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed single-neuron activity while animals are acquiring an operantly conditioned response, or when that response is extinguished. But even in these cases, observation periods usually encompass only a single stage of learning, i.e. acquisition or extinction, but not both (exceptions include protocols employing reversal learning; see Bingman&#160;et al.1 for an example). However, acquisition and extinction entail different learning mechanisms and are therefore expected to be accompanied by different types and/or loci of neural plasticity.
Accordingly, we developed a behavioral paradigm which institutes three stages of learning in a single behavioral session and which is well suited for the simultaneous recording of single neurons&#39; action potentials. Animals are trained on a single-interval forced choice task which requires mapping each of two possible choice responses to the presentation of different novel visual stimuli (acquisition). After having reached a predefined performance criterion, one of the two choice responses is no longer reinforced (extinction). Following a certain decrement in performance level, correct responses are reinforced again (reacquisition). By using a new set of stimuli in every session, animals can undergo the acquisition-extinction-reacquisition process repeatedly. Because all three stages of learning occur in a single behavioral session, the paradigm is ideal for the simultaneous observation of the spiking output of multiple single neurons. We use pigeons as model systems, but the task can easily be adapted to any other species capable of conditioned discrimination learning.

Recording Single Neurons&#039; Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

Learning new stimulus-response associations engages a wide range of neural processes which are ultimately reflected in changing spike output of individual neurons. Here we describe a behavioral protocol allowing for the continuous registration of single-neuron activity while animals acquire, extinguish, and reacquire a conditioned response within a single experimental session.

Registrazione di potenziali d&#39;azione singoli neuroni &#39;di muoversi liberamente Piccioni attraverso tre fasi di apprendimento

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such as epilepsy and neurodegenerative disorders. However, it is technically difficult to obtain EEG recordings in neonates as it requires specialized handling and great care. Here, we present a novel method to record EEG in neonatal rat pups (P8-P15). We designed a simple and reliable electrode using computer pin loci; it can be easily implanted into the skull of a rat pup to record high-quality EEG signals in the normal and epileptic brain. Pups were given an intraperitoneal (i.p.) injection of the neurotoxin kainic acid (KA) to induce epileptic seizures. The surgical implantation performed in this procedure is less expensive than other EEG procedures for neonates. This method allows one to record high-quality and stable EEG signals for more than 1 week. Furthermore, this procedure can also be applied to adult rats and mice to study epilepsy or other neurological disorders.

Here, we introduce a novel technique designed to record electroencephalography (EEG) in freely moving neonatal epileptic pups and describe its procedures, features, and applications. This method allows one to record EEG for more than 1 week.

Registrazione di EEG nei ratti neonatali liberamente in movimento utilizzando un metodo novello

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Costruzione di un Hyperdrive multi-tetrodo migliorata per la registrazione su larga scala neurale nel comportarsi ratti

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, conventional microdrive designs often only allow use of one type of electrode to record from single or multiple regions, limiting the yield of single-unit or depth profile recordings. It also often limits the ability to combine electrode recordings with optogenetic tools to target pathway and/or cell type specific activity. Presented here is a hybrid microdrive array for freely moving mice to optimize yield and a description of its fabrication and reuse of the microdrive array. The current design employs nine tetrodes and one opto-silicon probe implanted in two different brain areas simultaneously in freely moving mice. The tetrodes and the opto-silicon probe are independently adjustable along the dorsoventral axis in the brain to maximize the yield of unit and oscillatory activities. This microdrive array also incorporates a set-up for light, mediating optogenetic manipulation to investigate the regional- or cell type-specific responses and functions of long-range neural circuits. In addition, the opto-silicon probe can be safely recovered and reused after each experiment. Because the microdrive array consists of 3D-printed parts, the design of microdrives can be easily modified to accommodate various settings. First described is the design of the microdrive array and how to attach the optical fiber to a silicon probe for optogenetics experiments, followed by fabrication of the tetrode bundle and implantation of the array into a mouse brain. The recording of local field potentials and unit spiking combined with optogenetic stimulation also demonstrate feasibility of the microdrive array system in freely moving mice.

This protocol describes the construction of a hybrid microdrive array that allows implantation of nine independently adjustable tetrodes and one adjustable opto-silicon probe in two brain regions in freely moving mice. Also demonstrated is a method for safely recovering and reusing the opto-silicon probe for multiple purposes.

Sistema microdrive ibrido con sonda Opto-Silicon recuperabile e tetrode per la registrazione ad alta densità a doppio sito in mouse in movimento libero

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

Fotometria multifibra per registrare l'attività neurale in animali liberamente

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

Registrazione elettrofisiologica wireless dei neuroni da tetrodi mobili in pesci che nuotano liberamente

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

Impianto di micro-drive per la registrazione dell'attività neurale quotidiana nei topi giovani

A Lightweight Drive Implant for Chronic Tetrode Recordings in Juvenile Mice

In vivo electrophysiology provides unparalleled insight into the sub-second-level circuit dynamics of the intact brain and represents a method of particular importance for studying mouse models of human neuropsychiatric disorders. However, such methods often require large cranial implants, which cannot be used in mice at early developmental time points. As such, virtually no studies of in vivo physiology have been performed in freely behaving infant or juvenile mice, despite the fact that a better understanding of neurological development in this critical window would likely provide unique insights into age-dependent developmental disorders such as autism or schizophrenia. Here, a micro-drive design, surgical implantation procedure, and post-surgery recovery strategy are described that allow for chronic field and single-unit recordings from multiple brain regions simultaneously in mice as they age from postnatal day 20 (p20) to postnatal day 60 (p60) and beyond, a time window roughly corresponding to the human ages of 2 years old through to adulthood. The number of recording electrodes and final recording sites can be easily modified and expanded, thus allowing flexible experimental control of the in vivo monitoring of behavior- or disease-relevant brain regions across development.

Autore in primo piano: Un impianto di propulsione leggero per registrazioni croniche di tetrodi in topi giovani  

Here, we describe a micro-drive design, surgical implantation procedure, and post-surgery recovery strategy that allow for chronic field and single-unit recordings from multiple brain regions simultaneously in juvenile and adolescent mice across a critical developmental window from postnatal day 20 (p20) to postnatal day 60 (p60) and beyond.