Trabalho no laboratório envolvendo a cultura de neurônios Aplysia é financiado pelo NIH lista R01 e R21MH077921 NIH.

Preparação (ver secção de soluções no final do protocolo para a composição de soluções) <ol><li> Preparar pratos cultura. Revestimento de vidro bem de Mattek placa de cultura com fundo de vidro com poli-l-lisina (feita em borato de sódio). Adicione o suficiente para cobrir completamente o vidro bem e deixe por&gt; 1h (pode ser deixado durante a noite). Remover completamente o poli-l-lisina por lavagem em água do mar artificial vezes (ASW) 4-5. Após a remoção da última lavagem, adicionar 2 ml de 50% L15 (suplementada com sais e contendo L-glutamina na concentração final de 2mM) / hemolinfa de 50%. Este meio de cultura deve estar no prato, pelo menos, uma hora antes do revestimento de células para que os casacos de hemolinfa do prato. </li><li> Limpar as ferramentas e pratos Sylgard com etanol, lavá-los abundantemente com DDH 2 0 e, em seguida, colocá-los para&gt; 1 hora sob uma luz UV na capa cultura. </li><li> Prepare eletrodos afiada para microdissecção de neurônios. Utilizando um extrator de microeletrodos (por exemplo, Sutter Flaming Brown P-97), puxe eletrodos pipeta de vidro com 1,5 mm de diâmetro exterior, 0,86-1,12 mm de diâmetro interno e 100 mm de comprimento (por exemplo, AM catálogo do sistema # 628000; Instrumentos de Precisão Mundial TW150-4, 1,55 / 1,12). Use os parâmetros que produzem um eletrodo com uma ponta longa e fina wispy de alta resistência tal que não há a ingestão de líquido capilar quando colocados em solução. A presença de um menisco líquido significa que a ponta do eletrodo pode danificar neurônios durante o isolamento. O livro de receitas eletrodo Sutter fornece diretrizes excelentes para a criação de programas de eletrodo. Usamos um filamento de caixa, e um passo-pull para gerar eletrodos cultura. </li><li> Prepare solução anestésica (0,35 M MgCl2), meio de cultura (L15 suplementada com sais e hemolinfa), e solução de protease (1% protease tipo IX, Sigma, uma unidade / mg, para uma concentração final de 10 unidades / ml). </li><li> Animais: uso adulto 80-100 g Aplysia para o isolamento de neurônios sensoriais e de neurônios LFS motor. Use juvenil 1-4 g Aplysia para isolamento de L7 neurônios motores. Remova suavemente os animais dos tanques de água do mar, e manter na água do mar (em balde de copo, ou saco plástico) para não mais que 30 minutos antes do início da anestesia eo procedimento cultura. </li></ol> Procedimento de cultura Cultivar A. pleural neurônios sensoriais 80-100 g Aplysia <ol><li> Anestesiar os animais para a remoção de gânglios: Inject 0,35 M MgCl 2 em adultos Aplysia (80-100 g), utilizando uma seringa de 60 ml com uma agulha 18 gauge 1,5 polegada. Digite o pé do animal em um ângulo de aproximadamente 35 graus, e não entrar muito profundamente. O objetivo é injetar no hemocele do animal sem penetrar os órgãos internos. O animal deve tornar-se muito distendido e relaxado. </li><li> Dissecar os gânglios: Pin do animal anestesiado em um prato de dissecação, com um pino (18-gauge agulhas funcionam bem para animais 80-100 g) na cabeça ea cauda, ​​eo pé virado para cima. Segure o pé com uma pinça dentada e corte através da pele e do tecido conjuntivo subjacente a todo o comprimento do pé (da cabeça à cauda) com uma tesoura cirúrgica. Pin os dois lados para baixo. Usando uma pinça e tesoura, corte o esôfago e puxar para o lado para expor os gânglios. Usando uma pinça e tesouras bem fina, cortar o pedal gânglios pleural (os neurônios sensoriais são nos gânglios pleural). Deixar uma boa quantidade de nervos uma vez que este torna mais fácil de definir os gânglios após o tratamento protease. </li><li> Digestão protease de gânglios: Coloque os gânglios em solução protease (10 mg / ml de 1 unidade / mg em L15) em um conjunto de incubadora a 34,5 ° C (34-35 ° C está bem) durante 2 horas e 15min. Usando a pinça de ponta fina para transferir e lavar os gânglios no ASW três vezes. Mantenha os gânglios no L15. Note-se que o tempo de incubação pode variar de protease. O objetivo é permitir que o tecido conjuntivo que podem ser facilmente removidos. Se for muito difícil desheath gânglios sem danificar os neurônios, aumentar o tempo de incubação protease. Se ele é extremamente fácil de desheath os gânglios e os neurônios são &quot;moles&quot;, e reduzir o tempo de incubação protease. </li><li> Desheathing os gânglios: Transferência da protease-digerida gânglios a uma 60 mm ou 35 milímetros prato contendo Sylgard e L15. Visualização sob um estereomicroscópio (com iluminação halógena externo), retire pedal gânglios e fechar os gânglios pleural no prato Sylgard na orientação correta utilizando os pinos de insetos e uma pinça fina. Com a pinça fina e uma tesoura cirúrgica Vanna, levante cuidadosamente o tecido conjuntivo e cortá-la para expor o cluster sensorial. Tenha cuidado para não tocar ou danificar sempre o somata neuronal. Remova qualquer excesso de tecido conjuntivo do prato e adicione mais meio, certificando-se de nunca expor o gânglio desheathed ao ar. O cluster sensorial consiste de aproximadamente 200 neurônios agrupados de 40-50 mícron de diâmetro. Definir um alfinete para fazer um &quot;post&quot; em uma curta distância do Ganglion (dentro do campo de visão). </li><li> Isolamento de neurônios: Usando longos, eletrodo de vidro cultura afiada, retire os neurônios identificados um a um, tocando o corpo da célula apenas fora do centro (não empalar) e lenta e progressivamente puxando a soma das células, juntamente com o axônio, longe do ganglionares. Bata suavemente contra o pino para desalojar os neurônios do eletrodo. </li><li> Neurônios chapeamento: Use um Pipetman (P10) para transferir os neurônios individuais do prato Sylgard a uma placa de cultura. Antes de transferir os neurônios, meio de cultura pipeta na ponta, para que a ponta de plástico é revestido com hemolinfa (o que impede os neurônios de degola para o plástico). Tome muito cuidado para evitar expor os neurônios para as bolhas de ar ou de quaisquer forças extremas (isto é, tomar muito cuidado para cima e remova os neurônios do pipetteman). Distribuir os neurônios uniformemente ao longo do prato. Use um eletrodo afiado para suavemente em linha reta os processos e toque-os para o fundo. </li><li> Incubação: Deixe os pratos no palco microscópio em temperatura ambiente por não menos de três horas. Rotineiramente, deixá-los durante a noite. Certifique-se que o estágio do microscópio é imperturbável durante este período. Cobrir o palco com folha de alumínio para proteger da luz. Gentilmente transferi-los para um jovem de 18 ° C incubadora. </li><li> Culturas devem aderir ao prato dentro de aproximadamente 3 horas e crescimento neurite novos devem ser visíveis dentro de cerca de 12/06 horas. O crescimento de neurônios sensoriais isoladas atinge um platô por DIV de 3 ou 4. Note-se que isolados neurônios sensoriais não doe autapses forma ou sinapses químicas uns com os outros, embora eles junções gap forma elétrica. </li></ol> B. Elaboração de neurônio sensorial-motor neurônio cocultures Neurônios sensoriais formam sinapse com os neurônios motores na cultura alvo. Os neurônios motores mais utilizados são os neurônios LFS motor eo L7 neurônio motor, do gânglio abdominal. Os neurônios LFS motor são isolados de adultos (80-100 g) Aplysia, e há cerca de 20 neurônios motores LFS por gânglio abdominal. O L7 do neurônio motor é isolado de juvenis (1-4 g) os animais, e há apenas um L7 por gânglios abdominal. LFS neurônios motores são de 40-50 mícrons de diâmetro, são intercaladas entre os neurônios sensoriais LE perto da raiz do nervo sifão na superfície ventral dos gânglios abdominal, e são caracterizadas por uma mancha de pigmento escuro sutis em cada soma. O L7 do neurônio motor é 100-150 mícrons de diâmetro e está presente na superfície dorsal do gânglio, na borda meio do lado esquerdo do gânglio. Embora seja mais econômico usar neurônios LFS motor, o grande tamanho do L7 do neurônio motor é vantajoso para algumas experiências. O L11 do neurônio motor, também na superfície dorsal esquerda do gânglio abdominal, caudal de L7, é um não-alvo do neurônio motor e pode ser efetivamente usado como um controle com o qual o neurônio sensorial fasciculates mas não formam sinapses químicas. <ol><li> Anestesiar os animais para a remoção de gânglios. Para os neurônios LFS motor, faça como descrito para pleural neurônios sensoriais. L7 para os neurônios motores, injetar 0,35 M MgCl 2 em juvenis Aplysia (1-4 g), utilizando uma seringa de 10 ml com uma agulha calibre 21. </li><li> Dissecar o gânglio abdominal: Pin do animal anestesiado em um prato de dissecação, como descrito acima (usando 21 agulhas para animais jovens). Usando uma pinça e tesouras bem fina, cortar os gânglios abdominais. </li><li> Digestão protease de gânglios: Isso é feito como descrito para pleural neurônios sensoriais, exceto que o tempo de digestão é reduzido para 1 hora e 45 min para gânglios da juvenil (1-4 g) animais. </li><li> Desheathing os gânglios: Transferência da protease-digerida gânglios a um prato de 35 mm ou 60 contendo Sylgard e L15. Visualização sob um estereomicroscópio (com iluminação halógena externo), nos gânglios no recipiente Sylgard na orientação correta utilizando os pinos de insetos e uma pinça fina. Com a pinça fina e uma tesoura cirúrgica Vanna, levante cuidadosamente o tecido conjuntivo e cortá-la para expor os corpos celulares neuronais. Para isolar os neurônios LFS motor, pino do gânglio modo que a superfície ventral é voltada para cima, e com uma pinça puxe a bainha de tecido conjuntivo para trás para expor toda a metade do gânglio contendo o LFS neurônios motores (à direita), o desheath restantes partes do gânglio, remover qualquer tecido conjuntivo da cápsula e adicionar mais L15. Para isolar o L7 ou L11 do neurônio motor, pino do gânglio modo que a superfície dorsal está virada para cima, e com uma pinça puxe a bainha de tecido conjuntivo para trás para expor a metade do gânglio contendo tanto L7 e L11 (a sua esquerda). Tenha cuidado para não tocar ou danificar sempre o somata neuronal. Coloque um alfinete para fazer um &quot;post&quot; a uma curta distância do gânglio (dentro do campo de visão). </li><li> Isolamento de neurônios: Remove os neurônios com um eletrodo afiado como descrito para os neurônios sensoriais. Os neurônios são LFS differentiated de neurônios vizinhos LE sensorial com base em um lugar pequeno e escuro pigmento em sua somata. O neurônio L7 pode ser diferenciado do neurônio L11 primeiro porque o L11 é caudal a L7, porque o corpo da célula L11 é mais alongado em forma, enquanto o corpo da célula L7 é mais arredondada e porque o axônio L11 tende a filial em duas perto do celular corpo. </li><li> Neurônios chapeamento: Use um Pipetman (P10) para transferir os neurônios individuais do prato Sylgard a uma placa de cultura, conforme descrito para os neurônios sensoriais. </li><li> Emparelhamento com neurônios sensoriais: Deixe os neurônios motores aderir à placa de cultura por pelo menos 1 hr. Em seguida, adicione os neurônios sensoriais isoladas com um Pipetman, entregando cada neurônio sensorial adjacente a um neurônio motor chapeado. Usando um eletrodo de vidro afiados cuidadosamente endireitar o axônio do neurônio sensorial, e persuadir o corpo da célula sensorial para uma posição ao lado do neurônio motor, a uma distância igual ou ligeiramente menor que o comprimento do axônio de células sensoriais. Usando o eletrodo de vidro, persuadir o axônio sensorial para entrar em contacto com o neurônio motor, muito suavemente usando o lado cônico do eletrodo para finalmente ter o axônio sensorial fisicamente em contato com o axônio do neurônio motor. Não levante a placa de cultura, mas sim suavemente deslizar o prato ao longo do estágio do microscópio. </li><li> Deixar os pratos no palco microscópio em temperatura ambiente por nada menos que 3 horas e transferir para uma incubadora de 18 ° C, conforme descrito para os neurônios sensoriais. </li><li> Culturas devem aderir ao prato dentro de aproximadamente 3 horas e crescimento neurite novos devem ser visíveis dentro de cerca de 12/06 horas. Neurônios sensoriais formam sinapses glutamatérgicas com neurônios motores muito rapidamente - assim como a célula é aderente o suficiente para executar a gravação de eletrodos pontiagudos (05/03 horas), um potencial pós-sináptico excitatório pode ser gravado. Conectividade sináptica continua a aumentar até 3 DIV, e depois é estável até DIV7. Os neurônios devem mostrar crescimento de neuritos elaborados durante os primeiros 1-3 dias em cultura. </li></ol> C. Preparação de hemolinfa Hemolinfa é usado como um fator de crescimento na cultura Aplysia (análogo ao uso de soro fetal bovino em cultura de células de mamíferos). Ela é recolhida a partir de grandes dimensões (500 g-1 kg) de animais, ea melhor época para coletar hemolinfa (anecdotally) é durante a primavera (meados de março a junho). Swaddle o animal em um underpad descartáveis ​​para que apenas uma pequena parte do animal é exposto, limpa a parte da pele com o etanol, e depois mantê-lo enquanto outra pessoa usa uma lâmina estéril para fazer uma incisão na área exposta. Aperte o animal para que o squirts hemolinfa em um copo limpo, certificando-se que não entra em contato com a pele suja do animal. A hemolinfa enche a hemocele do animal (ou seja, o animal é basicamente um saco de hemolinfa). Rewrap o animal uma ou duas vezes, fazer uma nova incisão e apertar difícil coletar hemolinfa, tanto quanto possível (a cobrar em um copo novo de modo que se torna-se contaminado, a primeira coleção ainda é utilizável). Hemolinfa de cada animal devem ser mantidos separadamente (isto é, não hemolinfa piscina de animais diferentes). Girar a hemolinfa a 2000 xg por 10 min para remover células do sangue. Sobrenadante da alíquota em 10 alíquotas ml, rótulo animais e armazenar a -80 ° C. Note-se que hemolinfa armazenadas a -20 ° C forma um precipitado no meio. A nova alíquota da hemolinfa deve ser usado todos os meios de cultura o tempo é preparado, e as alíquotas devem ser descongeladas apenas antes de preparar o meio. Não voltar a congelar após descongelação.

<ol>
	<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+memory+storage:+a+dialogue+between+genes+and+synapses.">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li><li>Rayport, S. G., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+in+vitro:+cell+culture+of+identified+Aplysia+neurons+mediating+short-term+habituation+and+sensitization.">Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization.</a> J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).</li><li>Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).</li><li>Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identified+target+motor+neuron+regulates+neurite+outgrowth+and+synapse+formation+of+aplysia+sensory+neurons+in+vitro.">Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro.</a> Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).</li><li>Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+formation+and+mRNA+localization+in+cultured+Aplysia+neurons.">Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons.</a> Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).</li><li>Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-specific,+long-term+facilitation+of+aplysia+sensory+to+motor+synapses:+a+function+for+local+protein+synthesis+in+memory+storage.">Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage.</a> Cell. 91 (7), 927-938 (1997).</li><li>Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+long-term-memory-related+synaptic+plasticity+involves+bidirectional+regulation+of+gene+expression+and+chromatin+structure.">Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure.</a> Cell. 111 (4), 483-493 (2002).</li></ol>

O êxito da preparação Aplysia sensório-motor culturas tem uma curva de aprendizado um pouco lento, pois envolve o desenvolvimento de habilidades motoras finas associados com microdissecção e manipulação de neurônios individuais visualizada através de um estereomicroscópio. Em nossa experiência, que leva cerca de 1-3 semanas de prática para obter saudável isolado neurônios sensoriais na cultura e uma semana adicional 1-3 para aprender a par de neurônios sensoriais com os neurônios motores. Rotin...

Soluções necessárias para a cultura <ol><li> 0,35 M MgCl 2, armazenado em temperatura ambiente, utilizado para anestesia. </li><li> Poli-L-lisina solução, Sigma: P-1524, MW&gt; 300 mil, feito em sódio 0,1 M de borato pH8.2 a 0,5 mg solução. Vortex bem e filtro de esterilizar através de um filtro de 0,22 mM, armazená-lo em ° 4C. Não congelamento e descongelamento. </li><li> Pó L-15 Médio (Leibovitz) (Sigma: L4386) suplementado com os sais abaixo para fazer 1 litro <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> L-15 em pó </td><td> 13.8g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 15,4 g </td></tr><tr><td> D-Glicose </td><td> 6,24 g </td></tr><tr><td> MgSO 4 7H 2 0 </td><td> 6.45g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 350 mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 170 mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 5,49 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 1.43g </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 3.53g </td></tr></table> Adicionar ddH20 a 1 litro. O pH deve ser aproximadamente 7,4-7,5, adicione 10 ml de solução Pen / Strep 100X, e filtro-esterilização através de um filtro de 0,22 m. Guarde-o em 4C0 por não mais de um mês. </li><li> Solução de protease digestão: 1% Protease IX (1unit/mg) é feita em L15 (suplementada com sais como acima) ou em ASW imediatamente antes do uso, esterilizada por filtração, através de um 0,22 m Millipore. 5mls deve ser suficiente para o gânglio de dois animais (certifique-se os gânglios estão completamente imersos em solução de protease). Sigma informou que deixará de vender Protease IX. A protease substituto é: Dispase II (Roche Applied catálogo Ciência # 04942078001). </li><li> Meio de cultura. Imediatamente antes de preparar as culturas, descongele uma alíquota de 10 ml de hemolinfa e misturá-lo com 10 mls de L15 (suplementada com sais como acima) para fazer meio de cultura 20mls. Adicionar 200 mL de 200mm L-Glutamina, misture bem e use para preparar culturas. Este meio deve ser preparado cada vez culturas são feitas. </li><li> A água do mar artificial pode ser feita a partir de Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) ou da seguinte forma: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl 2 (6H 2 O), 20 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2 (2H 2 O), 10 mM HEPES, com pH ajustado para 7,4. </li></ol>

preparation of aplysia sensory-motor neuronal cell cultures

O sistema nervoso dos moluscos marinhos Aplysia californica é relativamente simples, consistindo de aproximadamente 20.000 neurônios. Os neurônios são grandes (até 1 mm de diâmetro) e identificável, com tamanhos distintos, formas, posições e pigmentações, e os corpos celulares são externamente expostas em cinco gânglios emparelhados distribuídos por todo o corpo do animal. Estas propriedades têm permitido investigadores para delinear os circuitos subjacentes comportamentos específicos no animal 1. A conexão entre os neurônios monossináptico sensorial e motora é um componente central do reflexo de retirada gill-in do animal, um simples reflexo defensivo em que o animal retira a sua guelra em resposta à estimulação tátil do sifão. Este reflexo sofre as formas de aprendizagem não-associativa e associativa, incluindo a sensibilização, a habituação e condicionamento clássico. De especial interesse para o estudo da plasticidade sináptica, a sinapse sensório-motor pode ser reconstituída na cultura, onde bem caracterizados estímulos provocam as formas de plasticidade que correlaciona direta no comportamento do animal 2,3. Especificamente, a aplicação de serotonina produz um fortalecimento sináptico que, dependendo do protocolo de aplicação, tem a duração de minutos (curto prazo facilitação), horas (médio prazo facilitação) ou dias (longo prazo facilitação). Em contraste, a aplicação do FMRFamide peptídeo transmissor produz um enfraquecimento sináptica ou a depressão que, dependendo do protocolo de aplicação, pode durar de minutos a dias (depressão a longo prazo). O grande tamanho dos neurônios permite a gravação eletrodo repetido acentuada da força sináptica ao longo de períodos de dias, juntamente com microinjeção de vetores de expressão, siRNAs e outros compostos para alvo específico cascatas de sinalização e moléculas e, assim, identificar os passos molecular e celular biológicos que estão por trás das mudanças na eficácia sináptica. Uma vantagem adicional do sistema de cultura Aplysia vem do fato de que os neurônios demonstrar sinapse especificidade na cultura 4,5. Assim, os neurônios sensoriais não formam sinapses com eles mesmos (autapses) ou com outros neurônios sensoriais, nem formam sinapses com não-alvo identificados neurônios motores em cultura. O varicosidades, sites de contato sinápticas entre os neurônios sensoriais e motores, são grandes o suficiente (2-7 mícrons de diâmetro) para permitir a formação de sinapses (bem como alterações na morfologia sináptica) com os neurônios motores alvo a ser estudado no nível de luz microscópica. Neste vídeo, demonstramos cada etapa de preparação de culturas sensório-motor neurônio, incluindo adultos e anestesiar Aplysia juvenil, dissecando seus gânglios, a digestão protease dos gânglios, a remoção do tecido conjuntivo por microdissecção, a identificação de ambos os neurônios sensoriais e motores e remoção de cada tipo de célula por microdissecção, chapeamento do neurônio motor, além do neurônio sensorial e manipulação da neurite sensorial para o formulário de contato com a cultura do neurônio motor.

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Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Culturas primárias de<em&gt; Aplysia</em&gt; Sensório-motor neurônios fornecer uma preparação do modelo para o estudo da formação de sinapses e plasticidade sináptica<em&gt; In vitro</em&gt;. Este vídeo demonstra a identificação e microdissecção de neurônios sensoriais e motores de<em&gt; Aplysia</em&gt; Gânglios, bem como os métodos de estabelecimento e manutenção de sensório-motor neurônios em cultura.

Preparação de Aplysia Sensório-motor Neuronal culturas de células

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

15.9K visualizações.  University of California, Los Angeles. Culturas primárias de Aplysia Sensório-motor neurônios fornecer uma preparação do modelo para o estudo da formação de sinapses e plasticidade sináptica In vitro. Este vídeo demonstra a identificação e microdissecção de neurônios sensoriais e motores de Aplysia Gânglios, bem como os métodos de estabelecimento e manutenção de sensório-motor neurônios em cultura.

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ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

Cell-ES derivadas Neuroepiteliais culturas de células

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Biologia

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Culturas de células neuronais de Aplysia para imagens de alta resolução de Cones de Crescimento

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...