Dr. Till Böcking'e orijinal tek molekül hazırlama protokolü için teşekkür ederiz. 
Bu çalışma NSF grant 1121972 (SS) tarafından desteklendi.

1. Kimya Hazırlama
<ol><li>PLL-g-PEG-Biotin ve avidin hazırlanması ve depolanmasını:<ol>
<li>PLL-g-PEG-biotin polimerini PBS tamponunda üreticinin talimatlarına göre 1,0 mg/ml konsantrasyonda çözün.</li>
		<li>Kapak boyutuna göre aliquot (bkz. Tablo 1)ve bir yıla kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avidin/NeutrAvidin'in hazırlanması ve depolanmasının<ol>
<li>Etiketsiz Avidin/NeutrAvidin'i PBS tamponunda üreticinin talimatlarına göre 1,0 mg/ml konsantrasyonda çözün.</li>
		<li>Kapak boyutuna göre aliquot (bkz. Tablo 1)ve 3 yıla kadar -20 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Virüs numunesi hazırlama: Bu test öncesinde virüs örneklerini deneysel ihtiyada ve laboratuvar protokolüne göre hazırlayın. Yöntem 5A için adım 1.3.1'i veya yöntem 5B için 1.3.2'yi kullan.<ol>
<li>Aşama 2'den önce yöntem 5A için virüs örnekleri hazırlayın. Hazırlanan viral numuneleri hazırlandıklarından sonraki 1-2 gün içinde veya kapak kayması boyutuna göre aliquot'u (bkz. Tablo 1)kullandı, ardından sıvı nitrojende flaş dondurma yapın ve bir yıla kadar -80 °C'de saklayın. Çözdürüldüğünde, hemen kullanın.</li>
		<li>Virüs örneklerini 1.3.1'e benzer şekilde 5B yöntemi için hazırlayın. 5B'den önce virüs aliquotlarını çözün ve antikorlarla karıştırmadan önce en fazla 24 saat 4 °C'de depolayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deney için uygun biyotinillenmiş antikorlar hazırlayın.</li>
</ol>2. Kimyasal Arıtmaya Hazırlıkta Kapak Temizliği
<ol><li>Kapakları dikey yönde tutan uygun büyüklükte bir Teflon kapak rafı içine yerleştirin ve filtrelenmiş (0,2 μm) etil alkol (190 prova) ile dolu bir behere batırın.</li>
	<li>Filtrelenmiş etil alkoldeki kapakları (190 prova) 30 dakika boyunca sonicate edin.</li>
	<li>Kapakları alkolden çıkarın ve kapak örtülerini ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın.</li>
	<li>Durulanmış kapakları ayrı bir temiz Teflon rafa ve 1 M NaOH ile doldurulmuş behere yerleştirin.</li>
	<li>1 M NaOH'daki kapakları 30 dakika boyunca sonicate edin.</li>
	<li>Kapakları NaOH'dan çıkarın ve ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın.</li>
	<li>Durulanmış kapakları azot akışı ile kurutun ve temiz, kuru bir Teflon rafa yerleştirin.</li>
	<li>Kapakları, kapak kapağında kalan görünür film veya parçacıklar için inceleyin. Görünür herhangi bir malzeme kalırsa, kapak kapağı düzgün bir şekilde temizlenmiş ve durulamamıştır. Düzgün temizlenmezse, 2.1-2.7 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Kapakları oksijen-plazma ile 2 dakika boyunca temizleyin. Bu adım isteğe bağlıdır, ancak önerilir.</li>
</ol>3. PLL-g-PEG İnce Film Tabakasının Oluşumu
<ol><li>Azot akışında (veya isteğe bağlı oksijen plazmasında) kuruduktan hemen sonra, steril bir Petri kabına yatay olarak bir kapak yerleştirin. Kapak kapağının ortasındaki pipet, uygun miktarda çözülmüş PBS tamponlanmış PLL-g-PEG-biotin (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir temizlenmiş kapak yerleştirin. Bu yöntemin, iki kapak kapağının kimyasal olarak işlenmiş "aktif yüzlerini" sadece mevcut kimyasal tabaka ile ayırarak birbirlerine doğru yönlendirerek kimyasal filmlerini kuluçkaya yatırmalarından oluştuğunu unutmayın. İki kapak arasındaki hacmin tamamen sıvı ile doldurulması, ancak kapak örtüleri arasından sıvı sızmaması için yeterli sıvı olduğundan emin olun (bkz. Tablo 1). Bundan böyle "aktif yüz", sandviç konfigürasyonunda sıvı ile temas etmiş kapak yüzlerini belirler.</li>
	<li>Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Petri kabının kapağını çıkarın ve sandviçi bir çift cımbızla alın. Fazla sıvıyı çimdiklememeye dikkat edin. Sandviçi hafifçe sıkıştırmak için başparmak ve işaret parmağını kullanın ve kapakları birbirine göre yatay olarak zıt yönlere kaydırın, ardından aktif yüzlere dokunmadan iki örtünün birbirinden ayrılması.</li>
	<li>Aktif yüzün üzerine 25 ml ultra saf su pipetleme ile her iki aktif yüzü de ultra saf su ile durulayın ve ardından kapakları bir azot akışı ile kurutun. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu not edin.</li>
	<li>Kapakları hemen kullanın veya O/N'yi aktif yüzü tozsuz düşük nem ortamına yerleştirilmiş steril bir Petri kabında saklayın.</li>
</ol>4. Avidin Bağlama Geliştirme
<ol><li>PLL-g-PEG ile işlenmiş bir kapak kapağının aktif yüzü steril bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Aktif yüzün ortasına tamponda (adım 1.2'de hazırlanmış) uygun miktarda çözülmüş avidin pipet.</li>
	<li>Sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Kapak örtülerinin aktif yüzüne dikkat edin. Aktif yüzlerin inkübasyon sırasında sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2).</li>
	<li>Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 25-30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.</li>
	<li>Aktif yüzün üzerine 25 ml ultra saf su pipetleme yaparak her iki aktif yüzü de ultra saf su ile durulayın ve ardından kapakları bir azot akışı ile kurutun. Kapak örtülerinin aktif yüzüne dikkat edin. Bir sonraki aşama için hemen kullanın.</li>
</ol>Önemlİ NOT: Deneyin gerektirdiği test türüne bağlı olarak numune hazırlamayı tamamlamak için iki farklı yöntem vardır. Deneyci, süper çözünürlüklü görüntüleme için gerekli herhangi bir ek antikor tedavisi eklenmeden önce virüsün cama tutturulduğı 5A aşamasına geçmelidir. 5B, virüsü cama tutturmadan önce çözelti içinde etiketlemenin alternatif bir yöntemini açıklar. Bu makaledeki temsili veriler 5A kullanılarak hazırlanmıştır. Deneysel tahlil türüne göre uygun bir yöntem seçilmelidir.
5A. Aktif Yüz Antikor Tether
<ol><li>Aşama 4.6'da bir azot akışı ile kuruduktan hemen sonra, steril bir Petri kabına hevesli bir işlem görmüş kapak akıntısı aktif yüzünü yerleştirin.</li>
	<li>Pipet aktif yüzün ortasına tamponda uygun miktarda çözülmüş biyotinillenmiş antikor (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Kapakların aktif yüzüne dikkat edin, aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2.).</li>
	<li>Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.</li>
	<li>Her iki aktif yüzü de 25 ml PBS'yi aktif yüze 2-4x pipetleterek PBS ile durulayın, kurumasın ve hemen kullanmayın. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.</li>
	<li>Steril bir Petri kabına antikorla işlenmiş bir kapak aktif yüzü yerleştirin ve aktif yüzün ortasına tamponda uygun miktarda çözülmüş virüs pipet yerleştirin.</li>
	<li>Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Aktif yüzü not edin, çünkü aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2.).</li>
	<li>Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.</li>
	<li>Aktif yüzün 2-4x üzerine 25 ml PBS pipetleme yaparak her iki aktif yüzü PBS ile durulayın. Kapakları kurutmayın, bunun yerine hemen PBS ile doldurulmuş bir Teflon rafa ve behere yerleştirin. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.</li>
	<li>Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya önemli bir bütünlük kaybı olmadan üç güne kadar 4 °C'de uygun bir tamponda saklayın. Önemli NOT: Numuneler bir AFM testinde kullanılacaksa, hazırlık tamamlanır ve hemen kullanılabilir veya 5A.20 - 5A.21 adımında açıklandığı gibi saklanabilir. Örnekler süper çözünürlüklü bir floresan görüntüleme testinde kullanılacaksa, 5A.12 - 5A.19 adımlarında açıklanan antikor etiketlemesine geçin.</li>
	<li>Her iki virüs işlem görmüş kapak kapağını da steril bir Petri kabına yerleştirin ve kapakların üzerine, kapaktan herhangi bir engelleme tamponu akmadan örtünün merkezi% 95'ini kaplayacak kadar sıvı hacmini kaplayacak kadar protein bloke tamponu yerleştirin (tipik olarak 100 - 200 μl.) RT'de 60-90 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Kapakları Petri kabından teker teker çıkararak ve kapak kapağındaki sıvıyı atık bir kabın içine dökerek engelleme tamponunu dikkatlice çıkarın. Kapak kapağını düşürmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Her iki aktif yüzü de 25 ml PBS'yi aktif yüze 2-4x pipetleterek PBS ile durulayın, kurumasın ve hemen kullanmayın. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.</li>
	<li>Steril bir Petri kabına tek bir bloke tampon işlem görmüş kapak aktif yüzü yerleştirin ve aktif yüzün ortasına tamponda uygun miktarda floresan etiketli viral antikor pipet yerleştirin.</li>
	<li>Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Hangi yüzün aktif olduğunu unutmayın, aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2).</li>
	<li>Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.</li>
	<li>Her iki aktif yüzü de 25 ml PBS'yi aktif yüze 2-4x pipetleterek PBS ile durulayın, kurumasın ve hemen kullanmayın. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.</li>
	<li>Kapakları kurutmayın, bunun yerine PBS ile dolu bir beher içindeki bir Teflon rafa yerleştirin. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.</li>
	<li>Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya önemli bir bütünlük kaybı olmadan üç güne kadar 4 °C'de uygun bir tamponda saklayın.</li>
</ol>5B. Çözümde Antikor Saldırısı
Bu yöntem, süper çözünürlüklü floresan görüntüleme için etiketleme stratejisinin isteğe bağlı bir geliştirmesi. Çözelti atağı uygulanarak viral yüzeyde daha iyi antikor kaplaması elde edilebilir.
<ol><li>Antikor çözeltilerini deney ihtiyacına göre oranlarda karıştırın. Örnek 1:4 0.01 mg/ml biyotinillenmiş antikorun 0.01 mg/ml floresan etiketli antikora oranı iyi bir bağlayıcı yakınlık sağlayacak ve süper çözünürlüklü bir görüntüleme testinde iyi bir zarf iyileşmesine izin verecektir.</li>
	<li>(5B.1) ve (1.3) olarak hazırlanan antikor ve virüs çözeltilerinin eşit kısımlarını karıştırın. Aliquot'ta birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Bu sonuç çözeltisi 4 °C'de 24 saate kadar ihtiyaç duyulana kadar saklanabilir.</li>
	<li>4.6. adımın tamamlanmasından sonra, steril bir Petri kabına aktif yüzlü hevesli bir işlem görmüş kapak kılıfı yerleştirin.</li>
	<li>Aktif yüzün ortasına antikor çözeltisi (adım 5B.2'de hazırlanmış) ile uygun miktarda virüs pipet.</li>
	<li>Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir kapak kılıfı (aktif yüz aşağı) yerleştirin. Aktif yüzü not edin, çünkü aktif yüzlerin inkübasyon için sıvı ile temas halinde olması önemlidir (bkz. adım 3.2).</li>
	<li>Petri kabının kapağını kapaklı sandviçin üzerine yerleştirin ve RT'de 45-60 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Petri kabının kapağını çıkarın ve iki kapak kapağını adım 3.4'te açıklandığı gibi ayırın, aktif yüzleri takip etmeyi ve dokunmayı unutmayın.</li>
	<li>Aktif yüzün 2-4x üzerine 25 ml PBS pipetleme yaparak her iki aktif yüzü PBS ile durulayın. Kapakları kurutmayın, bunun yerine hemen PBS ile doldurulmuş bir Teflon rafa ve behere yerleştirin. Hangi kapak yüzlerinin etkin olduğunu takip etmeyi unutmayın.</li>
	<li>Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya önemli bir bütünlük kaybı olmadan üç güne kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>6. Atomik Kuvvet Mikroskopi Malzeme Özelliği Ölçümü
<ol><li>AFM lazerlerini açın ve AFM yazılımını açın. Açılış iletişim kutusundan istediğiniz test için uygun tarama modunu seçin. Gerekli tüm pencereler varsayılan olarak açılmalıdır; istediğiniz pencereleri açmak için kullanım kılavuzuna başvurmazsanız.</li>
	<li>İstenilen ölçüme uygun bir kantilever seçin ve üretici yönergelerine göre kantilever muhafazasına yerleştirin. Çeşitli cantilevers olan çok çeşitli koşullar ve deney türleri vardır. Deneyci, ihtiyaçlarına göre cantilevers araştırmalıdır.</li>
	<li>Üreticinin yönergelerine göre cantilever muhafazasını AFM kafasına yerleştirin.</li>
	<li>Örnek ıslak koşullarda kullanılacaksa, örneği depolama arabelleğinden çıkarın ve 6.7 adımına geçin.</li>
	<li>Numune ortam (kuru) koşullarında kullanılacaksa, numuneyi depolama tamponundan çıkarın ve bir beher ultra saf suya batırarak kısa bir süre durulayın. Not: Bu, numune üzerinde ince bir hidrasyon tabakası bırakacak ve bu da düşük yay sabitine sahip kantilerlerle kılcal damar cazibesine neden olabilir.</li>
	<li>Numune ortam (kuru) koşullarında kullanılacaksa, numuneyi bir azot akışı ile hafifçe kurulayın.</li>
	<li>Örtünün arka tarafını tozsuz bir filtre kağıdı ile hafifçe kurulayın, numunenin aktif yüzüne dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Numuneyi uygun AFM numune tutucusuna yerleştirin, ardından numuneyi AFM aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Numune ıslak koşullarda görüntülenecekse, numunenin ortasına az miktarda tampon (~10 μl) pipet takın.</li>
	<li>AFM kafasını numunenin üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Örnek ıslaksa, dokunsal ve AFM ucunun yüzey tabakasına nüfuz ettiğinden ve dokunsal ve cantilever muhafazası arasında kabarcık olmadığından emin olun.</li>
	<li>En uygun sinyali elde etmek için AFM lazeri üretici önerilerine uygun olarak makineci ile hizalayın.</li>
	<li>Kantilever rezonans frekansını ölçün ve tarama frekansını deney tipine göre ayarlayın.</li>
	<li>AFM ucunu yüzeye üfleyin ve sinyal ayarlarını optimize edin.</li>
	<li>Seçtiğiniz modda 20 μm kare AFM taraması yapın. Temsili veri oluşturmada dokunma (AC) modu kullanıldı. Virüs adaylarını, genellikle cam yüzeyinde keskin sivri uçlar olarak görülebilen yaklaşık yüksekliğe göre tanımlayın.</li>
	<li>Bir virüs adayı seçin ve tarama kafasını bunun üzerine ortala.</li>
	<li>Topolojisini ve yönünü elde etmek için seçilen virüs hakkında 250 nm kare tarama (veya uygun süper çözünürlüklü tarama) gerçekleştirin.</li>
	<li>Malzeme özelliği ölçümü için virüs üzerinde bir nokta seçin(örneğin, Young modülü ölçümü için küresel bir virüsün merkezi) ve ölçümü üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin.</li>
</ol>7. Süper Çözünürlüklü Görüntüleme Yöntemi
<ol><li>Süper çözünürlüklü görüntüleme yazılımını açın ve yazılımı üreticinin yönergelerine göre kalibre edin.</li>
	<li>Süper çözünürlüklü görüntüleme ekipmanını floresan boncuklar kullanarak üreticinin talimatlarına uygun olarak kalibre edin.</li>
	<li>50 μl 1 M MEA ve 100 μl 10x Gloxy ile 850 μl stok tamponunu birleştirerek görüntülemeden hemen önce numune görüntüleme tamponunu stoklardan monte edin. Deney süresince görüntüleme tamponu buzda tutun.</li>
	<li>Hazırlanan bir kapak kapağını depolama tamponundan numune ile çıkarın ve bir kap ultra saf suya batırarak 5x durulayın.</li>
	<li>Tozsuz filtre kağıdı kullanarak aktif olmayan kapak yüzünü kurutun. Aktif yüze dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Bir görüntüleme sistemi numune tutucusuna yerleştirin ve numune tutucusuna 250 μl görüntüleme tamponu ekleyin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için numunedeki görüntüleme tamponunu her 2 saatte bir değiştirmek mantıklıdır.</li>
	<li>Oda ortamıyla atmosferik etkileşimi azaltmak için numune tutucuyu parafilm ile örtün.</li>
	<li>Numune tutucuyu görüntüleme için görüntüleme ekipmanına yerleştirin.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını kullanarak numuneyi odak noktasına getirin.</li>
	<li>Numuneyi kullanılan süper çözünürlüklü tekniğe göre görüntüleyin. Fotoğraf değiştirilebilir floroforların eşzamanlı aktivasyonlarını azaltırken sinyali optimize etmek için görüntüleme koşullarını ayarladığından emin olun. Önemlİ NOT: Görüntüleme koşulları örneğe bağlıdır ve deneysel ihtiyada göre değişir. Alexa 647'yi kullanarak görüntüleme tamponundaki karanlık durumlarına verimli bir şekilde başlatılan tipik bir deney, daha sonra 405 nm UV ışığı uygulamasıyla fotoğrafla etkinleştirilebilir. Görüntüler, Alexa 647 moleküllerinin seyrek bir alt kümesini yoğun etiketli bir örnek içinde heyecanlandırarak ve her floroforu öncelikle toplanan foton sayısıyla sınırlı bir hassasiyetle yerelleştirerek elde edilir. Bu yordam, istenen sayıda alım döngüsü gerçekleşene kadar yazılım tarafından tekrar tekrar tekrar tekrarlanır. Deneyci, bu ayarın fotoğraf ağartılmış örnekteki her floroforla ilişkili olmasını sağlamalıdır.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlandığında, görüntüleme ekipmanını üreticinin talimatlarına göre kapatın. Yazılım veri analizi için açık bırakılabilir.</li>
	<li>Veri analizi büyük ölçüde deneye bağlıdır; bununla birlikte, her durumda, virüsleri bilinen virüs boyutlarıyla karşılaştırıldığında maksimum yarı genişliğinde tam genişliklerine göre tanımlar ve floresan etiketlerin ek boyutunu dikkate almayı unutmayın.</li>
	<li>Daha iyi görselleştirme için, her ikisi de genellikle süper çözünürlüklü görüntüleme yazılımında bulunan Isosurface işleme seçeneğini veya hacimsel işleme seçeneğini kullanarak örnekleri görüntüleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+tip&#8211;sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid.">Minimizing tip&#8211;sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue.">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Visnapuu, M. -. L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience.">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li><li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

Yazarların bu makalede rakip finansal çıkarları yoktur.

AFM ve Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ile tek virion görüntüleme CryoEM tomografisine alternatif bir metodoloji olarak kullanılabilir. Bu metodolojilerin her birinin kendi güçlü yanları vardır. Örneğin AFM, numuneyi veya iç viral proteinleri etiketlemeye gerek kalmadan WT virionlarında yapılabilir. Viral yapıların konumu, virionun elastik özelliklerine katkılarından arındırılmıştır.
Yeni geliştirilen viral ters genetik yaklaşımlarla birlikte tek virion süper çözünürlüklü görüntüleme, düşük kopya sayısı viral proteinleri lokalize etmek için güçlü bir teknik haline gelir20. Proteinlerinin floresan proteinlere kaynaşmış proteinlerle değiştirilmesi ile rekombinant virüsler bu ters genetik yaklaşımlar kullanılarak yapılabilir ve saflaştırılabilir. Süper çözünürlüklü görüntüleme kısmen genetik etiketleme nedeniyle özgüllüğe sahip olsa da, mutant virüslerin kullanılmasını gerektirir.
AFM ve süper çözünürlüklü görüntüleme, çok benzer numune preparatlarını kullanan ücretsiz yöntemlerdir. Bu makalede özetlenen ve daha önce tek moleküllü görüntüleme testlerini oluşturan yöntemler, virionların topolojisi üzerinde çok az etkisi olan tek virionların tutturulmasına izin verir.

Atomik kuvvet mikroskopisinde virionların yapışması için düzenli olarak yük bazlı spesifik olmayan etkileşimler kullanılır1,2. Bu teknikler özellikle çok sert kapsidlere sahip gelişmemiş virionlarda kullanıldığında iyi çalışır3-6. Bu teknikler numunenin hareketsiz hale gelirken çok etkili olmasına rağmen, proteinlerin yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını engellemez. Spesifik olmayan bağlama, çeşitli antikorlarla numunenin inkübasyonlarını gerektiren AFM ve süper çözünürlüklü floresan teknikleri ile virionları görüntülemeye çalışırken bir sorun yaratabilir. Burada virionların spesifik hareketsizleştirilmesi için örnek bir hazırlama yöntemini özetliyorum.
Poli(L-lizin) (PLL) aşılanan ve cam yüzeye adsorbe edilen poli(etilen glikol) (PEG), proteinlerin cam7ile elektrostatik etkileşimleri için önemli bir blok sağlar. Cam yüzeylerdeki tek moleküllerin hareketsizleştirilmesini gerektiren tek molekül tahlilleri bu özellikten yararlanmış ve8-10özel bir PEG tabanlı tek molekül immobilizasyon tekniği oluşturmak için kullanmıştır. Bu preparat ayrıca clathrin kafeslerini cam yüzey11'e hareketsiz hale getirmek ve kontrol hücresi yapışması için homojen bir fibronektin kaplaması oluşturmak için de kullanılmıştır 12.
Tek moleküllü görüntüleme metodolojilerinden cam yüzeylere PLL-g-PEG adsorpsiyonu esas alınarak örnek hazırlama yöntemini benimsedik ve veziküler stomatit virüsünün (VSV) tek virionlarının görüntülenmesine uyguladık. Bu tek virionlar atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) kullanılarak görüntülenmiştir. Benzer deneyler kontrol olarak fonksiyonelleştirilmiş boncuklar üzerinde de yapıldı. Virionlar ayrıca süper çözünürlüklü floresan mikroskopi ile de görüntülendi Alexa 647 ile etiketlenmiş bir VSV-G antikoru tek virion zarfının görüntüsünü oluşturmak için kullanıldı. Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme,13-15görüntü oluşturmak için tek moleküllerin lokalizasyonunu kullanır. fPALM bi-düzlemsel görüntüleme, düzlemde 20 nm ve optik eksen boyunca 50 nm çözünürlüğe sahip tek moleküllerin lokalizasyonuna izin verir15,16. Bu iki düzlemsel teknik, bu çalışmada bulunan süper çözünürlüklü floresan görüntüleri görüntülemek için kullanılmıştır. Benzer sonuçlara sahip alternatif bir teknik STORM13,17,18 'dir.
Bu makalede özetlenen prosedürlerle cama tutturulmuş VSV'nin hem AFM hem de süper çözünürlüklü floresan görüntüleri, virionların minimum spesifik olmayan etkileşimlerle cama özel olarak bağlanmasını gösterdi19. Burada AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntüleme deneyleri için örnek hazırlama protokollerini sunuyoruz. Kısacası: Temiz cam kapaklar PLL-g-PEG ve PLL-g-PEG-biotin karışımı adsorbe ederek işlevsel hale getirilir. Bu ince filmin kaplamalı bir yüzeyde% 15-25 işlevselleştirilmiş biyotin sağlayacak şekilde tasarlanmış olması tipiktir. Kapaklar tetramerik avidin ile daha da inkübe edilir. Biyotinillenmiş viral antikor daha sonra virionlar için benzersiz bir bağlayıcı bölge oluşturmak için kullanılır. Antikorun bağlanması iki şekilde yapılabilir.
İlk yöntem AFM için optimize edilmiştir, ancak süper çözünürlüklü floresan görüntüleme için uygun olmaya devam etmektedir. Bu yöntemde avidin kaplı yüzey viral yapıştırma öncesinde biyotinillenmiş antikor ile tedavi edilir. Hareketsiz virionlar, zarfı örtmek ve virionların süper çözünürlüklü floresan görüntülemesine izin vermek için Alexa 647 etiketli antikor ile tedavi edilir.
İkinci yöntem, virüsleri avidinle tedavi edilen yüzeye yapıştırmadan önce biyotinillenmiş antikor ve Alexa 647 etiketli antikor ile çözelti içinde virüse saldırmaktır; bu yöntem, viral zarfın kurtarılmasının önemli olduğu süper çözünürlüklü floresan görüntüleme deneyleri için optimize edilmiştir. Bu yöntem, viral yüzeyde tek tip antikor kaplamasına izin verme avantajına sahiptir. Biyotinillenmiş antikor, viral zarfın dış tarafında yüksek miktarda floresan etiket tutarken, virüsün hevesli işlem görmüş yüzeye yeterli adsorpsiyonuna izin veren oranlarda Alexa 647 etiketli viral antikorlarla karıştırılabilir. Bu Alexa 647 etiketli viral antikorlar biyotinilasyonlu değildir ve arka plan gürültüsünü azaltmak için fazlalıkları durulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

Virionların cam yüzeylere hareketsiz hale getirilmesi tek virion görüntülemede kritik bir adımdır. Burada, tek moleküllü görüntüleme testlerinden benimsenen ve tek virionların cam yüzeylere özgüllükle yapışmasını sağlayan bir teknik sunuyoruz. Bu preparat, camın yüzeyinin PLL-g-PEG ve PLL-g-PEG-Biotin karışımı ile aşılanmasına, bir avidin tabakası eklenmesine ve son olarak biyotinillenmiş virüs spesifik antikorların bağlanması yoluyla virion ankrajları oluşturulmasına dayanmaktadır. Bu tekniği atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ve süper çözünürlüklü floresan görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli deneylerde uyguladık. Bu örnek hazırlama yöntemi, virionların yüzeye kontrol yapışıklığının ortaya çıkmasıyla sonuçlanır.

AFM kullanarak tek virion görüntüleme:
Yukarıda özetlenen örnek hazırlama protokolü, vahşi tip virionların cam yüzeye tutturulmasında kullanılmıştır. VSV virionları 180 nm uzunluğunda ve 80 nm çapında mermi şeklindedir. Bu tekniğin uygulanabileceği çeşitli virionlar olduğu için, kavram burada biyotinillenmiş 36 nm boncuklar üzerinde de gösterilmiştir. Elde eden AFM deneyleri Şekil 1'de gösterilmiştir. VSV virionlarının gelişmemiş virüslere (GPa) kıyasla daha düşük bir Young modülüne (100 MPa) sahip olduğunu belirtmek önemlidir. Tek virion VSV'nin belirli görüntüleri, sert bir kavi ile ortam koşullarında dokunma modunda elde edildi. Amaç, virüsü, virüs içindeki ekstra protein yoğunluğunun AFM görüntüsünde bir tümsek olarak görünür hale geldiği noktaya kadar deforme etmek olmuştur. Bu yöntem, virüs boşluğu içindeki ekstra protein yoğunluğunu tespit etmek için kullanılır19.
Tek virion süper çözünürlüklü görüntüleme:
Alexa 647 etiketli VSV-G antikorları, 5A yöntemini kullanarak süper çözünürlüklü deneyler için bireysel VSV virionlarının zarfını kaplamak için kullanıldı. Bağlama yoğunluğunu ve düşük belirsiz bağlamayı göstermek için, numunenin büyük bir taraması Şekil 2A'da gösterilmiştir. Temsili bir virion üzerindeki viral zarfın geri kazanımı Şekil 2B'de (mavi izosurface) gösterilmiştir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Şekil 1. fonksiyonelleştirilmiş PEGG yüzeyinde boncukların ve VSV'nin AFM görüntülemesi. 36 nm biyotinillenmiş boncuk(A, B)ve vsv virion(C)afm taraması biyotinilasyonlu VSVG antikor ile yüzeye tutturulmuş. AFM AC hava topografyası tarama modunda yapıldı. Uç yarıçapı <25 nm'dir ve ölçümler kuvvet modülasyonu ve ışık dokunma altında gerçekleştirildi. Ucun kuvvet sabiti 3 N/m ve rezonans frekansı 75 kHz ve 15 kHz belirsizlik vardı. Boncuklar AFM taraması sırasında yüksekliklerini korurken, VSV virion önemli ölçüde daha küçük bir genç modülüne sahiptir ve yüksekliği önemli ölçüde deforme olmuştur. Bu görüntüde virion özellikle küçük bir xy konvolüzyon üreten dokunma modunda sert bir şekerleterek görüntülenmiştir (virüsün ucu vs künt ucunu belirlemek için kullanılır) ve virüsün künt ucundaki ekstra protein yoğunluğunu tespit etmek için virüsün ucu ve künt ucu arasındaki yükseklik farkıkullanılır 19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Şekil 2. PEGG fonksiyonelleştirilmiş yüzeyde VSV virionlarının floresan bazlı görüntülenmesi. A)geniş alan floresanında görüntülenmiş biyotinilize anti VSVG antikoru kullanılarak PEGG yüzeyinde hareketsiz hale getirilen rekombinant VSV virionları. B)Biyotinillenmiş anti VSVG antikoru ile PEGG yüzeyine tutturulmuş ve Alexa 647 etiketli anti-VSVG antikorları ile süslenmiş VSV zarfının yüksek çözünürlüklü floresan rekonstrüksiyonu (Bu görüntülerin oluşturulmasında Yöntem 5A kullanılmıştır). Mavi yüzey 2D izosurface projeksiyonudur. Solda mermi şeklindeki virüsün bir modeli görülüyor. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Kapak Boyutu</td>
			<td style="width:93px;">akışkan</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Kapak boyutuna göre sıvı aliquots.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Görüntüleme.  University of Utah. Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Video: Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biyoloji

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...