Este protocolo descreve a melhor forma de funcionalizar os cantilevers AFM usando células T únicas e partículas sólidas. Essas dicas podem então ser usadas para sondar interações células T dendríticas de um par único e monitorar respostas celulares de tamanho instável, respectivamente. Uma das principais vantagens dessa técnica é que ela usa uma cola biocompatível para a funcionalização de células T únicas de cantilevers.
Esta cola é inerte para células eucarióticas, mantendo assim as células T em seu estágio de ativação da linha de base. Esses métodos fornecem informações sobre a ativação de células imunes e eventos intercelulares complexos, como a formação de sinapse imunológica. Os métodos também podem ser estendidos a outros sistemas que envolvam interações célula-célula ou superfície celular.
Para alguém que é novo nesta técnica, é importante ter certeza de que as células T estão em boas condições antes do uso e que elas são pré-tratadas com IL-2 durante a noite. Além disso, ao usar a cola biocompatível, mova-se rapidamente para protegê-la da oxidação desnecessária. Para iniciar este procedimento, prepare as células T únicas para microscopia seguindo o protocolo de texto.
Em seguida, prepare as tampas de vidro semeadas com células DC2.4 e incuba as células durante a noite em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius e 5%de CO2. Limpe cantilevers macios e sem ponta com uma baixa constante de mola usando tratamento de piranha, limpeza de plasma ou limpeza de UV-ozônio. Em seguida, monte o cantilever limpo na cabeça de varredura AFM.
Em seguida, prepare uma câmara de amostra limpa, e encha-a com água pura. Calibrar a cantilever na solução de água executando primeiro uma curva de força no substrato de vidro para obter a sensibilidade do cantilever. Em seguida, grave um espectro de ruído térmico para extrair a constante da mola.
Quando o cantilever estiver devidamente calibrado, remova a cabeça de varredura AFM da solução. Lave o cantilever montado com algumas gotas de etanol puro, e mantenha o cantilever seco na cabeça de varredura. Pré-aqueça um compartimento de ambiente de célula viva a 37 graus Celsius com 5% de CO2.
Em seguida, monte o deslizamento de tampa de vidro semeado com células DC2.4 para o conjunto da câmara de amostra, e adicione imediatamente 600 microliters de Médio B à câmara. Coloque o conjunto completo no estágio de amostra AFM. Adicione células T cd4-positivas incubadas pelo IL-2 na câmara de amostra.
Aguarde até que as células T de alvo estejam totalmente estabelecidas na parte inferior da tampa e, em seguida, traga as células para o campo de visão sob o microscópio. Agora, adicione uma gota de dois microliter de cola biocompatível na extremidade do cantilever montado com uma pipeta. Uma vez aplicada a cola biocompatível ao cantilever, as etapas subsequentes precisam ser concluídas o mais rápido possível, a fim de maximizar a adesão.
Coloque rapidamente a cabeça de varredura no estágio da amostra, imergindo o cantilever revestido de cola na solução. Mova o estágio da amostra até que uma célula T saudável esteja localizada abaixo da ponta do cantilever. Em seguida, ajuste bem sua posição movendo a cabeça de varredura.
Em seguida, abaixe o cantilever manualmente. Comece com um tamanho de passo de 50 mícrons, e depois diminua para 10, cinco e dois e, finalmente, 0,5 mícrons gradualmente, como indicado pela nitidez da imagem cantilever. Agora, mantenha a posição dos motores do passo, e ajuste o posicionamento da cabeça de varredura para alinhar melhor a ponta cantilever e a célula.
Continue até que o contato firme seja indicado por um pequeno deslocamento da posição do laser, correspondendo a uma força típica de 0,5 a 1,5 nanonovos. Após 30 segundos de contato, retraia o cantilever. Se a célula se mover com o cantilever, o acessório foi bem sucedido.
Se não, repita o passo de adesão até três vezes antes de mudar para um novo cantilever. Posicione a célula T anexada acima de uma célula DC2.4 movendo o estágio da amostra e a cabeça de varredura. Depois de configurar parâmetros adequados, execute a espectroscopia de força sobre a amostra.
Para uma nova rodada de sondagem, monte uma nova cantilever limpa. Calibrar em água pura, e depois voltar para um par de células T e repetir a varredura. Monte uma tampa de vidro limpo para a montagem da câmara de amostra.
No lado esquerdo da tampa, adicione uma gota de uma solução de contas que foi diluída em etanol e contém contas de poliestireno de seis mícrons de diâmetro. Uma vez que o solvente evaporar, verifique o espaçamento das contas usando um microscópio de campo brilhante equipado com um objetivo de 20x. Certifique-se de que as contas individuais estão bem separadas.
Em seguida, mergulhe uma ponta de micropipette ou um palito em uma cola epóxi bem misturada, e transfira uma pequena quantidade da cola para três pontos separados com toques suaves sucessivos no lado direito, mas perto do centro da tampa, como mostrado aqui. Em seguida, monte uma cantilever limpa e sem ponta na cabeça de varredura AFM e calibra-a no ar com uma superfície limpa para obter a constante de mola. Em seguida, posicione a ponta cantilever sobre o limite esquerdo do último ponto de cola epóxi, e lentamente traga o cantilever perto da cola usando pequenos tamanhos de passo nos motores stepper.
Uma vez feito contato com a cola, puxe rapidamente o cantilever lateralmente movendo a cabeça de varredura AFM para trás. Remova qualquer excesso de cola esfregando-a contra o vidro, deixando apenas uma pequena quantidade da cola na extremidade da ponta. Agora, mova a ponta cantilever em cima de uma pérola bem isolada.
Aproxime-se da única pérola lentamente, e faça um contato firme com ele na faixa de dois a cinco nanonovos por cerca de 10 segundos. Ao fazer contato, use ajuste de ponta fina para posicionar a conta no final da ponta. Retraia a ponta no final do contato.
Se a conta desaparecer do plano focal original, ocorreu um evento de adesão bem sucedido. Finalmente, desmonte a cantilever modificada com cuidado, e armazene-a em uma caixa de cantilever durante a noite para que o epóxi cure totalmente. Aqui estão as típicas curvas de distância de força da interação de ligação entre uma única célula T e uma única célula dendrítica ao longo de um ciclo de retração de aproximação.
A curva vermelha clara é a curva de extensão, e a vermelha escura é a curva de retração. O valor mínimo na curva dá uma medida da força máxima de adesão entre a célula T e a célula dendrítica, e a área sob a curva representa o trabalho necessário para separá-los. Os eventos de ruptura acentuada e passo a passo podem ser interpretados como amarras de membrana sendo retiradas da superfície celular devido à forte ligação na interface célula-célula e, em seguida, quebrando discretamente sob o puxão contínuo.
Aqui, a ligação convencional de células T às células dendríticas é mostrada em cinza, e a ligação regulatória de células T às células dendríticas é mostrada em azul. As forças de adesão entre uma célula T convencional e uma célula T regulatória reconhecem antígenos de peptídeos apresentados por células que apresentam antígenos, enquanto as células T regulatórias são células T supressoras que desligam a imunidade convencional mediada por células T no final de uma reação imune. Este esquema de uma célula RAW 264.7 de rotulagem fluorescente mostra a célula sendo abordada com um único diâmetro nu de seis mícrons, contas de poliestireno.
Ao engajar a conta, a membrana PIP2 é classificada no local de contato, próximo a B, que então induz o recrutamento de membrana de moesina, resultando em um evento fagocítico. Além do procedimento descrito aqui, a espectroscopia de força unicelular baseada em AFM pode ser usada juntamente com imagens de fluorescência para estudar a ativação de células imunes em tempo real no nível de célula única. Técnicas combinadas de fluorescência, este método permite abordar processos celulares mais complexos em tempo real, como a formação de uma sinapse imunológica entre células dendríticas e par de células T.
