MT é apoiado por uma bolsa de estudo de doutorado [ref. 092839/Z/10/Z] e CR por um New Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] a partir do Wellcome Trust.

1. Opcional: Prepare Affi-gel heparina Beads (gel de Contas) para FBM Ensaio atração Nota: Preparar grânulos de gel pelo menos 1 dia antes de iniciar o procedimento de explante. <ol><li> Lavar 100 ul da suspensão de esferas de gel de heparina com PBS esterilizado durante 20 min num rolo à temperatura ambiente (RT). </li><li> Grânulos de pellets em uma centrífuga de topo de mesa durante 5 min a 13.000 x g. Adicionar PBS estéril e repita o procedimento de lavagem de 4x. </li><li> Após a lavagem final, retirar PBS e embeber os grânulos em um pequeno volume de uma solução estéril contendo a proteína recombinante de escolha, tendo o cuidado de cobrir as pérolas com a solução. Este protocolo utiliza 100 VEGF165 humano recombinante ng / mL em PBS, para reproduzir uma experiência publicada anteriormente 16. </li><li> Incubar as pérolas de gel de heparina, com a solução de proteína recombinante para um mínimo de 12 horas e um período máximo de 1 semana, de um rolo, a 4 ° C. </li></ol> 2. Revestimento de Cultura Inserts Explantes rombencéfalo são cultivadas em cultura Corning insere com um tamanho de poro de 8 mM, ou inserções equivalentes. Inserções de cultura pode ser reutilizada depois de completado o protocolo, desde que sejam lavados com água destilada, esterilizada com etanol, e armazenada em etanol a 70% até ser necessário. NOTA: As etapas a seguir devem ser realizadas numa câmara de fluxo em condições de esterilidade. <ol><li> Preparar meios de cultura de explante que consiste em meio Neurobasal suplementado com B27 (20 ul / ml), glicose (6 mg / ml) e penicilina / estreptomicina (5 mg / mL). </li><li> Cultura de lavagem insere com PBS estéril durante 5 minutos e seco durante 5-10 minutos, sob a câmara de fluxo. </li><li> Coloque uma inserção de cultura em cada poço individual de uma placa 12well. Nota: inserções pode precisar de um pequeno empurrão para se encaixar bem no poço. </li><li> Cobrir as inserções de cultura com 10-20 ug / ml de laminina rato em meio Neurobasal e colocá-los numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO <sub&gt; 2) durante 1 hora. Nota: revestimento deve ser realizado no dia de explante. </li></ol> 3. Dissecção da Hindbrains de E11.5 embriões de camundongos <ol><li> Cull cronometrado rato fêmea grávida de um procedimento eticamente aprovado no dia embrionário (E) 11,5 e colocar o útero contendo os embriões em um prato de plástico 100 milímetros com meio L15 gelada. NOTA: Todas as etapas de dissecção deve ser realizada em L15 gelada. </li><li> Usando um microscópio de dissecação e Dumont relojoeiro fórceps número 5, rasgar a parede do músculo uterino para expor os embriões, libertar cada embrião, cortar o cordão umbilical, e cuidadosamente remover o saco vitelino. </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico, com uma abertura grande calibre, transferir cada embrião para um prato de plástico limpo com L15 gelado. </li><li> Utilizando uma pinça Dumont, decapitar o embrião logo acima dos membros anteriores. Se a experiência requer genotipagem dos embriões, recolher amostras de tecido para isolamento de ADN genómico (por exemplo, uma pequena piece do saco vitelino ou ponta da cauda 16,20). </li><li> Vire o lado dorsal da cabeça para cima e identificar o 4 º ventrículo, que é coberto por uma camada de tecido fino (Figura 2B). Perfurar cuidadosamente o roofplate e começam a descascar afastado caudalmente ao longo da linha média sobre o cérebro posterior posterior e da medula espinhal, e rostralmente sobre o mesencéfalo. A parte posterior do cérebro deve agora ser exposto (Figura 2C). </li><li> Importunar com cuidado todo mesenchyme cabeça restante e qualquer meninges, que são ligados ao lado pial do cérebro posterior (Figura 2D). </li><li> Remover tecido da medula espinhal e do mesencéfalo para que o cérebro posterior se desenrola e pode ficar na posição horizontal em uma preparação de livro aberto (Figura 2E). </li><li> Usando uma vasta de Pasteur de plástico pipeta, transferir cada rombencéfalo dissecados para uma placa de 12 poços contendo gelada L15 e armazená-los em gelo até que todos os hindbrains foram dissecados. </li><li> Usando uma grande calibre Pasteur de plástico pipeta, transferir um pecadogle hindbrain a um prato vazio, mantendo-se uma preparação livro aberto, o lado ventricular-se, em uma gota de aproximadamente 100 l L15. </li><li> Transferir alguns microlitros de pérolas de gel de heparina incubadas à mesma gota. Nota: Como os tamanhos de contas são variáveis, é aconselhável transferir cerca de 10 contas e, em seguida, escolher um tamanho ideal para o transplante na parte posterior do cérebro. </li><li> Fazer uma pequena lágrima no tecido do cérebro posterior e inseri cuidadosamente 1-3 contas de gel para o tecido rombencéfalo no nível de R5 / 6, a cerca de meio caminho entre a linha central e a borda lateral da parte posterior do cérebro, reduzindo-os para dentro do tecido de modo que o talão está posicionado logo abaixo da superfície hindbrain. NOTA: O procedimento de dissecção pode levar entre 5-20 min / hindbrain, dependendo da experiência, e pode se estender por um longo período se ninhadas são grandes, em qualquer caso, hindbrains deve estar em cultura não mais do que 3 horas post-mortem para o bem resultados. </li></ol> 4. HindbrainExplante Cultura <ol><li> Remova a placa contendo as inserções de cultura do incubador, aspirar a solução de revestimento de laminina. </li><li> Coloque uma lâmina de cultura em um prato de cultura separada cheio de gelada L15 e, usando uma grande calibre plástico Pasteur pipeta, transferir cada lado ventral hindbrain cima sobre a inserção da cultura (Figura 2G). O cérebro posterior deve ficar completamente plana na membrana de inserção. </li><li> Levante cuidadosamente a inserção da cultura do prato e dab-lo várias vezes em um papel absorvente limpo para remover o excesso de líquido. Este processo assegura que a parte posterior do cérebro adere à inserção de cultura em, uma preparação plana livro aberto. Se o cérebro posterior enrola, seu tecido pode irreversivelmente crescer juntos. </li><li> Preencha o original 12 poços placa com 500 mL meio de cultura pré-aquecido e coloque a pastilha de volta a este bem. Ajustar cuidadosamente o volume com outro 400-600 ul de meios para cobrir apenas a parte posterior do cérebro, assegurando que a parte posterior do cérebro não flutuarfora da membrana. Se ele flutua, volte ao passo 4.4 e repetir até que a parte posterior do cérebro permanece ligado à membrana. </li><li> Nesta fase, é possível adicionar inibidores biológicos de interesse para a mídia para estudar seu efeito sobre a migração dos neurônios FBM. NOTA: Se a implantação de contas ou administrar outros tratamentos, recomenda-se manter pelo menos dois explantes de controle em condições normais de crescimento por experimento para garantir que o experimento foi criado com sucesso. </li><li> Incubar explantes de 24-30 horas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 5. Wholemount Immunofluorescent Coloração de rombencéfalo explantes <ol><li> Aspirar o meio de cada poço, enxaguar em PBS e fixar durante 2 horas a 4 ° C com agitação suave em gelo frio 4% de formaldeído (paraformaldeído a 4% dissolvido em PBS preparado de fresco ou recentemente descongelado). Nota: Não tente remover hindbrain a partir da inserção da cultura antes da fixaçãoestá completo. </li><li> Lavar 3x com PBS. Retire cuidadosamente as hindbrains das inserções de cultura, utilizando fórceps Dumont. Alguns explantes são difíceis de descascar, mas geralmente pode ser levantado através da aplicação de uma leve pressão através expulsando repetidamente PBS a partir de uma pipeta. </li><li> Transfira os hindbrains para 2,0 ml tubos de fundo redondo para a rotulagem de imunofluorescência. Permeabilizar hindbrains durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA) em PBS contendo 0,1% Triton X-100 (PBT) com rolamento suave. </li><li> Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente em PBT contendo 10% inactivado por calor soro normal de cabra com rolamento suave. </li><li> Incubar explantes com rolamento suave a 4 ° C durante 5 dias, com o anticorpo primário específico para ISL1, diluído a 1:100 em PBT contendo 1% de soro normal de cabra inactivado pelo calor. </li><li> Lave os explantes em RT 4x com PBT durante 15 min cada. </li><li> Incubar explantes com rolamento suave à temperatura ambiente durante 3 horas com cabra fluoróforo conjugado anticorpo anti-rato (por exemplo, Alexa Fluor 488 cabra antirato, diluída a 1:200) em PBT contendo 1% de soro normal de cabra inactivado pelo calor. </li><li> Lave os explantes 4x no RT com PBT de 15 min cada um com rolamento suave. </li><li> Pós-fixarem os explantes em formaldeído a 4% durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Cubra uma lâmina de vidro com 3 camadas de fita isolante preta e impostos especiais de consumo com um bisturi um pequeno quadrado da fita em camadas para criar um bolso para os explantes, alternativamente, use uma lâmina de vidro da depressão. </li><li> Monte cada hindbrain em reagente SlowFade em um bolso e cobrir com uma lamela de vidro, evitando cuidadosamente a bolhas de ar armadilha e imagem usando um microscópio de varredura a laser confocal. NOTA: Como uma alternativa para a imunocoloração, hibridação in situ com ribossondas que reconhecem FBMS (isto é, ISL1 ou PHOX2B) pode ser usado para visualizar os neurónios FBM 16,21. </li></ol> Resumo dos passos e temporização Cronometrado acasalamento obter gravidezes E11.25: ~ 14 dias Opcional: Bead preparação (Protocol 1): ~ 2 horas, no dia antes do isolamento do embrião Prepare inserções de cultura e mídia (Protocolo 2): ~ 30 min, antes do isolamento do embrião Isolamento de embriões e dissecção hindbrain (passos 3,1-3,4): ~ 10 min / embrião Dissecção rombencéfalo (passos 3,5-3,7): ~ 5-10 min / hindbrain Procedimento explante (passos 3,8-3,9): ~ 5-10 min / hindbrain Opcional: implantação talão (passos 3,10-3,11): ~ 5-10 min / hindbrain Cultura explante (passo 4.7): 24 horas Fixação para coloração de anticorpos (passo 5.1): 2 horas Processo de coloração e de imagem (Protocolo 5): 5 dias

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Nenhum dos autores competindo interesses ou interesses conflitantes.

Este protocolo descreve a cultura de wholemount hindbrains E11.5 de rato em um transwell sistema para estudar a migração de neurónios FBM. Este protocolo permite neurónios motores rato rombencéfalo para ser mantido vivo e migrando para um período de 24 horas, permitindo a manipulação ex vivo. Este método tem inúmeras vantagens experimentais para os investigadores procuram identificar os mecanismos moleculares e celulares da migração neuronal. Considerando que os ensaios de migração tradicionais explante pequenos pedaços de tecido neural em matriz em placas de cultura e permite a observação de neurónios individuais, que respondem a estímulos exógenos, uma grande vantagem do ensaio transwell é a sua aptidão para manipular neurónios migram dentro do ambiente órgão hospedeiro e, portanto, uma maior contexto fisiológico. Importante, as substâncias podem ser facilmente aplicados aos ex vivo romboencéfalo explantes para testar o seu efeito na migração neuronal, evitando possíveis efeitos colaterais associados com administetocar essas substâncias a um rato grávida. Finalmente, o modelo ex vivo também permite que o ensaio de substâncias que não atravessam a barreira placentária, tais como anticorpos bloqueadores de função. Devido a estas vantagens, o rombencéfalo cultura ex vivo proporciona um método alternativo e complementar a utilização de embriões de peixes-zebra, os quais podem ser tratados com água pequenas moléculas solúveis na água do aquário, ou no útero electroporação de cérebros embrionários, que requer o uso de especializada equipamento e é mais difícil de dominar que a técnica de cultura aqui descrito. Uma outra vantagem do protocolo descrito aqui é a sua receptividade para implantar os grânulos embebidos em proteína recombinante ou de outros reagentes, por isso permitindo que a aplicação de um método padrão embrionário desenvolvidos para manipular embriões de galinha para um modelo de rato de migração neuronal. Em particular, o modelo ex vivo de cultura pode ser aplicada a hindbrains de ratos geneticamente modificados defectiva em moléculas específicas implicadas na migração neuronal, tais como receptores de crescimento ou factor de orientação, e combinado com os implantes do grânulo para testar se a capacidade de resposta a ligandos é perdida. Em adição à manipulação farmacológica, o protocolo ex vivo de cultura pode também ser adaptado para electroporar vectores de expressão que podem manipular a expressão de genes de interesse; métodos adequados para eletroporação foram previamente descrito 22,23. Este protocolo também pode ser adaptado para visualizar a migração neuronal por microscopia de lapso de tempo em explantes rombencéfalo de camundongos transgênicos contendo neurônios fluorescente etiquetado FBM, por exemplo ISL1-Cre; Rosa26Yfp 21. Finalmente, o protocolo pode também ser usado para estudar outros tipos de neurónios que migraram para a parte posterior do cérebro, tais como aqueles que constituem a oliva inferior, embora isso exigiria a utilização de hindbrains em estágios embrionários idosos e pode exigir a cultura durante até 48 horas, dependendo da viabilidade neuronal <em&gt; Ex vivo. As etapas críticas e solução de problemas Para o sucesso deste protocolo, é crucial que os embriões são coletados no início E11.5 dia, mais perto de E11.25, quando a migração neuronal FBM está apenas começando. No entanto, isso nem sempre é possível recuperar embriões neste estágio de desenvolvimento, devido a variabilidade de acasalamento natural de ratinhos, e, consequentemente, pode haver alguma variação na extensão da FBM migração entre diferentes experimentos. Variabilidade na migração FBM também pode ser observada se a experiência não for concluída dentro do prazo designado, cerca de 3 horas, como pode ser visto na Figura 3E. Hindbrain tecido a partir de embriões de rato E11.25 é delicada. Ao dissecar e durante todo o processo de explante, é importante para não rasgar o tecido rombencéfalo nas áreas de r4-R6, onde os neurónios de MRF estão localizados. Devido à natureza delicada da Dissprocesso exão, e por causa da velocidade com que hindbrains são colocados em cultura influencia resultado, o procedimento pode levar um par de prática funciona de dominar, em especial, antes de serem utilizadas amostras preciosas ou reagentes. Finalmente, é importante que o tecido rombencéfalo é colocada numa configuração livro aberto sobre a inserção de cultura, porque a dobragem do tecido do cérebro posterior durante a cultura vai impedir a migração normais FBM (ver Figura 3F).

Embrionárias neurônios nascem na zona ventricular do cérebro, mas, posteriormente, migrar para novos destinos para alcançar regiões-alvo apropriadas que estão localizados em uma grande distância. O posicionamento correto de corpos celulares neuronais em lugares apropriados ao longo dos eixos dorso-ventral e ântero-posterior do cérebro em desenvolvimento é essencial para a fiação correta, sobrevivência e função desses neurônios após a fase migratória 1-4. Similar aos mecanismos moleculares que controlam a orientação do axônio 5-7, conjuntos combinatória de sugestões atrativas e repulsivas são pensados ​​para orientar os neurônios migram 1,8. No entanto, devido às interações de vários tipos de células, os sinais que controlam a migração neuronal têm sido menos estudada do que aqueles que estão envolvidos na orientação do axônio, que pode ser estudado célula autônoma. A parte posterior do cérebro em desenvolvimento de vertebrados tem sido utilizado em vários estudos recentes para compreender os mecanismos moleculares e celularesda migração neuronal, por exemplo, na garota, mouse e zebrafish 1-4,9. Este órgão contém vários tipos diferentes de neurônios, incluindo vários subtipos de precerebellar e neurônios motores 5,7,10,11. Motorneuron hindbrain nascem na zona ventricular perto do floorplate, e se diferenciam em subconjuntos específicos de acordo com sua rhombomere de origem 1,12. O branchiomotor facial (FBM) neurônios são gerados no rhombomere (r) 4, na parte posterior do cérebro e estender seus axônios dorsal através de um ponto de saída r4 para o segundo arco branquial que inervam os músculos faciais 2,9,13. Neurónios MRF de peixe-zebra e ratinhos proporcionam excelentes modelos para o estudo dos mecanismos moleculares e celulares de migração neuronal num processo que é facilmente visualizada, porque estes neurónios reprodutivelmente translocam o seu somata num processo espaçotemporalmente bem definida. Em camundongos, os neurônios FBM primeiro migrar caudally através de R5 e, em seguida, tanto caudal e ventralmente para chegar a sua posição final sobre o lado pial do cérebro posterior, no território de r6, onde formam os núcleos emparelhados do nervo craniano VII (VIIn) 10,11,14. No peixe-zebra, os neurónios FBM inicialmente migrar ventral e depois mudar de direcção no limite r4-r5 para continuar a migrar para a superfície pial em uma maneira dependente da laminina 4,12,15,16. Esta migração continua ao longo de um período de vários dias em desenvolvimento e pode ser dividido em fases de migração tangencial e radial, permitindo a identificação de moléculas que medeiam estes dois processos distintos. Em contraste, os neurônios FBM da garota hindbrain embrionárias permanecem em r4 3,13,17-19. Durante a migração, os neurônios FBM podem ser identificados, como outros tipos ou neurônios motores, através de sua expressão do fator de transcrição homoeodomain ilhota 1 (ISL1) 14. Assim, wholimunofluorescência emount ou hibridação in situ para este marcador, em diferentes estágios de desenvolvimento revela o fluxo migratório distinto de FBM somata que se estende desde a r4 r6 no peixe-zebra ou rato 4,15,16. Além disso, repórteres fluorescentes, tais como transgénicos ISL1-GFP foram usados ​​como ferramentas adequadas para visualizar a migração neurónios de MRF no peixe-zebra 3,17-19. Além de sua adequação para a imagem latente, muitos pesquisadores têm estudado a migração dos neurônios FBM no desenvolvimento do peixe-zebra, porque seus embriões de vida livre pode ser manipulado facilmente com as técnicas de transplante de células e compostos farmacológicos aplicados diretamente na água do aquário. Em contraste, o embrião de rato desenvolve fechado no útero, impedindo a implantação de grânulos que transportam sinais de orientação ou a administração de anticorpos bloqueadores de função que não atravessam a barreira placentária. Além disso, compostos farmacológicos administrados à mãe grávida pode ter unefeitos colaterais desejados que podem indiretamente prejudicar a embriogênese. Contornar essa limitação, desenvolvemos um método de cultura ex vivo para mouse hindbrain todo que é compatível com a migração FBM neurônio e sobrevivência de 24 horas após o explante 7,16. Este método permite uma manipulação fácil farmacológico, o implante de grânulos que transportam sinais de orientação ou a administração de anticorpos bloqueadores de função e também pode ser adaptado para estudar a migração de outros subtipos neuronais no cérebro posterior, em diferentes estádios de desenvolvimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="575">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">211-2120</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Cell culture plates, 12 well</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150628</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Plastic cell culture dish, 100 mm</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">150288</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:104px;">3477</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:111px;">Dumont</td>
			<td style="width:104px;">91150-20</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P4417</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Laminin mouse protein</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">23017-015</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primary antibody, Isl1</td>
			<td style="width:111px;">Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:104px;">39.4D5</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">A11029</td>
			<td style="width:147px;">Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21103</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">B27 supplement (50x)&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">17504-044</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">21083-027</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Penicillin/ streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15070</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Glucose</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">101174Y</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">G9023</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">T8787</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">P6148</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Slowfade Antifade Kit</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S-2828</td>
			<td style="width:147px;">Alternative mounting solutions may be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0912</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Cover glass</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:104px;">631-0137</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Affi-Gel Heparin Beads</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td style="width:104px;">153-6173</td>
			<td style="width:147px;">Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:215px;">Recombinant human VEGF165</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:104px;">293-VE</td>
			<td style="width:147px;">Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse hindbrain ex vivo culture to study facial branchiomotor neuron migration

Embrionárias neurônios nascem na zona ventricular do cérebro, mas, posteriormente, migrar para novos destinos para alcançar metas adequadas. Decifrando os sinais moleculares que cooperativamente guia de migração neuronal no cérebro embrionário, é importante entender como as redes neurais complexas formar que mais tarde suportar a vida pós-natal. Branchiomotor Facial (FBM) neurônios no cérebro posterior rato embrião migrar de rhombomere (r) 4 caudalmente para formar os núcleos faciais emparelhados na região R6-derivado do cérebro posterior. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para wholemount ex vivo cultura de hindbrains embrião de rato adequados para investigar as vias de sinalização que regulam a migração FBM. Neste método, hindbrains de embriões de rato E11.5 são dissecados e cultivados em uma preparação de livro aberto em inserções de cultura de células durante 24 horas. Durante este tempo, os neurónios FBM migrar em direcção caudal r6 e podem ser expostas a anticorpos bloqueadores de função e pequena molecules nos meios de cultura ou grânulos carregados de heparina com as proteínas recombinantes para examinar funções para as vias de sinalização envolvidos em guiar a migração neuronal.

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos através do estudo de migração neuronal FBM na parte posterior do cérebro do rato através ex vivo da cultura. Mostramos que os neurônios FBM em hindbrains explante a partir de dia 11 embriões de camundongos primeiro passar por uma migração tangencial (Figura 3A) e, em seguida, começar a montar o núcleo motor do facial (Figura 3B), similar ao seu comportamento no útero (veja a Figura 1). Demonstramos ainda que a implantação de um talão embebido-VEGF165 atrai neurónios FBM (Figuras 3C e 3D), como anteriormente mostrado 16. Importante, este protocolo permite estudar a migração FBM na ausência de vasos sanguíneos ou factores derivados de vasos que podem influenciar a migração FBM no útero, pois a vasculatura nonperfused degenera em cultura 16. Assim, a rotulagem de glóbulos inespecíficas observadas quando se utiliza o anticorpo ISL1 mouse no recém-isolados de rato hindbrains (Figura 1) não está mais presente no tecido hindbrain após 24 horas em cultura (Figuras 3A-F). Finalmente, vamos mostrar dois exemplos de hindbrains que não foram explantados corretamente e, portanto, contêm neurônios FBM em uma distribuição anormal, seja porque a parte posterior do cérebro não foi retirada logo após o isolamento do embrião (Figura 3E), ou porque o tecido hindbrain dobrado no transwell ( Figura 3F). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig1.jpg" /> Figura 1. FBM migração neuronal confocal z-stack de hindbrains wildtype mouse depois ISL1 imunomarcação wholemount e flatmounting;.. Linha média hindbrain é indicado com um asterisco em todos os painéis (A) superfície ventricular de um hindbrain E11.5 no<html> área de neurónios contendo FBM ISL1-positiva (setas), demonstrando assim a sua migração tangencial de R4 a R6;. da posição de R4, R5 e R6 é indicada (A &#39;) Pial superfície de uma metade da mesma parte posterior do cérebro na área que contém o primórdio de um dos núcleos de MRF emparelhados (indicados com VIIn), bem como de outras populações de neurónios ISL1-positivo (B) da superfície de uma parte posterior do cérebro ventricular E12.5 FBM contendo neurónios que estão de migrar tangencialmente (seta);. da ponta de seta indicam um exemplo de um vaso sanguíneo que contém células circulantes que são não especificamente marcadas pela reacção cruzada do anticorpo secundário anti-rato para detectar o anticorpo IgG de ratinho ISL1. (B &#39;) Pial superfície de uma metade do mesmo rombencéfalo E12.5, que contém um dos núcleos de MRF emparelhados. A linha média é indicado com um asterisco em cada painel. Barra de escala (todos os painéis): 200 m. V, ventral; P, pial./ 51397fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig2.jpg" /> Figura 2. E11.5 rato hindbrain dissecção e ex vivo da cultura. (A) Cabeça de 1 mm da embrião depois que ele foi cortado do restante do embrião ao nível dos membros anteriores (B) A parte rostral do: barra de escala, (AE) As principais etapas no protocolo de dissecção E11.5 hindbrain.. cabeça foi removida e o resto do tecido cabeça posicionada de modo que a 4 º ventrículo (seta) foi orientada para cima. (C) A cobertura do 4 º ventrículo foi descascada, e a parte posterior do cérebro foi exposta por descamação do tecido sob o rombencéfalo distância rostral e caudal. (D) A membrana pial foi removido (note que neste examplo, alguns medula espinhal cervical (SC) de tecido permaneceu ligada à parte posterior do cérebro). de (E) O excesso de mesencéfalo (MB) e espinal medula (SC) do tecido foi removida para reter apenas a parte posterior do cérebro. (inserções F) de cultura foram revestidas com laminina e colocado em uma placa de cultura de tecido de 12 também. (G) Cada hindbrain foi colocado sobre uma pastilha e coberto com a mídia. (H) Representação esquemática do caminho percorrido pela migração de neurônios FBM (azuis), durante 24 horas de cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51397/51397fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem maior.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51397/51397fig3.jpg" /> Figura 3. Rato hindbrain ex vivo da cultura. (A, B) Uma rombencéfalo E11.5 foi cultivada durante 24 horas e immunofluoresc<html> temente marcado para ISL1 para ilustrar a migração neurónio FBM num explante; tanto ventricular (A) e (B) pial os lados da parte posterior do cérebro são mostrados (C, D) da mesma ninhada hindbrains E11.5 foram cultivadas na presença de heparina implantado talão encharcado. em PBS (C) ou VEGF165 (D); notar que os neurónios FBM migraram em direcção e para o talão de VEGF165, e, portanto, o fluxo de migração mais alargado caudal comparado com o lado não tratado do mesmo rombencéfalo ou a parte posterior do cérebro contendo o talão de controlo (E. , F) Exemplos de explantes insatisfatórios E11.5 rombencéfalo, em que FBMS não emigraram a partir de r4 (E), ou em que o tecido hindbrain dobrado durante a cultura (F). A linha média é indicado com um asterisco em cada painel. Barra de escala (para todos os painéis): 200 um. V, ventral; P, pial.&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embrionárias neurônios nascem na zona ventricular do tubo neural, mas migrar para atingir metas adequadas. Branchiomotor Facial (FBM) neurônios são um modelo útil para estudar a migração neuronal. Este protocolo descreve o ex vivo cultura wholemount de hindbrains embrião de rato para investigar os mecanismos que regulam a migração FBM.

Rato rombencéfalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para estudar Facial Migração Branchiomotor Neuron

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

mouse-hindbrain-ex-vivo-culture-to-study-facial-branchiomotor-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

11.1K visualizações.  University College London.  Embrionárias neurônios nascem na zona ventricular do tubo neural, mas migrar para atingir metas adequadas. Branchiomotor Facial (FBM) neurônios são um modelo útil para estudar a migração neuronal. Este protocolo descreve o ex vivo cultura wholemount de hindbrains embrião de rato para investigar os mecanismos que regulam a migração FBM. 

Vídeo: Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Neurociência

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection de roedores Neuroblastos para estudar neuroblasto Migração<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

O rombencéfalo Mouse como um modelo para o estudo embrionário neurogênese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Cirurgia do nervo facial no modelo de rato para estudar inibição e regeneração axonal

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo pressurizado Hipocampal Capilar-Parenchymal Arteriole Preparação para estudo funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...