Agradecemos a Sandra Bargen para excelente suporte técnico. Este trabalho foi financiado pelo departamento de pesquisa da proteína (PRD, TP A1.2 (RC e TS), ea RUB Research Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Os anticorpos monoclonais 39.4D5 e F55A10 foram obtidos a partir de Estudos de Desenvolvimento Hibridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Para reagentes especiais: ver Tab. 1. Todos os outros reagentes estão listadas na célula de qualidade grau de cultura obtidos da Sigma Aldrich. 1. PORN-H/laminin revestimento de pratos / lamínulas <ol><li> Prepare solução de trabalho de 0,5 mg / ml Poly-DL-ornitina hydrobromide (PORNÔ-H) em 150 mM pH tampão borato 8,35. <ol><li> Uma solução estoque de 50 mg tampão borato PORNÔ / 1 ml pode ser preparado com antecedência e armazenado a -20 ° C. </li></ol></li><li> Esterilizar lamínulas de vidro por chamas em etanol 100% e deixe-os secar ao ar. </li><li> Cubra a superfície com solução de H PORNÔ-suficiente durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte lavar três vezes com água esterilizada e secar lamínulas. </li><li> Prepare solução de trabalho de 2,5 mg / ml em HBSS laminina <ol><li> Alíquotas podem ser armazenadas a -20 ° C. Descongele a 4 ° C imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Cubra a superfície das lamínulas PORNÔ-H-revestido com a solução de laminina e deixá-los incubar por pelo menos 2 h em temperatura ambiente até o uso. </li></ol> 2. Lectina revestimento da placa de purificação <ol><li> Prepare uma solução de 10 mM Tris em água esterilizada, pH 9.5. </li><li> Adicionar lectina (resolver a lectina (Sigma L9640) pó em HBSS) para uma concentração final de 10 mcg / ml. </li><li> Revestimento de superfície de uma placa de cultura 10 centímetros celular com 8 ml da solução de lectina e deixe incubar por pelo menos 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Lave a placa três vezes com HBSS e armazenar em HBSS até o uso. </li><li> Prepare um KCl 30mm, 0,8% (w / v) NaCl despolarização solução. Esterilizar por filtração e armazenamento em temperatura ambiente (RT). </li></ol> 3. Motoneurônio meio de cultura <ol><li> Cavalo descongelar soro durante a noite a 4 ° C e inativar a 55 ° C por 30 min, em alíquotas de 5 ml e armazenar a -20 ° C. Alíquota de descongelar antes de usar diretamente no RT. </li><li> Loja B27 suplemento em uma aliqouts ml a -20 ° C. Descongelar no suplemento B27 RT imediatamente antes da utilização. Evitar ciclos de congelamento e descongelamento. </li><li> Glutamax alíquota em 0,5 ml alíquotas e armazenar a -20 ° C e usá-lo em 1:100. </li><li> Prepare uma solução estoque de 10 mg / ml CNTF em água esterilizada com BSA 0,1%. Armazenar a -20 ° C. </li><li> Misture 46 ml de meio de neurobasal com 2,5 ml soro de cavalo, 1 ml suplemento B27 e 0,5 ml Glutamax directamente antes de usar. </li><li> Adicionar CNTF a uma concentração final de 10 de médio ng / ml e pré-aquecido médio e 37 ° C. </li></ol> 4. Dissecção da medula espinhal <ol><li> Sacrifício de um rato E12.5 grávidas e remoção dos embriões com cuidado. Adicione o suficiente RT HBSS para cobrir completamente os embriões. </li><li> Retire a cabeça ea cauda e colocar a parte de trás do embrião com membros montou. </li><li> Corrigir o embrião com uma pinça e retire a pele exterior com a pinça outros. </li><li> Remover a medula espinhal, perfurando o fórceps sob ele e levante-o com serra-como movimentos de ambos os lados da medula espinhal. </li><li> Transferir a cabo isolado espinhal para um novo prato com HBSS e abrir o canal central da medula espinhal no lado dorsal. </li><li> Remover os gânglios da raiz dorsal, removendo as meninges anexando da medula espinhal. </li><li> Recolher as peças lombar da medula espinhal de até 6 embriões por placa lectina em um tubo de reação eppendorf cheia com 1 ml HBSS e armazenar no gelo até que a preparação está feito. </li></ol> 5. Enriquecimento de motoneurônios por lectina de purificação baseado em Nota: Antes de iniciar os próximos passos, o mais recente aqui preparar e Pré-aquecer o meio (veja a etapa 3.) <ol><li> Prepare uma solução de tripsina através da resolução de 1 g Tripsina em 100 ml HBSS, armazenar a -20 ° C e descongelamento a 4 ° C. </li><li> Mix 1g tripsina-inibidor com 98 HBSS ml e 2 ml de 1 M HEPES pH 7,4, 1 ml alíquotas devem ser armazenadas a 4 ° C. </li><li> Transferir o tubo com a medula espinhal a uma capa de cultura celular e remova cuidadosamente 700 mL de HBSS. </li><li> Adicionar 7,5 mL de solução de tripsina e misture com cuidado invertendo o tubo. </li><li> Executar trypsination por 8 min a 37 ° C. </li><li> Pare a reação adicionando 30 mL inibidor de tripsina e pipetar cima e para baixo (triturar) cuidadosamente 10-15 vezes com uma ponta de pipeta 1000 mL até agregados celulares não mais são visíveis. Repita a trituração com uma pipeta 20-200 mL ea ponta correspondente. </li><li> Pipetar a solução de células na placa HBSS cheio de lectina e dispersar as células suavemente girando o prato. </li><li> Mantenha o prato lectina por 60 min à temperatura ambiente em uma superfície livre de vibrações. Cubra-o para evitar a contaminação. </li><li> Remover o HBSS muito suavemente e lavar a placa com cuidado 4 vezes com HBSS pré-aquecido para remover fragmentos de células e as células não ligado / unattached. </li><li> Imediatamente após a etapa de lavagem passado, adicionar 500 mL de solução despolarização ao prato e deixe incubar por 1min. </li><li> Facilitar o desprendimento das células lectina ligada por agitação etocar no prato. </li><li> Encha o prato com 2 ml meio de cultura pré-aquecido e transferir para um tubo falcon 15 ml. </li><li> Contar o número de células com uma câmara de contagem Neubauer. </li><li> Placa a célula na lamínulas laminina revestidos ou placas em um número apropriado, dependendo da aplicação. </li><li> Realizar uma troca de médio no dia 1 e, posteriormente, a cada segundo dia por substituição cuidadosa de 50% do meio de idade. Use sempre pré-aquecido, meio de cultura preparada nova. </li></ol> 6. Resultados representativos: Motoneurônios embrionárias podem ser obtidas a partir de embriões de camundongos em E12 e E14. 2-3% da população total de células da medula lombar da coluna vertebral consiste de motoneurônios e como os neurônios da raiz dorsal ganglionar são p75 NTR-positivos, assim, é importante para se livrar dessas células antes de iniciar o procedimento preplating lectina-based ( Para visão geral veja a Figura 1 e Figura 2). Em segundo lugar, as meninges incluem células fortemente divisão que devem ser excluídos também, pois eles não podem ser adequadamente removida pelo procedimento preplating lectina-based (Figura 2 e Figura 3). Nos piores casos, essas células podem crescer demais a placas de cultura. As imagens representativas na Figura 3B e 3D também dar uma impressão sobre a menor densidade de células após a lavagem os procedimentos foram realizados (veja o passo 5.9 do protocolo). Culturas de motoneurônios embrionárias de camundongos são geralmente mantidos por até cinco ou sete dias. Durante este período as células estabelecer sua neurites até um comprimento máximo (Figura 4). Comprimentos neuritos dependem fortemente do substrato sobre a 8 pratos. O substrato típico é laminina que é revestido em pornô-H placas de cultura cobertas. Motoneurônios também pode crescer em outros substratos ou menos definida, como matrizes extracelulares gerados por lise da água 8. Em casos de suboptimal revestimento, comprimento e área de neurite cone de crescimento são reduzidos e morte celular geralmente aumenta. Suporte trófico desempenha um papel crucial para a sobrevivência de motoneurônios embrionárias de camundongos em cultura. Sobrevivência das células inicialmente semeadas em queda de sete dias a 10% a 20% sem o apoio tróficos 6. Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) eo fator neurotrófico ciliar (CNTF) são os fatores mais comumente usado, mas outros podem promover a sobrevivência, bem [fator inibidor da leucemia (LIF), cardiotrofina-1 (CT-1), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> Figura esquema de Fluxo 1. Para a preparação de motoneurônios embrionárias de camundongos. O desenho esquemático ilustra as diferentes etapas de isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de camundongos. Abreviaturas: SC: medula espinhal; HBSS: Hanks solução salina balanceada; MN: motoneurônio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> Figura 2 isolamento da parte lombar da medula espinhal de rato E12.5 A:.. E12.5 embrião de rato. Para a próxima etapa, a cabeça ea cauda são removidos eo corpo é colocado em uma posição dorsal B-up: Embryo em posição dorsal-up. Fórceps à esquerda e à direita da medula espinhal são fixação do corpo do embrião na sua posição. Um dos fórceps é posteriormente usada para cortar a pele e cortar debaixo da medula espinhal a outra é usada para corrigir o embrião em sua posição C:. Medula espinhal Isolado E12.5 embrião de rato. As partes da medula espinhal (cervical, torácica, lombar) são indicados. A medula espinhal está rodeada pelas meninges e parte dos gânglios da raiz dorsal ainda anexar a eles D:. A medula espinhal é cortados longitudinalmente no lado dorsal para abri-lo para o canal central E:. As meninges no lado ventral são agora retirado da medula espinhal achatada. Nota: Apesar de retirado, a parte lombar é marcado por um pequeno corte. F: Apenas a parte lombar da medula espinhal é então levado para procedimentos posteriores. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> Figura 3 Determinação e isolamento de ilhotas de células positivas da medula espinhal lombar de embriões de camundongos E12.5 A:.. As etiquetas Islet-1 anticorpo / 2 colunas motoneurônio na medula espinhal lombar embrionárias (vermelho, seta) e etiquetas de todos os Hoechst núcleos dentro da seção. Seção transversal de um cabo de Lumar E12.5 espinhal. E12.5 embriões de camundongos foram imersão-fixadas em paraformaldeído a 4% para 6 h, lavados 3 vezes com tampão fosfato e tratadas com sacarose acordo com os procedimentos padrão. Criosecções de 20 mM foram tomadas com um criostato e os cortes foram tratados para a coloração immunhistochemical de acordo com procedimentos padronizados 11. O software seções posteriormente rotulados com Hoechst para a localização do núcleo das células. Note-se queos neurônios da raiz dorsal ganglionar são Islet-1/2-positive bem e que o procedimento de preparação exclui essa peças de tecido do procedimento de isolamento B:. Islet-1 / 2 rotulados (vermelho, seta) dissociado lombar células da medula espinhal a partir de E12. 5 embriões, à esquerda - antes e direita - depois de lectina baseado preplating. As células foram contracorados com Hoechst para visualizar todos os núcleos das células C:. Quantificação de células Islet-1/2-positive antes e depois da lectina baseado preplating D:. Nkx6.1 motoneurônios marcados a partir E12.5 embriões depois de um dia em cultura. As células foram contracorados com a Hoechst cisualieze todos os núcleos. Note-se que 90% de todas as células são Nkx6.1 positivo. Abreviaturas: SC: medula espinhal; MN: motoneurônio; DRG: gânglio da raiz dorsal. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> Figura 4 Caracterização da E12.5 motoneurônios do mouse A e B:.. Enriquecido isolado E12.5 rato lombar motoneurônios espinhais expressam p75 NTR em 0 dias in vitro (0div) e no dia 2 in vitro (2div). As células foram fixadas com paraformaldeído 4% e, posteriormente, coradas para p75 NTR acordo com os procedimentos padrão. As células foram contra usando Hoechst para visualizar todos os núcleos C:. Motoneurônios Enriquecido após 5 dias in vitro (5div) em pornô-H e laminina como substratos cultura e na presença de CNTF manchada para β-tubulina III. Note-se que as células têm crescido fora neurites tempo e exibir a morfologia típica, com um motoneurônio mais (ramificada) processo e um ou mais processos mais curtos (axônios e dendritos). Abreviaturas: MN: motoneurônio; div: dias in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Após a dissociação sem Lectin baseado preplating </td></tr><tr><td> Número total de células / SC </td><td> Azul de tripano células positivas [%] </td><td> Células Islet-1/2- positivo [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Média ± SD </td><td> 1.021.0 147,1 ± </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Com lectina baseado preplating </td></tr><tr><td> Número de células após preplating / SC </td><td> Azul de tripano células positivas [%] </td><td> Células Islet-1/2- positivo [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Média ± SD </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Resultados resumo dos procedimentos de isolamento representante para motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da fase E12.5. Partir de três diferentes procedimentos de isolamento especialmente para esse fim são dados como números totais ou números percentuais ± SD. Sigla: SC: medula espinhal; SD: desvio padrão. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 células positivas com p75 panning [%] </td><td> Islet-1 / 2 células positivas com Lectina baseado panning [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Resultados comparação de lectina-based e p75 com base em um número de células panning motoneurônio. São dadas como números percentuais ± SD.

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	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A vantagem desta técnica preplating lectina-base é que é menos caro do que o p75 procedimento NTR baseado panning, e a lectina é mais estável do que os anticorpos. O enriquecimento listados na figura. 2 e Tab. 1 mostra que o procedimento permite a purificação de um número semelhante de células e que a maioria destas células expressam o marcador motoneurônio Islet-1 / 2. O passo mais crítico é o procedimento de isolamento para a medula espinhal lombar. Removendo as meninges e os DRGs (Fig. 2) é essencial para o processo de purificação seguir pela lectina baseado preplating. Se esta tem sido gerido correctamente, quase todas as células expressam o NTR p75 (por imagem representativa ver fig. 3a). A razão para a diferença entre a expressão de Islet-1 / 2 e p75 NTR é provavelmente porque motoneurônios lombar diferencialmente expressa níveis mais altos e mais baixos de Islet-1 / 2 10. Em caso de baixos níveis de expressão Islet-1 / 2 isso pode ter escapado a nossa atenção na coloração immuncytochemical e posterior contagem como fomos rigorosos no que diz respeito às células positivos versus negativos (Tab. 1). Além disso, a Tabela 1 mostra claramente que as células isoladas sobreviver ao procedimento em uma condição saudável, como existem poucos tripan azul células positivas que indicam que as células são irreversivelmente danificados. Este procedimento também permite alterative isolamento de motoneurônios de embriões individuais e, portanto, de ninhadas de ratos genótipo misto embrionárias. Em conclusão, esta alternativa ao procedimento panning com o anticorpo p75 NTR 6 tem capacidades semelhantes, se não idênticos em termos de faixas de possível aplicação e proporciona um método de purificação barato e eficiente alternativa para os motoneurônios embrionárias de camundongos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitina hydrobromide </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas de vidro </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 ou 14 milímetros </td></tr><tr><td> Lectina </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Prato de cultura de células </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon superfície delta </td></tr><tr><td> Soro de cavalo </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Cada lote deve ser testado para a cultura MN </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td></td><td></td><td> Aço inoxidável, tamanho 4 ou 5 </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-inibidor </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ilhota-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Sobrenadante de cultura de células </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Sobrenadante de cultura de células </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Tabela de reagentes e equipamentos específicos.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Motoneurônios espinhais evoluir para estágios pós-mitóticos, através do desenvolvimento do sistema nervoso embrionário e, posteriormente, crescer para fora dendritos e axônios. Células neuroepiteliais do tubo neural que expressam Nkx6.1 são as células precursoras única para motoneurônios espinhais 1. Embora motoneurônios pós-mitóticos avançar para a sua posição final e se organizam em colunas ao longo do trato espinhal 2,3. Mais de 90% de todos estes motoneurônios diferenciado e posicionado expressar os fatores de transcrição Islet 02/01. Eles inervam os músculos dos membros, bem como aqueles do corpo e os órgãos internos. Entre outros, os motoneurônios normalmente expressa os receptores de alta afinidade para o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e neurotrofina-3 (NT-3), a tropomiosina relacionados quinase B e C (TrkB, TrkC). Eles não expressam a quinase tropomiosina relacionadas A 4 (TRKA). Ao lado dos dois receptores de alta afinidade, motoneurônios expressam a baixa afinidade do receptor neurotrofina p75 NTR. A NTR p75 pode ligar todas as neurotrofinas com afinidade semelhante, mas inferior a todos os neurotrofinas que a receptores de alta afinidade seria vincular a neurotrofinas maduro. Dentro da medula espinhal de embriões, a NTR p75 é exclusivamente expressa pelo motoneurônios espinhais 5. Isso tem sido usado para desenvolver técnicas de isolamento motoneurônio para purificar as células da grande maioria das células vizinhas 6. Motoneurônios isolar com a ajuda de anticorpos específicos (panning) contra os domínios extracelulares de p75 NTR acabou por ser um método caro, como a quantidade de anticorpo utilizado para uma única experiência é alto devido ao tamanho da placa utilizada para panning. Uma alternativa muito mais econômica é o uso de lectina. Lectina tem sido demonstrado que especificamente se ligam a p75 NTR também 7. O método a seguir descreve uma técnica alternativa utilizando aglutinina de gérmen de trigo para um procedimento preplating em vez de o anticorpo p75 NTR. A lectina é uma alternativa extremamente barata para o anticorpo p75 NTR e os graus de purificação usando lectina são comparáveis ​​aos do anticorpo p75 NTR. Motoneurônios da medula espinhal de embriões pode ser isolada por este método, sobreviver e crescer fora neurites.

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Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Uma forma alternativa de isolar motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da medula espinhal é descrito. O método leva em consideração o fato de que a lectina pode ligar para a afinidade baixo do nervo receptor do fator de crescimento p75NTR. Este preplating lectina baseado permite uma purificação semelhante ao que, com um anticorpo específico contra o p75NTR.

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K visualizações.  Ruhr-University Bochum. Uma forma alternativa de isolar motoneurônios embrionárias de camundongos a partir da medula espinhal é descrito. O método leva em consideração o fato de que a lectina pode ligar para a afinidade baixo do nervo receptor do fator de crescimento p75NTR. Este preplating lectina baseado permite uma purificação semelhante ao que, com um anticorpo específico contra o p75NTR.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...