Este é o primeiro protocolo para purificar simultaneamente e eficientemente e cultivar neurônios motores oculares e espinhais primários de camundongos embrionários. Permite o estudo de mecanismos subjacentes à doença do neurônio motor. Este protocolo adiciona um novo componente de cultura in vitro oculomotor aos sistemas existentes e fornece espécies puras e culturas de neurônios motores espinhais para comparação.
Na esclerose lateral amiotrófica, os neurônios motores espinhais degeneram enquanto os neurônios oculomotores são relativamente poupados. Comparar essas culturas poderia fornecer insights sobre mecanismo de doença e terapia. Este método facilitará os estudos dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do neurônio motor, doenças e vulnerabilidade seletiva.
Nosso sistema de cultura permite a caracterização da morfologia do neurônio motor, biologia molecular e eletrofisiologia. Para aqueles novos nessa técnica, recomendamos muita prática. A dissecção pode ser tecnicamente desafiadora e vários dissetores podem ser necessários para obter neurônios suficientes para a cultura primária.
Comece colhendo embriões positivos Islet1 EGF de um camundongo grávida aproximadamente 11,5 dias após a fertilização. Pulverize o abdômen completamente com etanol e remova o útero com tesoura de microdisseção estéril e fórceps de curativo. Lave brevemente o útero em PBS estéril.
Em seguida, transfira-o para a placa de dissecção cheia de PBS estéril pré-refrigerado. Sob a luz brilhante do microscópio, remova cuidadosamente os embriões do útero usando tesouras de microdisseção, fórceps de curativo do polegar e pinças Dumont 5. Em seguida, use uma mini colher perfurada Moria estéril para transferir cada embrião para um poço separado de uma placa de 24 poços cheia de hibernação pré-refrigerada E médio de baixa fluorescência suplementado com 1X V27.
Mantendo a placa no gelo, transfira um embrião para uma placa de dissecção estéril e cubra-a completamente com a solução de sal balanceada estéril de Hank ou HBSS. Use pinças para remover a face do embrião e a cauda sem danificar o cérebro médio. Em seguida, coloque o embrião propenso com membros estondo e cauda apontando para a frente do microscópio.
Use pinças para abrir o teto do quarto ventrículo, a fim de gerar uma pequena abertura. Use esta abertura para conectar pinças no espaço criado entre o quarto ventrículo e seu telhado. Disseque ao longo da superfície dorsal do embrião rostral até o córtex e lateral para a placa do chão e coluna motora.
Em seguida, abra o tecido dissecado de forma aberta para revelar os núcleos CN3 e CN4 positivos da GFP. Separe cuidadosamente o cérebro médio ventral do embrião e remova tecido meningeal com pinças e uma faca de microdisseção. Disseque os núcleos positivos do GFP positivo CN3 e CN4 para longe da placa do piso e de outros tecidos circundantes GFP positivos, tomando cuidado para evitar tocar ou danificar os neurônios.
Se coletar núcleos CN3 e CN4 separados, corte ao longo do cérebro médio desses dois núcleos e use uma pipeta P1000 para coletar o tecido de cérebro médio ventral dissecado com HBSS mínimo. Coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro rotulado cheio de meio de dissecção e armazene o tubo no gelo até a dissociação. Continue puxando cérebros médios ventral de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda aos requisitos experimentais.
Para dissecar a medula espinhal ventral, mantenha o embrião propenso com a cabeça virada para a frente do microscópio. Segure-o com um par de pinças e insira a ponta do outro par na parte caudal não aberta do quarto ventrículo. Abra o resto do cérebro traseiro e da medula espinhal dorsalmente sobre toda a extensão rostrocaudal do embrião.
Corte o tecido dorsal a partir do quarto ventrículo e trabalhando em direção ao canal central da medula espinhal caudal usando as fórceps como tesoura. Em seguida, segure o embrião com um conjunto de pinças e belisque o retalho do tecido dorsal de cada lado com o outro par. Remova a medula espinhal ventral usando a faca de microdisseção para perfurar diretamente abaixo do SMN positivo GFP levantando a medula espinhal ventral com movimentos semelhantes à serra em ambos os lados.
Corte a medula espinhal transversalmente no limite superior do membro inferior e remova a porção lombar cervical. Corte transversalmente diretamente acima de C1, onde o primeiro GFP positivo anterior horn projeta. Coloque o lado dorsal da medula espinhal ventral para cima e segure-o pressionando o tecido negativo GFP entre as colunas SMN positivas do GFP com um par de pinças.
Remova o restante do mesenquime anexado, DRGs e medula dorsal, aparando ambos os lados da coluna SMN positiva GFP com a faca de microdisseção. Use uma pipeta P1000 para coletar o tecido da medula espinhal ventral dissecada com HBSS mínimo e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro rotulado cheio de meio de dissecção. Armazene-o no gelo até a dissociação e continue puxando medulas espinhais ventrais de embriões adicionais no mesmo tubo.
Adicione o volume apropriado de solução de papain a cada um dos tubos de microcentrifuuge com as amostras de tecido dissecado. Incubar os tubos a 37 graus Celsius por 30 minutos agitando os tubos a cada 10 minutos por movimento de dedo. Após a incubação, triturar suavemente cada suspensão oito vezes com uma pipeta P200 e centrifuá-la a 300 vezes g durante cinco minutos.
Resuspenque as pelotas celulares com o volume apropriado da solução inibidora de ovomucóide de albumina, pipetando suavemente para cima e para baixo. Repita a centrifugação. Em seguida, remova cuidadosamente o supernaspe com uma pipeta P1000.
Resuspenquei as células no volume apropriado do meio de dissecção. Filtre as suspensões através de um filtro de célula de 70 micrômetros. Em seguida, use a classificação FACS para isolar células positivas GFP dissecadas de CN3/CN4 e SMN.
Diluir as suspensões celulares isoladas com o meio de cultura do neurônio motor pré-aquecido a 37 graus Celsius às densidades apropriadas e adicionar 200 microliters da suspensão a um poço de uma placa de 96 poços revestida de laminina PDL. Cultuize os neurônios em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono certificando-se de atualizar o meio de cultura do neurônio motor a cada cinco dias. Quando os neurônios isolados foram cultivados com sucesso na cultura, culturas cn3/CN4 primárias quase puras e SMN foram obtidas e mantidas por 14 dias in vitro.
As purezas das culturas em dois dias in vitro foram de 93,5% para CN3/CN4 e 86,7% para SMN quando avaliadas pela imunocitoquímica com o marcador de neurônio motor Islet1 e marcador neuronal TUJ1. As purezas dependiam fortemente da idade dos embriões e na definição dos limites apropriados para os portões GFP durante o FACS. A pureza dos neurônios isolados dos embriões E10,5 eram comparáveis aos dos embriões E11,5.
No entanto, a pureza diminuiu significativamente quando foram utilizados embriões E13,5. Para determinar se as CN3/CN4s primárias e as SMNs apresentaram respostas diferenciais aos estressores de ritúlume endoplasmáticos, as células foram tratadas com concentrações variadas de Ácido Ciclopiazônico ou CPA em dois dias in vitro e fixadas três dias depois para imunocitoquímica avaliar as razões de sobrevivência. O número de neurônios viáveis em cada amostra foi contado e as razões de sobrevivência foram calculadas.
As monoculturas CN3/CN4 foram significativamente mais resistentes ao tratamento de CPA em comparação com as monoculturas SMN. Após este procedimento, muitos métodos adicionais podem ser realizados para examinar neurônios motores. Alguns exemplos incluem estudos de eletrofisiologia, biologia celular, transcrição ou acessibilidade à cromatina.
