JB é um companheiro clínico CRUK, AS é um estudante de PhD Wellcome Trust, o laboratório SR é financiado por uma Bolsa de Investigação CRUK Sênior (C99667/A12918). Este trabalho foi apoiado por dois prêmios Estratégicos Wellcome Trust (097945/B/11/Z e 095931/Z/11/Z).

1. Cultura Celular e Tratamento <ol><li> Reúna os reagentes e equipamentos listados na Tabela 1 a cultura osteosarcoma humano células (U2OS). Preparar todos os reagentes e realizar todas as técnicas de cultura de tecidos na câmara de fluxo laminar de ar para assegurar a esterilidade </li><li> Preparar o meio de cultura como se segue: Adicionar 50 ml de FCS, 5 ml de L-glutamina e 5 mL de penicilina / estreptomicina a DMEM para obter concentrações finais de 10% (FCS), 2 mM (L-glutamina), 50 U / ml ( penicilina) e 50 U / ml (estreptomicina). Aquecer o meio de cultura a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Preparar as células para o tratamento de: <ol><li> Esterilizar várias lamelas com etanol a 70%, deixar secar ao ar e colocar um na parte inferior de seis placas de 3,5 centímetros. </li><li> Mergulhar as lamelas em 2 ml de DMEM completo aquecido (37 ° C), pressionando para baixo com os fórceps lamela para garantir que eles permanecem aderidas ao fundo dos poços. </li><li> Retire as células U2OS de seu culto tecidoplaca ure por lavagem uma vez com 3 ml de PBS, a aplicação de 4 ml aqueceu 0,05% de tripsina-EDTA (1%) e incubação a 37 ° C durante 7 min. </li><li> Ressuspender as células em 6 ml aquecido DMEM completo para inativar a tripsina-EDTA e contar com um hemocitômetro. </li><li> Placa 2 x 10 5 células para cada um dos 3,5 centímetros pratos preparados no ponto 1.3.1. Agite suavemente a placa para garantir uma distribuição celular mesmo. Permitir que as células a aderir durante a noite antes do tratamento. </li></ol></li><li> Tratar as células colocando quatro placas de 3,5 cm para a estação de trabalho hipoxia e deixar as outras duas placas de 3,5 centímetros na incubadora a 37 ° C, em condições normais de oxigénio. Esteja pronto para começar o ensaio RNA rotulagem em condições tratadas (na câmara de hipóxia para as células tratadas hipóxia) 1 hora antes do tratamento hipóxia termina. </li><li> Expor as células a hipoxia durante 1 h 15 min, 1 hora e 30 minutos, 2 horas, e 24 horas. Estes momentos são flexíveis e determinados pelo usuário. </li><li> Use um normoxic 3,5 centímetros da placa, como controlo positivo e uma chapa de 3,5 centímetros normóxica tratado com actinomicina D (10 ng / mL de concentração final) durante 4 horas como controlo negativo. Actinomicina D é um inibidor da síntese de ARN global. </li></ol> Cuidados: Hoechst 33342 é um agente mutagênico conhecido. DMSO é conhecido para facilitar a entrada de moléculas orgânicas para os tecidos. NaOH é corrosivo. HCl é corrosivo. Paraformaldeído é altamente tóxico para todos os animais e pode causar a morte de seres humanos. Triton X-100 pode causar irritação na pele após contato direto. Actinomicina D é tóxico quando em contato com a pele ou por ingestão. Tome as devidas precauções ao manusear todos os produtos químicos perigosos. 2. Click-iT Assay <ol><li> Reunir os seguintes reagentes que são necessários para além do kit de ensaio de Click-iT: salino tamponado com fosfato (PBS), pH 7.2 - 7.6, 3,7% de paraformaldeído (PFA) em PBS, 1% Triton X-100 Em PBS, água desionizada (dH2O), dimetil sulfóxido (DMSO), 10 M de hidróxido de sódio (NaOH) e ácido clorídrico a 37% (HCl); Tiras indicadoras de pH - opcional. </li><li> Prepare uma solução estoque fresco PFA antes de realizar a reação Click-lo da seguinte forma: <ol><li> Coloque 1,85 g PFA, 3,5 ml de dH2O e 10 ul de10 M de NaOH para um tubo Falcon de 50 ml. Ferver 300-400 ml de H2O em um copo grande no microondas para fazer um banho de água e estar presente numa hotte. </li><li> Coloque a 50 ml Falcon para o banho de água e agitar suavemente durante 10 minutos, libertando periodicamente a tampa até que o PFA tem dissolvido. </li><li> Seringa a solução PFA através de um filtro de 0,2 um para um outro tubo de 50 ml Falcon, resultando numa solução de 37%. </li><li> Diluir esta 10x adicionando PBS e trazer o pH para 6,8 por adição de cerca de 12 mL de HCl concentrado. Opção: Confirme o pH correto com as tiras indicadoras na coifa. </li><li> Use imediatamente ou guarde overnight a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar as soluções de ações do kit de imagem RNA da seguinte forma: <ol><li> Adicionar 373 uL de dH2O ao componente A, resultando numa solução de estoque de 100 mM de UE. Armazenar a -20 ° C por até um mês. </li><li> Adicionar 85 mL de DMSO a componente B (Alexa Fluor 594) e misture por pipetagem ou vórtex. Armazenar tanto a -20 ° C durante até um ano. </li><li> Adicionar 2 ml de dH 2 O a componente E para criar uma solução 10X de imagiologia ARN reacção kit aditivo tampão. Armazenar a -20 ° C por até um ano, quando descartar solução desenvolve uma cor marrom. </li></ol></li><li> Marcação das células com a UE: Prepare uma solução de trabalho 2X de UE do estoque 100 mM preparada no passo 2.3 em meio completo pré-aquecido (37 ° C) Realize o restante deste passo e passo 2,5 na câmara de hipóxia para células tratadas com hipóxia. . Diluir a 1X, adicionando um volume igual desta solução de trabalho de 2X para o cont mídiaaining células. Incubar durante 1 hora sob condições de cultura de células de tratamento. </li><li> Fixação de células: Lavar cada poço uma vez com PBS e adicionar 1 ml de estoque de 3,7% PFA preparados no passo 2.2 acima, sob condições de tratamento. Incubar durante 15 min sob as condições de tratamento. As amostras tratadas com hipoxia pode ser removida da câmara de hipóxia neste ponto. Retire o fixador e lavar cada poço uma vez com PBS (Tome cuidado para descartar o lixo de forma responsável PFA). Realize os passos seguintes à temperatura ambiente. </li><li> Permeabilização: Remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de 1% de Triton X-100 em PBS a cada poço. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Remover o tampão de permeabilização e lavar cada poço uma vez com PBS. </li><li> Rotulado de Detecção de RNA: <ol><li> Prepara-se uma solução fresca de trabalho de aditivo 1X tampão de reacção kit de imagem de ARN através da diluição da solução de 10X (preparado no passo 2.3) 1:10 em dH2O </li><li> Prepare o kit de imagem RNAcocktail reação de acordo com a Tabela 2 para uso imediatamente após a preparação. </li><li> Remover a solução de lavagem e adicionar 500 mL de imagem RNA cocktail reação kit para cada amostra. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Remova a imagem RNA cocktail reação kit e lave uma vez com 1 ml de tampão de lavagem reação kit de imagem RNA (componente F), em seguida, remova o tampão de lavagem reação kit de imagem RNA. </li></ol></li><li> Reação multiplex Opcional: Execute rotulagem anticorpo adicional de amostras, neste ponto de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> DNA de coloração: Lavar as amostras com PBS, em seguida, remover a solução de lavagem. Dilui-se a Hoechst 33342 (Componente G) 1:1000 em PBS. Adicionar 1 ml de Hoechst 33342 diluído a cada poço e incubar durante 15 min à temperatura ambiente, protegido da luz. Remover a solução de Hoechst 33342 e lavar as células duas vezes com PBS. Retire a solutio lavagemn e proceder à microscopia de luz. </li></ol> 3. Microscopia de Luz <ol><li> Mount Lamelas: <ol><li> Introduzem-se 10 ul de meio de montagem no centro de uma lâmina de microscópio padrão. </li><li> Coloque a lamela com célula de cabeça para baixo no centro da lâmina de microscópio para cobrir a alíquota do meio de montagem. Tome cuidado para evitar a geração de bolhas no meio de montagem, pois isso vai obscurecer a aquisição da imagem subseqüente. </li><li> Furar a lamela para a lâmina de microscópio, aplicando verniz de unhas para seu perímetro. Deixa-se secar durante 5 minutos à temperatura ambiente. Proteger da luz. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C após a montagem. </li></ol></li><li> A aquisição de imagens: Adquirir imagens usando um microscópio de campo amplo capaz de detecção de fluorescência. Aproximado máximos de emissão de fluorescência / excitação do corante Alexa Fluor e Hoechst 33342 ligado ao DNA estão apresentados na Tabela 3. </li><li> Desempenhom de imagem usando uma lente de imersão em óleo 40X/1.30 NA e capturar imagens com uma câmera CCD refrigerado. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Imagens Deconvolve usando o software de processamento de imagem (veja a tabela de materiais) antes de importar para o cliente OMERO. Normalizar tornando definições para todas as imagens no mesmo experimento no software microscópio visualização e análise de imagem, aplicando as configurações de renderização a partir de células normóxicas de controle para todas as outras condições. </li><li> Use a região de interesse (ROI) da ferramenta no software microscópio visualização e análise de imagem (veja a tabela de materiais) para selecionar os núcleos de cada imagem. Obter intensidades médias para cada ROI e calcular a média e desvio padrão para cada condição, escolhendo a opção de análise de intensidade, incluindo um número entre 30-50 células. </li><li> Construir Gráficos de dispersão usando um software de gráficos de dados (veja a tabela de materiais), traçando todos os valores de intensidade média individuais obtidos no passo 4,2 to refletir a variabilidade entre as células em cada condição. Alternativamente construir gráficos de barras para representar intensidade média média mais desvio padrão de RNA nascente. </li></ol>

<ol>
	<li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia.">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li><li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1,+PHD2,+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor.">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li><li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+(FIH)+activity.">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li><li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+under+low+oxygen:+holding+your+breath+for+transcription.">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li><li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq.">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide-alkyne+coupling:+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry.">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+by+copper(I)-catalyzed+azide-alkyne+[3+++2]+cycloaddition.">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMERO:+flexible,+model-driven+data+management+for+experimental+biology.">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li><li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB.">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis:+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+"click+chemistry.">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li></ol>

JRS é fundador de Glencoe Software, Inc., uma empresa comercial norte-americana de código aberto que contribui para OMERO.

Nós descrevemos o uso de um kit de imagem RNA para examinar os efeitos da hipóxia sobre a síntese de RNA em células de osteossarcoma (U2OS). Esta técnica é relativamente simples e fornece dados sobre a transcrição global a um nível de uma única célula. Nós modificamos o protocolo convencional para este kit para incorporar rotulagem em uma câmara de hipóxia. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório do uso desta técnica para medir as mudanças na síntese de RNA em hipóxia. O kit de imagem RNA usamos é adequado para a experimentação em hipóxia, uma vez que não necessita de isótopos radioativos e é tecnicamente compatível com as limitações do trabalho em uma estação de trabalho em atmosfera controlada. Os problemas mais comuns com essa fixação eficiente preocupação técnica e rotulagem da amostra. É extremamente importante que o PFA usado para fixar a amostra é fresco e os passos de lavagem que se seguem a reação &#39;clique&#39; são realizadas como descrito para garantir baixo fundo coloração da amostra. Se background fluorescência torna-se um problema, recomenda-se a lavagem mais uma vez com tampão de lavagem de reacção 1 ml de imagem kit de ARN após o passo 2.7.4. O kit de imagem ARN mencionado aqui, representa um avanço significativo na tecnologia de imagem de RNA em termos de facilidade de utilização e especificidade e velocidade de reacção. Esta técnica é limitada principalmente por o tempo que leva para rotular a amostra. O kit de imagem RNA requer um período de rotulagem 1 hr que impede a análise de mudanças rápidas no RNA global que seriam normalmente ocorrem dentro deste prazo. É por esta razão o nosso primeiro ponto de tempo é restringido a 1 h e 15 min. A técnica está associada com algumas outras limitações que em grande parte se relacionam com reagente de compatibilidade com outros marcadores fluorescentes, por exemplo, este kit de imagem de ARN não é compatível com a coloração com faloidina. Todas as abordagens existentes de estudar a síntese de RNA em células são baseadas na incorporação de nucleósidos modificados para aARN nascente e a detecção de rótulos incorporados por diferentes meios. A abordagem pioneiro foi baseado no uso de precursores de RNA marcadas radioactivamente, seguido por detecção com auto-radiografia. Este método conduziu à descoberta de fases do ciclo celular e outros resultados importantes; no entanto, ele tem uma série de desvantagens, como a morosidade dos trabalhos radioatividade, longos tempos de exposição e imagens de baixa resolução de autoradiografia 6. O próximo avanço no campo explorado meios de imunoquímica para eliminar a necessidade de radioactividade. O ARN foi marcado por incorporação de BrU seguido por detecção imunoquímica. No entanto, o anticorpo eficiente ligação exigido desnaturação de ácidos nucleicos para melhorar o acesso ao DNA ou RNA que causou a perda de morfologia celular e danificou os epítopos de muitas proteínas, impedindo a sua mais detecção com anticorpos marcados com fluorescência 13. A introdução da tecnologia &quot;click chemistry&quot; simplificou o passo de detecção e tele procedimento em comparação com auto-radiografia e imunoquímica. A tecnologia baseia-se na azida-alcino Huisgen reacção de cicloadição onde alcino terminal 5-ethyniluridine liga-se com azida de conjugado com o fluoróforo na presença de Cu (I). A reacção é específica, rápida, não necessita de quaisquer passos adicionais, e é facilmente compatível com a detecção imunoquimica de outros constituintes celulares. Utilizando esta tecnologia de imagem de ARN mostrou que as células que, na mesma população em monocamada, que tem diferentes níveis de síntese de ARN, em resposta a hipoxia. Restringimos nosso experimento para examinar o efeito de apenas a produção de RNA; no entanto, não é de todo possível, com este kit de imagem para realizar o ARN modificados, reacções múltiplas adicionais que permitem uma análise mais complexa de produção de ARN. Por exemplo, a coloração utilizando um anticorpo secundário específico para os marcadores de transcrição activa, tais como os níveis de RNA polimerase II fosforilada ou mesmo componentes da traduçãoMáquinas ção para dar uma indicação da quantidade de RNA presente recém-produzida, que é convertida em proteína são possíveis. Proteínas adicionais, tais como actina, uma proteína que não deve mudar significativamente com a hipoxia, pode ser testado como um controlo adicional. Além disso, diferentes tipos de células pode ser testada, uma vez que é muito provável que diferentes células têm diferentes taxas de síntese de RNA e mesmo diferentes respostas à hipóxia. O uso deste kit de imagem RNA é bastante simples, desde que os passos são realizados tal como descrito. Etapas críticas do protocolo envolver chapeamento celular, fixação e coloração de células e aquisição de imagem. É importante para a chapa das células na densidade descritos para evitar sobre ou sob a confluência de experimentação que irá afetar significativamente o resultado. Também é importante o uso de fixador fresco, garantindo a melhor &quot;instantâneo&quot; da célula é tomada e tomar cuidado ao lavar as células após coloração para reduzir o background a um nível que seja aceitável para análise eficiente. Finalmente, o método de aquisição de imagem é de vital importância para obter imagens que são de uma qualidade boa o suficiente para posterior análise. Recomendamos a utilização do melhor microscópio de luz disponível para examinar amostras opticamente como o microscópio utilizado neste protocolo que está disponível na maioria dos centros de pesquisa intensivos globalmente.

A hipoxia (tensões de oxigênio) ocorre quando o suprimento normal de oxigênio a um tecido é perturbado. Oxigênio ambiental é um nutriente e uma molécula de sinalização, fornecendo pistas importantes para muitos tipos de células. Alterações em oxigénio do meio ambiente são captadas por um grupo de dioxigenases que controlam a actividade de um factor de transcrição essencial da família conhecida como os factores Hypoxia indutíveis (HIFs). Os HIFs são compostos por duas subunidades, α e β. Existem três isoformas conhecidas de HIF-α (1, 2, e 3) e várias variantes de splicing de HIF-1β. HIF-1β é constitutivamente expressa e não regulado por níveis de oxigênio ambientais 1. Os membros da família HIF-α são regulados de forma dinâmica por uma classe de prolil-hidroxilases (PhDs) eo fator de inibição HIF (FIH); ambos os quais necessitam de oxigénio como um co-factor para catalisar a hidroxilação de HIF-α 2,3. Em normóxia os membros da família HIF-α são hidroxiladas e marcou para proteosomal degradação pelo E3-ligase, von Hippel Lindau (BVS). Em hipóxia os doutores e FIH são inativos ou ter uma atividade reduzida. As isoformas de HIF-α fique estabilizada, formam um heterodímero com o HIF-1β, e efectuar a transcrição de genes que proporcionam a resposta celular para o meio ambiente hipóxico (Figura 1A) 4. As técnicas atuais de análise de RNA se concentrar na quantificação dos valores médios em uma determinada população celular. As células respondem a um estímulo hipóxico pela iniciação da transcrição de uma miríade de genes que lhes permitem adaptar-se ao seu ambiente hostil 5. No entanto, a hipoxia frequentemente existe como um gradiente, e as células em um ambiente hipóxico não estão sujeitas a um estímulo hipóxico uniforme. Nós descrevemos uma implementação dos kits de imagem RNA Click-lo em uma estação de trabalho de oxigênio controlado para examinar a síntese de RNA global ao nível da célula individual em hipóxia. O kit de imagem de ARN utiliza um umnucleosídeo lkyne-modificado, 5-etinil-uridina (UE) e ligação quimiosselectiva para permitir a detecção da síntese de ARN mundial temporal e espacialmente, em células e tecidos de 6. Resumidamente, as células são tratadas com hipóxia e cultivadas na presença do UE. Em seguida, são fixadas e permeabilizadas e incorporação da UE em RNA nascente é detectado por ligadura quimiosseletiva de UE com um corante contendo azida. Um fluxo de trabalho típico para esta reacção é mostrado na Figura 1B. Utilizou-se o kit de imagem de ARN para examinar a síntese de RNA no nível de célula única, que resultou do tratamento com hipóxia. A pequena dimensão do tag alcino permite a incorporação eficaz do nucleósido modificado em RNA especificamente. A ligadura quimiosseletiva ou reação &#39;clique&#39; é altamente eficiente, rápido e específico 7-10. Todos os componentes da reacção são bio-inerte e a reacção não necessita de solventes ou a temperaturas extremas. A reação clique negaa exigência de marcação radioactiva convencional e permite a visualização direta dos resultados desde a saída é luz. Além disso, a molécula de detecção pode facilmente penetrar amostras complexas permitindo a análise multiplex, incluindo anticorpos para a detecção de proteínas de RNA interactivo. Este ensaio de imagiologia RNA é compatível com corantes orgânicos, incluindo Alexa Fluor e fluoresceína (ITCF). Nós medimos a mudança na síntese de RNA após o tratamento de nossas células utilizando uma implementação do ambiente de microscopia aberto para objetos remotos (OMERO). OMERO é um software de código aberto, disponível em <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . Este software microscópio visualização e análise de imagem permite o acesso ea utilização de uma ampla gama de dados biológicos, incluindo a gestão de bases de dados multidimensionais, heterogêneos. A aplicação cliente permite a visualização e análise de dados de imagem biológica complexos 11 remoto;ele foi usado para quantificar as mudanças visuais na síntese de RNA celular global e único. Estes dados e os passos necessários para analisar a nossa experiência de imagem RNA usando esta visualização de imagens de microscópio e software de análise são mostrados abaixo. Olhamos para alterações na síntese de RNA mundial após o tratamento de osteossarcoma humano (células U2OS) com hipóxia por até 24 horas. Em todas as condições, detectou variação célula-a-célula no nível de produção de ARN. Tempos curtos de exposição hipóxia não resultou em alterações significativas no nível de RNA nascente nas células. No entanto, a exposição a 24 horas de hipoxia resultou em um aumento significativo na quantidade de ARN produzido em células. A maioria das respostas celulares a hipóxia são medidos após períodos prolongados de exposição, tais como 4 a 24 horas. No entanto, alguns mecanismos são postas em prática muito antes, por exemplo; A activação de NF-kB ocorre dentro de 5-15 minutos de exposição a hipoxia 12. Investigando mais curto hipotempos de exposição xia é, portanto, justifica e poderia prejudicar a respostas mais complicadas, como ciclo celular e apoptose.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1313px;" width="1314">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

A hipoxia ou abaixamento da disponibilidade de oxigénio está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Ao nível molecular, as células iniciam um programa transcricional específico, a fim de montar uma resposta celular adequada e coordenada. A célula possui várias enzimas sensor de oxigênio que necessitam de oxigênio molecular como co-fator para sua atividade. Estes variam de prolil-hidroxilases para demethylases histonas. A maioria dos estudos que analisem a resposta celular a hipóxia são baseados em populações celulares e estudos médios, e, como tal, a análise de células isoladas de células hipóxicas são raramente executado. Aqui nós descrevemos um método de análise da síntese de RNA global ao nível da célula individual em hipóxia usando clique nele kits de imagem RNA em uma estação de trabalho de oxigênio controlada, seguida de análise de microscopia e quantificação. Utilizando as células cancerosas expostas a hipoxia durante diferentes períodos de tempo, o ARN é marcado e medido em cada célula. Esta análise permitea visualização de mudanças temporais e célula-célula em síntese de RNA mundial seguintes estresse hipóxico.

Um esquema da reacção kit de imagem ARN é mostrada na Figura 1B. Usamos essa reação para determinar quantitativamente a síntese de RNA total em células U2OS após o tratamento com hipóxia, tanto a nível global (população de células) individual (uma única célula) e. As células foram tratadas com hipóxia e cultivadas na presença do UE. Eles foram, então, fixadas e permeabilizadas e incorporação da UE foi detectada por ligadura quimiosseletiva da UE com um corante contendo azida. Esse &#39;click&#39; reação resulta em uma emissão de fluorescência que podem ser detectadas e quantificadas por microscopia de luz de fluorescência. Figura 2A mostra um resultado típico a partir desta experiência. Células marcadas com fluorescência são pseudocolored vermelho ea imagem foi aberto no ambiente de microscopia aberto para objetos remotos (OMERO). Este software microscópio visualização e análise de imagens tem um built-in ferramenta de ROI que pode ser usado para selecionar estruturas sub-celulares indivíduoturas e quantitativamente analisar a intensidade da imagem dentro da região escolhida. Um exemplo típico de saída de dados a seguir a utilização desta ferramenta no programa de cliente pode ser visto na Figura 2B; intensidades de células individuais são apresentados juntamente com uma imagem representativa do experimento, que serve como um controlo visual para verificar a validade dos dados. As intensidades de fluorescência das células individuais podem ser representadas como um gráfico de dispersão que mostra a distribuição das intensidades de celulares individuais dentro da população de células tratada. Um exemplo deste tipo de gráfico é visto na Figura 2C. Traçado de dados de intensidade deste modo é útil porque permite uma rápida comparação dos resultados do tratamento e demonstra claramente a heterogeneidade significativa dentro de uma população de células de tratamento, que é outra forma obscurecida usando a representação de dados padrão. A heterogeneidade de resposta é interessante nesta experiência, porque apesar de um estímulo hipóxico uniforme era umpplied para as células, é evidente que todas as células a partir da mesma população de monocamada responde de forma diferente a esse estímulo. Figura 2D mostra o resultado geral do nosso experimento. Intensidades de fluorescência de todas as células dentro de uma população de tratamento foram calculados e plotados neste gráfico de barras. O teste t de Um estudante foi usado para calcular a probabilidade estatística de cada grupo de tratamento diferindo significativamente da testemunha. Curiosamente, estes dados mostram que há um aumento estatisticamente significativo na síntese de RNA mundial ao longo do tempo, quando as células são tratadas com U2OS hipoxia (por vezes superior a 1 hora e 30 minutos * p &lt;0,01;. ** P &lt;0,05 e *** p &lt;0,001 e n&gt; 30). Estes dados mostram que, após longos períodos de tratamento hipoxia, a célula concentra seus esforços na produção de RNA, mesmo neste ambiente hipóxico hostil. Tratamento actinomicina D ablates completamente a intensidade de fluorescência como esperado.<img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema A. O HIF responde a mudanças no oxigênio celular. Neste hipoxia esquemática simplificada estabiliza o heterodímero HIF, impedindo HIF-α hidroxilação (-OH) pelas enzimas prolil hidroxilase (doutores) e sua subsequente polyubquitination por proteína de von Hippel-Lindau (VHL). Resultados de estabilização HIF na ativação de genes que ajudam a miríade respondem celular à hipoxia celular B. síntese de RNA podem ser detectados utilizando o ensaio Click-IT.; As células são rotulados com a UE após o tratamento a reação Click detecta a síntese de RNA que pode ser quantificada pela intensidade de fluorescência e microscopia de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma vers maiores</a>ião desta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> Figura 2. A. Screenshot do OMERO para mostrar saída típica microscópico na rotulagem RNA. Este software microscópio visualização e análise de imagem pode extrair rapidamente dados de intensidade em um nível de células individuais usando a sua macro ROI embutido. Uma imagem da saída deste comando é mostrado na síntese B. global do RNA pode ser inferida a partir da intensidade de células individuais, o intervalo dos quais pode ser visto no gráfico de dispersão C. Uma representação formal desses dados agregados podem ser vistos D. * p &lt;0,01; ** P &lt;0,05 e *** p &lt;0,001 e n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <table border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagentes de cultura celular </td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.2 - 7.6 </td></tr><tr><td> Dulbecco Eagle Modificado (DMEM) </td></tr><tr><td> De soro fetal de vitelo (FCS) filtro esterilizado </td></tr><tr><td> A penicilina / estreptomicina </td></tr><tr><td> L-glutamina </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA (1%) </td></tr><tr><td> Etanol a 70% </td></tr><tr><td> Actinomicina D (1 mg / mL estoque) </td></tr><tr><td> Cultura Celular Equipamento </td></tr><tr><td> Estéril Pasteur Pipettes </td></tr><tr><td> Uma variedade de células tratadas com cultura de utensílios de plástico apropriado para a manutenção e tratamento de células em cultura </td></tr><tr><td> Banho de água regulado a 37 ° C </td></tr><tr><td> Laminar câmara de fluxo de ar </td></tr><tr><td> Incubadora fixada em 37 ° C, 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> Hipóxia Workstation fixada em 37 ° C, 5% de CO 2, 1% de O2 </td></tr><tr><td> Lamínulas </td></tr><tr><td> fórceps de precisão </td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes e equipamentos necessários para a cultura de células U2OS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> Componentes de reacção </td><td colspan="6"> Número de Lamelas </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Tampão de reação RNA clique nele (Componente C) </td><td> 428 mL </td><td> 856 mL </td><td> 1,7 ml </td><td> 2,1 ml </td><td> 2,58 ml </td><td> 4,3 ml </td></tr><tr><td> CuSO4 (Componente D) </td><td> 20 ul </td><td> 40 ul </td><td> 80 mL </td><td> 100 ul </td><td> 120 mL </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Alexa Fluor Azida (Preparada no Passo 2.3) </td><td> 1,8 mL </td><td> 3,7 mL </td><td> 7,4 mL </td><td> 9,3 mL </td><td> 11,28 mL </td><td> 18,8 mL </td></tr><tr><td> Click-iT aditivo tampão de reação (preparada no passo 2.3) </td><td> 50 ul </td><td> 100 ul </td><td> 200 ul </td><td> 250 ul </td><td> 300 ul </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> Aproximado de Volume Total </td><td> 500 ul </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> . Tabela 2 imagem RNA cocktails reação kit: Tabela de referência detalhando proporção de componentes de mistura principal para a reação kit de imagem RNA de acordo com o número de lamelas a ser manchados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fluoróforo </td><td> Excitação (nm) </td><td> Emissão (nm) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342, ligado ao DNA </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . Tabela 3 Fluorescência / excitação maxima emissão: aproximado máximo de emissão de fluorescência / excitação para corante Alexa Fluor e Hoechst 33342 ligado ao DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia at JoVE.com

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Nós descrevemos uma técnica para a análise da síntese de RNA global em hipóxia utilizando imagens. Clique química rotulagem de RNA não tenha sido previamente realizada sob hipóxia e permite a visualização de mudanças globais de RNA no nível da célula única. Esta abordagem complementa as técnicas de RNA médios existentes, permitindo a visualização direta das mudanças célula-célula em síntese de RNA global.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K visualizações.  University of Dundee, UK.  Nós descrevemos uma técnica para a análise da síntese de RNA global em hipóxia utilizando imagens. Clique química rotulagem de RNA não tenha sido previamente realizada sob hipóxia e permite a visualização de mudanças globais de RNA no nível da célula única. Esta abordagem complementa as técnicas de RNA médios existentes, permitindo a visualização direta das mudanças célula-célula em síntese de RNA global. 

Vídeo: Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biologia

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Análise direta de células individuais por Espectrometria de Massa à pressão atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocolo CUBIC Visualiza Protein Expression na resolução única célula em preparações e peles, inteiros Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...