Os autores gostariam de agradecer a contribuição de Meritxell Romeu-Nadal para o estudo ratos.

1. Procedimentos com animais <ol><li> Todo o trabalho animal deve ser realizado de acordo com o escritório de animais domésticos (Scientific Procedures) Act (1986). </li><li> Acasalar ratos Wistar com idade de 10 semanas de idade, por meio de cruzamento monogâmico, e confirmar a gravidez pelo aparecimento de um tampão vaginal. Grave este como o dia 1 de gestação, e começar a dieta experimental. Para as fêmeas virgens, abrigar cada rato individualmente, e começar a dieta experimental. </li><li> Depois de alimentar as dietas experimentais durante 20 dias eutanásia ratos por asfixia CO 2 seguido por deslocamento cervical. </li><li> Use uma pinça de dissecção e tesouras para expor a cavidade abdominal e extirpar o fígado, cortando os ligamentos, que ligam o fígado ao diafragma, parede anterior do abdômen, estômago e duodeno. Lavar o fígado em PBS e congelar em azoto líquido antes da armazenagem à temperatura de -80 ° C. </li></ol> 2. Preparação de um total de lipídeos Extrato 9 <ol><li> Adicionar moleculpeneiras ar (para encher 1/10 do recipiente de solvente) a todos os solventes para criar solventes &quot;secos&quot;. Realizar todos os trabalhos de solvente dentro de um exaustor. </li><li> Cortar cerca de 100 mg de fígado congeladas e pesar. Coloque o tecido em um tubo em um balde de gelo e adicionar 0,8 ml gelada de NaCl 0,9%. Homogeneizar o tecido. </li><li> Adicionar padrões internos dissolvidos em 1 ml / mg de clorofórmio seco: metanol (2:1, v / v) contendo o hidroxitolueno butilado (BHT, 50 mg / l) como anti-oxidante. Para 100 mg de fígado de rato adicionar 100 mg de padrão do CE (Cholesteryl heptadecanoato 17:00) Atenção:. Clorofórmio e BHT são perigosos. </li><li> Adicionar 5,0 ml de clorofórmio seco: metanol (2:1, v / v) contendo BHT (50 mg / L). </li><li> Adicionar 1,0 ml de 1 M NaCl, misturar bem em vórtice até que a mistura parece uniforme. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li><li> Centrifugar a 1000 xg por 10 min, baixo freio à temperatura ambiente. </li><li> Colete menorfase de Pasteur de vidro usando uma pipeta, transferir para novo tubo de vidro com tampa de rosca e seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li></ol> 3. A separação de classes lipídicas por extracção de fase sólida (SPE) 10 <ol><li> Ligar o tanque de SPE com uma bomba de vácuo e coloque aminopropil cartucho de SPE de sílica no tanque. </li><li> Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro TAG rotulados e CE no rack tanque na coluna para coletar primeira fracção. </li><li> Dissolver o extrato de lipídios totais em 1,0 ml de clorofórmio seco e vortex. </li><li> Aplicar a amostra para a coluna utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer para dentro do tubo por meio de rosca, por gravidade. Quando não mais pinga cair, remova o líquido restante por vácuo. </li><li> Eluir a fracção TAG e CE-se sob vácuo, lava-se a coluna com 2 x lavagens de 1,0 ml de clorofórmio seco. </li><li> Quando todo o líquido é removido, secar o TAG e CE fraccionamenton sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li><li> Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro PC rotulado na bandeja de tanque na coluna. </li><li> Eluir a fracção de PC sob vácuo com a adição de 2 x 1,0 ml de clorofórmio seco: metanol (60:40, v / v) até que todo o líquido é removido da coluna. </li><li> Remover e fracção PC seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li><li> Colocar uma nova tampa de rosca do tubo de vidro PE marcado na bandeja do tanque e eluir fracção de PE com a adição de 1,0 ml de metanol seco sob vácuo. </li><li> Remover e fracção de PE seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li><li> Coloque novo tubo de vidro com tampa de rosca rotulado NEFA no tabuleiro de tanque e eluir fracção NEFA sob vácuo com a adição de 2 x 1,0 mL de lavagens de clorofórmio seco: metanol: ácido acético glacial. (100:2:2, v / v / v) Cuidado: ácido acético glacial é perigoso. </li><li> Retirar fracção recolhida NEFA e seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li><li> Coloque um novo cartucho de SPE aminopropil sílica no tanque SPE e colocar um tubo de vidro com tampa de rosca na bandeja do tanque sob o cartucho para coletar resíduos. </li><li> Lavar a coluna com 3 lavagens de hexano seco sob vácuo e, em seguida, uma lavagem de 1,0 ml final, sob acção da gravidade. Não permita que o cartucho se torne seca (transformar os canais de colunas cartucho para uma posição fechada quando o nível de hexano fica perto da matriz cartucho) Cuidado:. Hexano é perigosa. </li><li> Substitua o tubo de resíduos com tubo de vidro novo tampa de rosca rotulado CE. </li><li> Dissolve-se o TAG e CE fracção seca (preparado no passo 3.6) em 1,0 ml de hexano seco e de vórtice. Aplicar esta para a coluna utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer através sob gravity. </li><li> Quando não mais pinga cair, remova o líquido restante sob vácuo. </li><li> Sob vácuo, lava-se a coluna com 2 x 1,0 mL de lavagens de hexano e seco para eluir CE fracção recolhida e seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li><li> Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro TAG marcados na bandeja do tanque e elute TAG com a adição de 2 x 1,0 ml lavagens de hexano seco: metanol: acetato de etilo (100:5:5) sob vácuo. </li><li> Fracção recolhida a seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana Cuidado:. Acetato de etilo é perigoso. </li></ol> 4. Preparação de FAME do CE 10 <ol><li> Adicionar 0,5 ml de tolueno seco à fracção CE separado (recolhido no passo 3.19) e vórtice Cuidado:. Tolueno é perigoso. </li><li> Preparação do reagente de metilação (metanol seco, com 2% (v/ V) de H 2 SO 4), de que é necessário 1,0 ml por amostra. Dispensar volume de metanol seco em recipiente de vidro ou de plástico adequado com a tampa e adicionar a quantidade necessária de H 2 SO 4, gota a gota, em seguida, misturar por inversão Cuidado:. Ácido sulfúrico é perigoso. </li><li> Adicionar 1,0 ml de reagente de metilação para as amostras dissolvidas em tolueno seco, a tampa de forma segura os tubos, e agitar suavemente. </li><li> Aquecer as amostras durante 2 horas a 50 ° C. </li><li> Após 2 horas retirar os tubos de calor. Uma vez que adicionar fresco 1,0 ml (0,25 M KHCO3 0.5MK 2 CO 3) Cuidado neutralizantes:. Bicarbonato de potássio e carbonato de potássio são perigosos. </li><li> Adicionar 1,0 ml de hexano seco e de vórtice. </li><li> Centrifugar a 250 xg por 2 min, baixo freio à temperatura ambiente. </li><li> Recolhe fase superior, que contém a FAME, e transferir para um novo tubo de tampa de rosca não vidro descartável. </li><li> Seque o FAME coletados sobazoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana. </li></ol> 5. Remoção de colesterol livre de contaminação de FAME CE 14 (Colesterol livre pode contaminar a amostra, ver Figura 1 para traços exemplo cromatógrafo com e sem a remoção do colesterol livre). <ol><li> Coloque um tubo de resíduos dentro do tanque de SPE e colocar um cartucho de SPE de sílica gel para o tanque. </li><li> Lavar coluna com 3 x 1 mL lavagens de hexano seco sob vácuo e 1 x 1 ml sob gravidade. </li><li> Remover lavagens de resíduos e adicionar novo tubo de resíduos dentro do tanque. </li><li> Dissolver FAME CE em 1 ml de hexano seco, vórtice. </li><li> Aplicam-se à coluna, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer através sob gravidade. </li><li> Lavar coluna com 3 x 1 mL lavagens de hexano sob vácuo. </li><li> Remover lavagens de resíduos e coloque novo tubo não tampa de rosca em tanque rotulado FAME CE. </li><li> Eluir aFAME CE com 2 x 1 ml de hexano seco: éter dietílico (95:5 v / v) lavagens. </li><li> Seca-se sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana Cuidado:. Éter dietílico é perigoso. </li></ol> 6. Transferência de FAME em GC Auto Sampler Vial <ol><li> Adicionar 75 mL de hexano seco para provar, vortex, e transferir para um frasco de amostra auto GC. </li><li> Adicionar mais 75 mL de hexano seco para provar, vórtice e transferir para a mesma amostra GC auto frasco. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, até um mês. </li></ol> 7. Análise Usando o cromatógrafo a gás 14 <ol><li> Analisar FAME em um cromatógrafo a gás. Exemplo configurar: 30 mx 0,25 mM x 0,25 milímetros BPX-70 fundido coluna capilar de sílica com o protocolo de temperatura: Temperatura inicial de 115 ° C, manter 2 min, rampa de 10 ° C / min até 200 ° C, manter 18,5 min, rampa de 60 ° C / min até 245 ° C, hvelho 4 min. Coluna: gás hélio, vazão de 1,0, pressão de 14,6 e velocidade 29. Injector: Temperatura = 300 ° C. Detector: fluxo de hidrogênio 40,0, ar fluir 184,0, compõem Hélio Gás, Flow 45,0, temperatura = 300 ° C. </li><li> Definir taxa de divisão conforme o caso (por exemplo, 25:1 para análise FAME CE). </li><li> Para determinar a área sob cada pico, utilizando software apropriado e identificar FAME por comparação com padrões. Veja a Figura 2, por exemplo, cromatogramas. </li><li> Usar a área sob os picos de dados para calcular a contribuição de ácidos gordos individuais, como uma percentagem do total de ácidos gordos. </li><li> Calcular as concentrações absolutas dos ácidos gordos através da divisão da área do padrão interno pela quantidade adicionada. Dividir a área de cada um dos ácidos gordos por este resultado para obter concentrações absolutas de cada ácido gordo no interior do volume de tecido utilizado. </li></ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+erythrocyte+membrane+Trans+and+marine+fatty+acids+between+1999+and+2006+in+older+Americans.">Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans.</a> J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).</li><li>Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+fat:+An+introduction+to+lipidomic+profiling+method.">A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method.</a> J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A cromatografia gasosa é uma técnica precisa de usar para análise de ácidos graxos, e sua alta reprodutibilidade considere esta técnica adequada para análises clínicas. Colunas GC apropriadas deve ser utilizado para permitir a identificação dos ácidos graxos de interesse, com colunas disponíveis tendo variações na polaridade da fase estacionária, o comprimento da coluna e do diâmetro interno. A utilização de uma coluna capilar de sílica fundida no presente método de análise proporciona uma boa estabi...

Cromatografia em fase gasosa (GC) é uma técnica bem estabelecida utilizada para identificar e quantificar a incorporação de ácidos gordos para piscinas lipídicas e das membranas celulares durante 1,2 ou suplementação condições fisiológicas, tais como a obesidade (e doenças relacionadas tais como diabetes) ou gravidez 3 - 5. Também é adequado para a análise dos tipos e quantidades de gorduras em alimentos. Isto é útil na caracterização dietas experimentais, bem como garantir que a indústria de alimentos está em conformidade com os regulamentos. Por exemplo, GC, pode ser utilizado para confirmar a identidade e a quantidade de ácidos gordos num produto, como um suplemento dietético para assegurar que a rotulagem é correcta e regulamentos são respeitados 6,7. Análise de ácidos graxos podem fornecer informações valiosas sobre o metabolismo lipídico na saúde e na doença, o impacto da mudança na dieta, e os efeitos das mudanças no estado fisiológico 8. A utilização de GC para estudar amostras durante a gravidez tem proporcionado importanteinformação sobre alterações no ácido graxo e complexo homeostase lipídica 3. Antes da separação cromatográfica, os lípidos são tipicamente extraída da amostra, utilizando a solubilidade dos lípidos em misturas de solventes de clorofórmio e metanol. O cloreto de sódio é adicionado a fim de facilitar a separação da mistura de lípidos em solução aquosa e orgânica contendo 9,10 fases. Classes de lípidos complexos de interesse podem ser separados a partir do extracto de lípido total por extracção de fase sólida (SPE). Esta técnica de separação elui classes de lipídios com base em sua polaridade ou afinidade de ligação. Triacyglycerols (TAG) e éster de colesterol (EC) são eluidos primeiro como uma fracção combinada, outras classes, a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), e os ácidos gordos não esterificados (NEFA) são eluídas por aumento da polaridade do solvente de eluição . A separação do TAG da CE explora a ligação da TAG apenas a um cartri SPE frescodge, permitindo CE a ser eluído. TAG pode então ser eluída por aumento da polaridade do solvente de eluição 9,10. Este método permite que várias amostras a serem separados, simultaneamente, com um rendimento mais elevado do que é conseguido com a cromatografia em camada fina, o que significa que relativamente pequenas amostras de tamanho (por exemplo, &lt;100 ul de plasma ou soro, &lt;100 mg de tecido) podem ser analisados ​​11,12. CG é uma técnica bem estabelecida primeiro descrita em 1950, e foi sugerido que a fase móvel, em seguida, os sistemas de líquido-líquido pode ser substituído por vapor. Ele foi inicialmente usado para a análise de petróleo, mas rapidamente se expandiu para outras áreas, como análise de aminoácidos e bioquímica lipídica, que ainda é de grande interesse. Avanços na tecnologia e equipamento de GC, como o desenvolvimento de colunas capilares das colunas empacotadas utilizadas anteriormente conduziu a nossas técnicas actuais, em que os ácidos gordos são capazes de serseparadas de forma mais eficiente a baixas temperaturas, resultando em GC sendo rotineiramente utilizado para identificar e quantificar os ácidos gordos numa vasta gama de investigações 13. GC requer ácidos gordos de ser derivatizados de modo que eles podem tornar-se suficientemente volátil para ser eluída a temperaturas razoáveis ​​sem decomposição térmica. Isto normalmente envolve a substituição de um grupo funcional contendo hidrogénio para formar ésteres, tioésteres ou amidos para análise. Os ésteres metílicos são vulgarmente estudada derivados, os quais são produzidos por metilação. Neste método, as ligações éster em lípidos complexos são hidrolisados ​​para libertar os ácidos gordos livres, que são transmethylated para formar os ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAME). O perfil resultante de FAME, determinada por GC, é referida como a composição de ácidos gordos e podem ser facilmente comparadas entre os diferentes grupos experimentais 9,10. A técnica permite que ambas as proporções de indiácidos gordos e as suas concentrações ual a ser medido. Em adição à utilização de GC para análise de ácidos gordos em estudos de nutrição e na indústria alimentar, a técnica pode ser utilizada numa vasta gama de campos de análise. Por exemplo, as análises ambientais utilizando GC incluem a medição da contaminação da água por inseticidas e análises do solo medição do teor de clorobenzeno. Em toxicologia, GC também tem sido utilizada para identificar substâncias ilegais na urina e amostras de sangue de indivíduos; um tal de aumentar o rendimento desportivo de 12 e a capacidade de separar misturas complexas de hidrocarbonetos torna esta técnica popular na indústria do petróleo para a análise petroquímica 12. A gravidez está associada com alterações significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos, especificamente no conteúdo de ácidos graxos ômega-3 (n-3) e ômega-6 (n-6) aci graxos poliinsaturadosds (PUFA) 3. No estudo actual, que exemplificam o uso de GC na medição de ácidos gordos, descrevendo a sua utilização na análise da composição de ácido gordo do tecido do fígado de ratos virgens feita grávidas e alimentados com dietas de baixo e alto teor de gordura, com diferentes fontes de petróleo. As dietas experimentais foram fornecidas aqui uma dieta de baixa gordura à base de óleo de soja, uma dieta à base de óleo de soja rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg de gordura total) ou de uma dieta à base de óleo de linhaça rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg dieta), desde há 20 dias. A composição de ácidos gordos e nutrientes completo destas dietas têm sido descritos anteriormente 14. As dietas com óleo de soja são ricas em ácido linoleico (18:2 n-6) e conter algum ácido linolénico-α (18:3 n-3) ao passo que a dieta de óleo de linhaça é rico em ácido linolénico-α. Estas dietas de alta gordura representam diferentes rações de linoléico para α-linolênico (rações de 08:01 e 01:01, respectivamente). O método para o isolamento de classes de lípidos individuais e análise por GC que éll estabelecido e validado, e tem sido publicado anteriormente 10, mas sem a descrição técnica pormenorizada aqui encontrados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methanol:</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform:</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHT:</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>W218405</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Dust fumes - Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H/0406/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>695084</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Burns - 99.85%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Burns - 99.999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>209619</td>
			<td>99% ACS Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>237205</td>
			<td>99.7% ACS Reasgent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10204340</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - 99+% GLC SpeciFied</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T/2300/15</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>309966</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (oxygen free) cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>44-w</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Compressed gas - explosion risk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl silica SPE cartridges</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12102014</td>
			<td>Cartridge - Bead mass 100mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel SPE cartidges</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>14102010</td>
			<td>Cartridge - Bead mass 100mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular seives</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>334324</td>
			<td>Pellets, AW-300, 1.6mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass test tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB59527</td>
			<td>Non-screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw thread glass test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB59555</td>
			<td>13mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for screw thread test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB51353</td>
			<td>To fit 13mm tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solida phase extraction (SPE) tank</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>VacElut 20 Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stopcocks for SPE tank</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>2656-194GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC vials</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>STV 12-03TS</td>
			<td>Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC vial lids</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>SCC09-0.2B</td>
			<td>Short thread 9mm blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC inlet liners</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>092002</td>
			<td>Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC septa</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>041856</td>
			<td>11mm, MN material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC column</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>054612</td>
			<td>Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HP 6890 series</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of gas chromatography to analyze compositional changes of fatty acids in rat liver tissue during pregnancy

Cromatografia em fase gasosa (GC) é um método altamente sensível para identificar e quantificar o teor de ácidos graxos de lipídios a partir de tecidos, células e plasma / soro, produzindo resultados com alta precisão e alta reprodutibilidade. Em estudos metabólicos e nutricionais GC permite a avaliação de alterações nas concentrações de ácidos graxos seguintes intervenções ou durante mudanças no estado fisiológico, como a gravidez. Extracção em fase sólida (SPE) com aminopropilo cartuchos de sílica permite a separação das principais classes de lípidos incluídos triacilgliceróis, fosfolípidos diferentes, e ésteres de colesterol (CE). GC combinada com SPE foi utilizado para analisar as mudanças na composição de ácidos graxos da fração CE nos fígados de ratos virgens e grávidas que tinham sido alimentados várias dietas de alto e baixo teor de gordura. Há efeitos significativos de interação dieta / gravidez sobre o teor de ácido ômega-3 e ômega-6 ácidos graxos do fígado CE, indicando que as fêmeas grávidas têm uma resposta diferente para Manipulat dietéticoíon que é visto entre as mulheres virgens.

O sucesso deste método depende da sequência do protocolo de forma precisa e em utilizar solventes e reagentes de limpeza, a fim de reduzir o &quot;ruído&quot; e contaminação que podem aparecer em um cromatograma. Amostras contaminadas são mais difíceis de analisar, diminuindo a precisão da área sob a curva de cálculos. Se o protocolo é seguido com sucesso um cromatograma com claras simétricas, picos bem definidos e com um mínimo de ruído de fundo deve ser obtido tal como ilustrado na Figura 3.</str...

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The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gravidez leva a mudanças significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos. Perfil lipídico pode ser obtido através de cromatografia de gás para permitir a identificação e quantificação de ácidos graxos em classes de lipídios individuais entre ratos alimentados com dietas ricas em gordura vários altos e baixos durante a gravidez.

O uso de cromatografia gasosa para analisar composicional Alterações de ácidos graxos no tecido de fígado de rato durante a gravidez

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

29.9K visualizações.  University of Southampton.  Gravidez leva a mudanças significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos. Perfil lipídico pode ser obtido através de cromatografia de gás para permitir a identificação e quantificação de ácidos graxos em classes de lipídios individuais entre ratos alimentados com dietas ricas em gordura vários altos e baixos durante a gravidez. 

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue located at or near the N-terminus of a helix is often more acidic than that at or near the C-terminus 1-6. Although extensive experimental studies on the acid-base properties of peptides have been carried out in the condensed phase, in particular in aqueous solutions 6-8, the results are often complicated by solvent effects 7. In fact, most of the active sites in proteins are located near the interior region where solvent effects have been minimized 9,10. In order to understand intrinsic acid-base properties of peptides and proteins, it is important to perform the studies in a solvent-free environment.
We present a method to measure the acidities of oligopeptides in the gas-phase. We use a cysteine-containing oligopeptide, Ala3CysNH2 (A3CH), as the model compound. The measurements are based on the well-established extended Cooks kinetic method (Figure 1) 11-16. The experiments are carried out using a triple-quadrupole mass spectrometer interfaced with an electrospray ionization (ESI) ion source (Figure 2). For each peptide sample, several reference acids are selected. The reference acids are structurally similar organic compounds with known gas-phase acidities. A solution of the mixture of the peptide and a reference acid is introduced into the mass spectrometer, and a gas-phase proton-bound anionic cluster of peptide-reference acid is formed. The proton-bound cluster is mass isolated and subsequently fragmented via collision-induced dissociation (CID) experiments. The resulting fragment ion abundances are analyzed using a relationship between the acidities and the cluster ion dissociation kinetics. The gas-phase acidity of the peptide is then obtained by linear regression of the thermo-kinetic plots 17,18.
The method can be applied to a variety of molecular systems, including organic compounds, amino acids and their derivatives, oligonucleotides, and oligopeptides. By comparing the gas-phase acidities measured experimentally with those values calculated for different conformers, conformational effects on the acidities can be evaluated.

The determination of the gas-phase acidities of cysteine-containing oligopeptides is described. The experiments are performed using a triple quadrupole mass spectrometer. The relative acidities of the peptides are measured using collision-induced dissociation experiments, and the quantitative acidities are determined using the extended Cooks kinetic method.

Determinação da acidez em fase gasosa de Oligopeptídeos

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Química

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Quantitative Detection of Trace Explosive Vapors by Programmed Temperature Desorption Gas Chromatography-Electron Capture Detector

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive vapor samples. The direct liquid deposition method yields a higher fidelity between the analysis of vapor samples and the analysis of solution standards than using separate injection methods for vapors and solutions, i.e., samples collected on vapor collection tubes and standards prepared in solution vials. Additionally, the method can account for instrumentation losses, which makes it ideal for minimizing variability and quantitative trace chemical detection. Gas chromatography with an electron capture detector is an instrumentation configuration sensitive to nitro-energetics, such as TNT and RDX, due to their relatively high electron affinity. However, vapor quantitation of these compounds is difficult without viable vapor standards. Thus, we eliminate the requirement for vapor standards by combining the sensitivity of the instrumentation with a direct liquid deposition protocol to analyze trace explosive vapor samples.

Trace explosive vapors of TNT and RDX collected on sorbent-filled thermal desorption tubes were analyzed using a programmed temperature desorption system coupled to GC with an electron capture detector. The instrumental analysis is combined with direct liquid deposition method to reduce sample variability and account for instrumentation drift and losses.

Detecção quantitativa de rastreamento vapores explosivos por temperatura programada Desorption Gas Chromatography-Electron Captura Detector

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive ...

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

Uso de Nucleotídeos stopped-flow de fluorescência e rotulados para analisar o ciclo de rotatividade ATP de cinesinas

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Facile Preparation of 4-Substituted Quinazoline Derivatives

Reported in this paper is a very simple method for direct preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from a reaction between substituted 2-aminobenzophenones and thiourea in the presence of dimethyl sulfoxide (DMSO). This is a unique complementary reaction system in which thiourea undergoes thermal decomposition to form carbodiimide and hydrogen sulfide, where the former reacts with 2-aminobenzophenone to form 4-phenylquinazolin-2(1H)-imine intermediate, whilst hydrogen sulfide reacts with DMSO to give methanethiol or other sulfur-containing molecule which then functions as a complementary reducing agent to reduce 4-phenylquinazolin-2(1H)-imine intermediate into 4-phenyl-1,2-dihydroquinazolin-2-amine. Subsequently, the elimination of ammonia from 4-phenyl-1,2-dihydroquinazolin-2-amine affords substituted quinazoline derivative. This reaction usually gives quinazoline derivative as a single product arising from 2-aminobenzophenone as monitored by GC/MS analysis, along with small amount of sulfur-containing molecules such as dimethyl disulfide, dimethyl trisulfide, etc. The reaction usually completes in 4-6 hr at 160 &#186;C in small scale but may last over 24 hr when carried out in large scale. The reaction product can be easily purified by means of washing off DMSO with water followed by column chromatography or thin layer chromatography.

A protocol for facile preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from 2-aminobenzophenones, thiourea and dimethyl sulfoxide is presented.

Preparação Facile de derivados de quinazolina 4-substituída

Reported in this paper is a very simple method for direct preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from a reaction between substituted ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando Eletroforese Capilar para quantificar ácidos orgânicos a partir de tecido da planta: um caso de teste de exame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Sementes

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Raman and IR Spectroelectrochemical Methods as Tools to Analyze Conjugated Organic Compounds

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule on the vibrational level of energy. Raman and IR spectroelectrochemistry can be used for advanced characterization of the structural changes in the organic electroactive compounds. Here, the step-by-step analysis by means of Raman and IR spectroelectrochemistry is shown. Raman and IR spectroelectrochemical techniques provide complementary information about structural changes occurring during an electrochemical process, i.e. allows for the investigation of redox processes and their products. The examples of IR and Raman spectroelectrochemical analysis are presented, in which the products of the redox reactions, both in solution and solid state, are identified.

A protocol of step-by-step Raman and IR spectroelectrochemical analysis is presented.

Raman e IR Spectroelectrochemical métodos como ferramentas para analisar compostos orgânicos conjugados

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

Um método de cromatografia de gás de Pyrolysis de duas etapas com detecção espectrométrica de massa para identificação de ingredientes de tinta de tatuagem e produtos falsificados

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Nitrogen Compound Characterization in Fuels by Multidimensional Gas Chromatography

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is crucial. There are significant challenges to overcome when measuring trace compounds in a complex matrix such as fuels. Background interferences and matrix effects can create limitations to routine analytical instrumentation, such as GC-MS. In order to facilitate specific and quantitative measurements of trace nitrogen compounds in fuels, a nitrogen-specific detector is ideal. In this method, a nitrogen chemiluminescence detector (NCD) is used to detect nitrogen compounds in fuels. NCD utilizes a nitrogen-specific reaction that does not involve the hydrocarbon background. Two-dimensional (GCxGC) gas chromatography is a powerful characterization technique as it provides superior separation capabilities to one-dimensional gas chromatography methods. When GCxGC is paired with a NCD, the problematic nitrogen compounds found in fuels can be extensively characterized without background interference. The method presented in this manuscript details the process for measuring different nitrogen-containing compound classes in fuels with little sample preparation. Overall, this GCxGC-NCD method has been shown to be a valuable tool to enhance the understanding of the chemical composition of nitrogen-containing compounds in fuels and their impact on fuel stability. The % RSD for this method is &#60;5% for intraday and &#60;10% for interday analyses; the LOD is 1.7 ppm and the LOQ is 5.5 ppm.

Here, we present a method utilizing two-dimensional gas chromatography and nitrogen chemiluminescence detection (GCxGC-NCD) to extensively characterize the different classes of nitrogen-containing compounds in diesel and jet fuels.

Caracterização do composto de nitrogênio em combustíveis por cromatografia multidimensional de gás

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is ...