O protocolo apresentado permite quantificar uma ampla gama de lipídios em tecidos animais. É uma ferramenta fácil para estudar mecanismos lipídicos e também para identificar biomarcadores que indicam toxicidade precoce em modelos animais. O método fornece um perfil quantitativo de mais de 400 lipídios moleculares em 14 classes lipídicas diferentes em uma ampla variedade de matrizes de amostra com um tempo de tendência de 10 minutos por amostra.
Para começar, dilua a alíquota da centrífuga 1 sobrenadante duas vezes a concentração com tampão de bicarbonato de amônio. Após a preparação da curva padrão de albumina de soro bovino, vórtex os tubos padrão e centrifugar os tubos a 18, 200 g por 15 segundos à temperatura ambiente. Dos tubos padrão preparados anteriormente, transfira 6 microlitros de cada um dos brancos, padrões e amostras para uma placa de fundo plano de 96 poços.
Em seguida, adicione 250 microlitros do reagente Bradford a cada poço usando uma pipeta multicanal e misture. Após incubar por 5 minutos, meça a absorbância em um comprimento de onda de 595 nanômetros usando um leitor de placas. Prepare tubos de 2 mililitros com 100 microlitros de solução de bicarbonato de amônio em cada tubo do branco total e do padrão interno em branco e mantenha todas as amostras no gelo.
Preparar amostras de controle de qualidade, considerando que uma amostra de controle de qualidade é colocada entre cada conjunto de 10 amostras. Adicione 10 microlitros de plasma humano agrupado a tubos de 2 mililitros e, em seguida, coloque 10 microlitros de solução padrão interna em todas as amostras de padrão interno em branco, controle de qualidade e estudo. Adicionar 300 microlitros de mistura de metanol butanol de menos 20 graus Celsius a cada amostra e agitar a 450 g durante 10 minutos à temperatura ambiente em termomisturador.
Em seguida, adicione 300 microlitros da mistura de acetato de etila heptano e agite a 450 g por 10 minutos à temperatura ambiente no termomisturador, em seguida, adicione 300 microlitros de mistura de ácido ascético a 1% e agite por 5 minutos a 450 g à temperatura ambiente no termomisturador. Centrifugar a 2.800 g por 5 minutos à temperatura ambiente e transferir 360 microlitros da fase superior para um novo tubo autoblocante de 2 mililitros rotulado como 2. Depois de adicionar 320 microlitros de acetato de etila de heptano ao tubo de fase de água rotulado como 1, agitar a 450 g durante 5 minutos à temperatura ambiente no termomisturador e, em seguida, centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos à temperatura ambiente, como demonstrado anteriormente.
Transfira 320 microlitros da fase superior e combine-os com a fração da etapa anterior no tubo 2. Da mesma forma, adicionar 250 microlitros de acetato de etila de heptano à fase aquosa no tubo 1 e agitar a 450 g por 5 minutos à temperatura ambiente no termomisturador. Novamente, centrifugar a 2.800 g por 5 minutos à temperatura ambiente, depois transferir 200 microlitros da fase superior e combiná-la com as frações das etapas anteriores no tubo 2.
Evaporar até secar a 35 graus Celsius em um concentrador a vácuo e dissolver novamente em 300 microlitros de solução de mistura MS. Vórtice cada tubo por 5 segundos para garantir que tudo esteja dissolvido e centrifugue a 18, 200 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Transfira uma alíquota de 50 microlitros para a placa de microlitros para análise do modo de ionização positiva e dilua com 50 microlitros de solução de mistura MS.
Novamente, diluir com 80 microlitros de mistura MS e transferir uma alíquota de 20 microlitros para a placa MTP para análise do modo de ionização negativa. Embrulhe a placa com papel alumínio e mantenha a 4 graus Celsius antes da análise. Calibrar um MS nos modos positivo e negativo de acordo com as instruções do fabricante 5 dias ou menos antes da análise.
Instale a nanofonte de infusão direta antecipadamente, garantindo que ela esteja devidamente alinhada contra o capilar de transferência do MS e um chip de bico de 4,1 micrômetros no suporte do chip, em seguida, verifique os parâmetros para infusão positiva e negativa correspondentes a uma pressão de gás de 1,25 psi, tensão de fonte de 1,1 quilovolt, 5 microlitros de volume de injeção de amostra, fechamento de contato de saída Rel1 por 2,5 segundos, 5 minutos de tempo de entrega, resfriamento da placa a 4 graus Celsius, em seguida, configure o controlador de temperatura e crie uma nova placa. Para o modo positivo, verifique e ajuste o software se o método MS está configurado com uma temperatura capilar de 250 graus Celsius e o nível de RF da lente S em 65,0. No software Xcalibur, abra o método positivo e verifique se a aquisição completa de MS está configurada de zero a 1 minuto na faixa de 550 a 1.000 m/z com resolução de 140.000 com controle de ganho automatizado de 1 milhão e tempo máximo de injeção de 50 milissegundos.
Aplique a massa de bloqueio de 680,48022. Verifique se o método de aquisição MS/MS independente de dados está configurado entre o intervalo de tempo de 1 e 5 minutos com resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 250 m/z. Verifique se o controle de ganho automatizado para MS2 está configurado em 100.000 e um tempo máximo de injeção em 64 milissegundos, uma energia de colisão de 20 NCE, a janela de isolamento em 1 m/z e se uma lista de massa de inclusão de 398 a 1.100 m/z é usada com um passo de massa de 1 Dalton.
Para a aquisição em modo negativo, verifique no software de sintonia se o método MS está configurado com a temperatura capilar a 250 graus Celsius no nível de RF da lente S a 65,0 no arquivo de sintonia MS. Em seguida, no software Xcalibur, verifique se o modo de aquisição de varredura completa está configurado de zero a 1 minuto com resolução de 140.000, cobrindo a faixa de 400 a 940 m/z, controle de ganho automatizado de 1 milhão, tempo máximo de injeção de 200 milissegundos e massa de bloqueio de 526,46262. Verifique se a aquisição MS2 no modo DIA está configurada entre 1 e 5 minutos da corrida em uma resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 150 m/z, controle de ganho automatizado de 100.000, 64 milissegundos de tempo máximo de injeção e 35 NCE de energia de colisão usando a lista de massa de inclusão de 400 a 940 com um passo de massa de 1 Dalton.
Crie a fila de sequência de análise no software Xcalibur no modo positivo e acione-a, em seguida, crie a sequência no software ChipSoft e inicie a análise enquanto aguarda que a aquisição da amostra seja acionada por um sinal de fechamento de contato proveniente do robô de infusão direta para cada amostra. Quando a análise em modo positivo estiver concluída, crie a fila de sequência de análise no software Xcalibur no modo negativo e acione-a, em seguida, crie a sequência no software ChipSoft e inicie a análise enquanto aguarda que a aquisição da amostra seja acionada por um sinal de fechamento de contato proveniente do robô de infusão direta para cada amostra. A concentração total normalizada de lipídios foi identificada e quantificada a partir das 14 classes lipídicas mais abundantes, que foi ligeiramente elevada para as classes lipídicas PE, PEO, PC, PCO, PI e PG e alguma regulação negativa foi observada para os lipídios SM, LPE e PA.
Enquanto nenhuma diferença pôde ser vista para TAGs e PS. Esses resultados também mostram que, entre as características moleculares baseadas na fórmula molecular total, 100 a 120 compostos foram significativamente impactados pela exposição à fumaça do cigarro. A deconvolução da fragmentação da MS2 e a normalização das intensidades de sinal dos fragmentos permitiram a definição aproximada da quantidade total de cada ácido graxo conjugado representado em cada vidro lipídico e a comparação desses dados entre os grupos exposto e controle. Observou-se diminuição de ácidos graxos totalmente saturados e poucos insaturados, enquanto os ácidos graxos poli-insaturados na composição das classes fosfolipídicos PC, PE e PG foram elevados no grupo fumaça de cigarro para todos os momentos.
Os casos extremos de PC e PG conjugados com ácido eicosapentaenoico e docosahexaenóico foram detectados exclusivamente no grupo de exposição ao 3R4F CS. A pipetagem da amostra e da amostra de CQ deve ser feita com pontas de banda baixa e ser precisa, o que significa que as pontas devem ser verificadas entre cada amostra. A pipetagem da solução padrão interna é crítica e precisa ser precisa.
A solução de 1 a 1 metanol diclorometano deve ser manuseada com cuidado e um não plastificante contendo pontas deve ser usado para evitar ter polímeros plásticos nas amostras. As pontas devem ser trocadas entre cada amostra.
