Nós projetamos anteriormente um dispositivo para aplicar tensão mecânica em células aderentes. No trabalho atual, redesenhamos a geometria do substrato e personalizamos a configuração para imagens de alta resolução dessas células de cepa. A principal vantagem deste sistema de alongamento celular é que ele fornece uma imagem subcelular de alta resolução a 100x das células de cepa.
Demonstrando a fabricação do substrato estará Vicki, uma assistente de pesquisa do meu laboratório. Comece projetando um molde de polidimimetilsiloxano de um único poço seguindo o protocolo de texto que acompanha. Em seguida, misture 20 partes de uma base de polidimetilsiloxano com uma parte de agente de cura em um copo descartável.
Uma vez misturado, coloque a mistura de polidimotilatilaxitano em um desmoxicar a vácuo a 0,8 bar por 30 minutos para remover as bolhas da mistura. Em seguida, despeje a mistura de polidimotilatilaxano no molde e no prato. Remova quaisquer bolhas adicionais nesta fase, desausem-la novamente no vácuo de 0,8 bar por 30 minutos.
Quando o desassador estiver completo, asse as amostras a 80 graus Celsius em uma mesa de nivelamento por duas horas. Em seguida, remova cuidadosamente as amostras do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Corte as bordas com uma lâmina e retire delicadamente o polidimimetilsiloxano curado.
Na rede de 150 milímetros de diâmetro polidimtilsiloxano, desenhe uma grade de dois centímetros por dois centímetros com um marcador. Dentro de cada quadrado, desenhe um centímetro por um centímetro quadrado, deixando uma margem de 0,5 centímetros por todos os lados. Use uma lâmina para cortar cuidadosamente ao longo das linhas e obter compartimentos quadrados.
Em seguida, limpe as amostras incubando-as em 100% acetona por quatro horas, 100% etanol por mais quatro horas e, em seguida, em água autoclavada por quatro horas. Coloque as amostras limpas em papel de apoio de filme de parafina dentro de um prato plástico de 150 milímetros de diâmetro e seque a amostra em um forno de 80 graus Celsius por quatro horas. Quando terminar, sele os pratos com filme de parafina e guarde-os em uma sala fria até usar ainda mais.
Prepare células progenitoras e suspenda-as em meio de proliferação. Semear essas células a uma densidade de 35.000 células por centímetro quadrado em superfícies plásticas revestidas de PDL. Ajuste o volume do meio de proliferação para três mililitros por dez centímetros quadrados de área de superfície.
Um volume menor de mídia pode levar ao agrupamento celular, decorrente de forças de tensão superficial, enquanto um maior volume de mídia nos pratos pode fazer com que a mídia se espalhe. No terceiro dia após a semeadura, colde as células e conte-as usando um hemócito. Em seguida, sementes 35.000 células por placa de polidimetilsiloxano com 700 microliters de meio de proliferação.
Em seguida, adicione uma construção plasmática para rotular os complexos histítonos H2B da célula com proteína fluorescente verde seguindo as instruções do fabricante. Após 24 horas, monte as amostras de polidimtilsiloxano com células a serem esticadas no dispositivo de cepa uniaxial. Em seguida, mude o meio em todas as amostras para meio de diferenciação.
Meça o comprimento do compartimento celular não treinado e gire o parafuso do micrômetro do estágio para aumentar o comprimento do compartimento celular pela quantidade desejada de tensão. Deixe as amostras de polidimtilsiloxano esticadas e não esticadas na incubadora a 37 graus Celsius até a imagem. Prepare a incubadora de microscópio para imagens ao vivo, definindo a temperatura da incubadora para 37 graus Celsius.
Em seguida, traga um objetivo de imersão de óleo 100x para a posição central, já que o turnit objetivo não será acessível mais tarde. Uma vez em posição, desaparafusar o objetivo e enrosca-lo novamente com um anel objetivo, para que o objetivo possa ser aproximado das células. Em seguida, adicione uma gota de óleo ao objetivo.
Usando um suporte personalizado, cubra o suporte com graxa de vácuo na periferia da janela e coloque uma tampa de vidro de espessura zero na superfície superior do suporte. Grave a janela de plástico no estágio do microscópio. Em seguida, enrosque um estágio de tradução Z no estágio do microscópio e mova-o para a posição mais alta Z.
Remova 500 microliters do meio da placa de polidimetilsiloxano esticada para ser imageada e adicione este meio ao deslizamento de tampa de vidro na janela de plástico branco. Em seguida, use um par de pinças estéreis para desprender cuidadosamente o compartimento quadrado da placa de polidimtilsiloxano. Segure o dispositivo de tensão em uma posição vertical para que as células estejam voltadas para cima, acima da janela de plástico branco e inverta cuidadosamente o dispositivo de tensão, de modo a deixar qualquer meio extra cair diretamente no meio da tampa de vidro com as células voltadas para baixo.
Coloque a parte inferior do dispositivo de tensão no estágio de tradução Z usando fita dupla face para mantê-la no lugar. Ao olhar através da ocular sob campo brilhante, muito lentamente trazer o dispositivo de tensão para baixo e mover o objetivo para cima para se concentrar nas células. Realize este passo de foco lentamente, alternando entre a redução da etapa de tradução Z e a elevação do objetivo.
Se o estágio de tradução Z diminuir muito, as células podem comprimir e, portanto, morrer. Se elevarmos o objetivo muito alto, ele pode quebrar a tampa de vidro e fazer com que o meio vaze. Escaneie a placa de polidimtilsiloxano nas direções X e Y para encontrar uma célula que tenha um núcleo fluorescente, usando epiflorescência a 488 nanômetros de excitação.
Certifique-se também de que a célula tenha uma morfologia apropriada ao olhar para a amostra sob campo brilhante. Grave imagens de campo largo ou de pinhole aberto do núcleo com 488 nanômetros de excitação do comprimento de onda e da célula com excitação de campo brilhante em intervalos de 30 segundos por quadro por uma duração total de pelo menos 30 minutos. A geometria redesenhada do substrato de polidimtilsiloxano e a configuração de imagem mostrada neste vídeo minimiza a distância entre as células e o objetivo.
Isso permite imagens de lapso de tempo de núcleos celulares fluorescentes rotulados usando um objetivo de imersão de óleo de 100x. Para medir as flutuações nucleares, primeiro traçar a área nuclear versus o tempo. Em seguida, detença os dados usando um polinômial de terceira ordem.
E, finalmente, parcelar flutuações residuais e calcular o desvio padrão das flutuações residuais. As flutuações nucleares das células progenitoras oligodendrocyte, após a indução química de diferenciação com e sem uma cepa de 10%, mostram que, apenas com a indução química, a amplitude das flutuações nucleares apresentou uma diminuição significativa em 48 horas, mas não em 24 horas. Por outro lado, a indução química juntamente com uma cepa de 10% de tração mostrou uma diminuição significativa em 24 horas, que permaneceu constante sem maiores reduções em 48 horas.
O mais importante a ser lembrado é que a distância de trabalho do objetivo escolhido deve ser igual ou maior do que a profundidade do compartimento celular mais a espessura do deslizamento de tampas. O substrato pode ser redesenhado para incorporar uma grade, o que facilitaria a imagem da mesma célula antes e depois da aplicação da cepa, uma vez que um tipo de conjunto de dados antes e depois reduz o ruído proveniente de erro experimental. Usando essa configuração de imagem, muitos fenômenos subcelulares dentro de células vivas aderentes, como localização de proteínas ou dinâmica de componentes celulares, podem ser imagens em segundos após a aplicação da cepa mecânica.
