Este protocolo descreve a preparação de lamelas vítreas de hemácias infectadas por Plasmodium-falciparum para tomografia crioeletrônica. Isso permite a observação direta de informações estruturais detalhadas sobre como o parasita causa malária. A tomografia crio-eletrônica registra informações de alta resolução sobre o interior das células.
É poderoso o suficiente para observar complexos de proteínas individuais in situ, que podem ser extraídos computacionalmente e medidos para revelar informações estruturais tridimensionais sobre proteínas. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para diferentes tipos celulares e pode ser um ponto de partida para alguém novo na produção de lamelas vítreas para tomografia crio-eletrônica. Trata-se de Alejandra Carbajal, que cumprirá o protocolo hoje.
Para começar, faça a triagem das grades de cobre congeladas usando um CryoStage para um microscópio de luz com atenção especial ao gradiente de gelo ao longo da grade. Verifique os quadrados de grade individuais para cobertura celular nas áreas mais finas do gelo. Use um marcador preto indelével para marcar a frente e o lado oposto das jantes Autogrid específicas para Cryo-FIB-SEM.
Carregue a grade cortada no vaivém Cryo-FIB-SEM com o lado carbono para cima e aplique um revestimento rotativo de feixe eletrônico de carbono ou platina de quatro nanômetros de espessura na superfície das células. Coloque o vaivém no Cryo-FIB-SEM e avalie a distribuição de células em cada rede por MEV a cinco quilovolts. Faça uma visão geral de baixa ampliação com 100 potências para observar os gradientes de gelo em toda a rede.
Em seguida, tire imagens de ampliação mais alta com 5.000 de potência para ver os quadrados de grade individuais. Aplique uma camada de organoplatina de dois micrômetros na superfície de cada grade, inserindo a agulha do sistema de injeção de gás na câmara acima da grade e aquecendo a fonte de organoplatina a uma temperatura definida por um tempo determinado para produzir um fluxo de vapor. Para observar a amostra, incline-a de modo que o plano da grade fique a aproximadamente 10 graus do ângulo de incidência do feixe de íons e mova o centro de um quadrado de grade adequado para ser visto nas imagens de MEV e FIB.
usando o feixe de íons em baixa corrente, Pesquise a grade em uma ampliação alta para visualizar as células no centro de um quadrado de grade. Marque dois padrões retangulares para moer, um acima e outro abaixo de uma região protegida de três micrômetros de espessura. Em seguida, escolha as configurações do feixe e corrija o astigmatismo ajustando o brilho e o contraste.
após a conclusão da instalação, inicie a fresagem a uma corrente de 300 picoamperes enquanto monitora o progresso ao vivo na visão do feixe de íons e intermitentemente por MEV. A amostra é verificada na visualização MEV, e após a primeira fresagem, se o feixe de íons não tiver rompido a amostra acima e abaixo da região protegida, remova mais material aumentando a altura dos padrões retangulares. Pare de fresar quando a superfície acima e abaixo da lamela estiver completamente lisa na visão do feixe de íons.
Repita o processo de moagem gradualmente, reduzindo a corrente do feixe de íons a cada vez até atingir uma espessura de 300 nanômetros. Registre a posição X Y Z de cada lamela. Para polir as lamelas no final do experimento, use uma visão geral de MEV de baixa ampliação para selecionar um grupo de lamelas a serem polidas e marcar a raiz de polimento.
Uma vez marcada a raiz de polimento, reduza o espaço entre os dois padrões retangulares para 100 a 200 nanômetros e inicie o polimento em uma corrente de feixe de íons de 30 picoamperes. Monitore o progresso por MEV em dois a três quilovolts. Pare de polir quando o contraste na lamela é perdido por MEV ou quando a camada organoplatina ou a própria lamela começa a perder a integridade.
Adquira e salve imagens SEM de baixa ampliação de cada lamela. Após a conclusão do experimento, remova o vaivém do microscópio. Retire as grades com lamelas e guarde-as sob nitrogênio líquido.
Manuseie as grades com cuidado. Para estudar a morfologia, os esquizontos foram estagnados em diferentes estágios de saída usando o composto dois em inibidores E-64. Na presença do composto dois, o limite entre as membranas parasitóforas e a hemoglobina circundante na hemácia do hospedeiro foi bem definido.
O vacúolo parasitóforo intacto, ou PVs, foi embalado com merozoítos em um único aglomerado de cristais de hemozoína. Quando dois esquizontes sincronizados foram lavados em E-64, a membrana PV foi rompida e os merozoítos espalhados dentro da hemácia. Um exemplo típico de boa distribuição celular em uma grade de cobre mostra grandes hemácias com uma periferia bem definida e uma membrana de vacúolo intacta.
Dentro de uma hemácia hospedeira parcialmente colapsada, os merozoítos individuais foram visualizados como pequenos aglomerados de células. Cada esquizonto tinha uma mancha preta em seu centro, indicando a posição dos cristais de hemozoína. Após a fresagem, as grades foram carregadas no ETM para identificar as posições das lamelas e encontrar áreas adequadas para serem alvo pela tomografia.
Na micrografia da amostra, um eritrócito que havia sido invadido recentemente por um merozoíto pode ser visto. O merozoíto envolto pela membrana derivada da célula hospedeira pôde ser visto dentro do limite da hemácia. Na extremidade apical do merozoíto, as duas membranas que circundam a célula e quatro membranas empilhadas no ápice do merozoíto associadas a uma característica em forma de cogumelo elétron-denso eram claramente visíveis.
Dentro do citoplasma do merozoíto, um evento de fusão entre a membrana plasmática do merozoíto e uma vesícula multicamadas foi identificado. Em uma análise adicional de MET de uma lamela de 230 nanômetros de espessura, a morfologia típica de um merozoíto maduro tratado com E-64 foi observada. Dentro da membrana dos glóbulos vermelhos, a membrana plasmática do merozoíto pode ser vista com organelas como o complexo de membrana interna, anéis polares, micronêmicos, rópticas e o envelope nuclear.
A parte mais importante desta técnica é a otimização das grades para permitir a produção reprodutível e eficiente de lamelas finas. O desenvolvimento desta técnica permitirá aos pesquisadores visualizar moléculas de proteína única dentro de parasitas da malária e determinar seu papel na saída da malária.
