Os autores gostariam de agradecer Qiuli Wang, Language Resource Center, Colby College, de assistência técnica, com processamento de vídeo e Eric Thomas, do departamento de música, Colby College, para fornecer a música de fundo. Este projecto foi apoiado por doações do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, INBRE (P20RR016463-12), do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (P20 GM103423-12), os cidadãos Institutes of Health and Science Division Grant, Colby College (STA). JL e LWM foram apoiados por bolsas do Fundo Escolar Verão, Colby College.

1 induzida por Startle Drosophila Ensaio locomoção <ol><li> Tratamento de Drogas <ol><li> Sedate para imobilizar o número desejado (aproximadamente 8-12) de 1-3 dias de idade do sexo masculino voa usando CO 2 e transportá-los para os frascos que contêm o alimento suplementado com a droga. Nota: Um outro anestésico por exemplo, éter ou gelo podem ser usados ​​para sedar moscas para permitir a contagem e manuseamento. </li><li> Permitir moscas para se recuperar de sedação por 20 minutos (ou até que a recuperação), com o frasco em posição horizontal (para evitar moscas ficar preso em alimentos) e em seguida, coloque o frasco na posição vertical em um escuro de 12 h, 12 h luz incubadora a 25 ° C para o resto da experiência. </li></ol></li><li> Experimental Set Up <ol><li> Divida esta configuração frasco duplo em três partes iguais de 6,33 centímetros, marcando círculos em torno dos frascos com um marcador permanente. </li><li> Depois de 3 dias de exposição ao fármaco, a transferência voa sem anestesia no frasco de fundo e rapidamente colocar o topo do frascoatravés da abertura. Tape os dois frascos em conjunto com fita adesiva transparente. </li><li> Permitir moscas para se aclimatar ao novo ambiente por 15 min. </li><li> Coloque os frascos em um fundo branco e configurar uma câmera digital a uma distância adequada do aparelho frasco duplo com um temporizador em vista. Certifique-se de todo o aparelho é visível em um único quadro de imagem e que todas as moscas estão em foco. Para manter quadros consistentes entre ensaios, marcar a localização da câmera e no frasco. </li></ol></li><li> Mobility Assay <ol><li> Claramente exibir o número de teste, o tratamento medicamentoso, e temporizador de visão da câmera. </li><li> Bata firmemente o aparelho de frasco duplo contra a bancada 3 vezes e assegurar que todas as moscas cair para o fundo do frasco. Simultaneamente iniciar o temporizador. </li><li> A cada 5 segundos para 1 min, tirar uma foto do aparelho. Nota: Como alternativa, um vídeo pode ser capturado e fez uma pausa em intervalos apropriados para medições. </li><li> Permitir que as moscas se recuperar em repouso durante 1 minuto. </li><li&gt; Repita mais duas vezes com 1 min tempo de recuperação entre cada tentativa. Nota: Cada aparelho deve levar de 5 min para completar a coleta de dados. Manter a força similar de tocar entre ensaios. (Pelo menos três) aparelhos múltipla pode ser facilmente manuseados simultaneamente. </li></ol></li><li> Análise de Dados <ol><li> Veja as fotos e registrar o número de moscas em cada seção ao longo do tempo. Calcula-se a percentagem de moscas em cada secção ao longo do tempo. Notas: Repita esse procedimento inteiro com as mesmas moscas em 2 ou 3 pontos de tempo de interesse, por exemplo, dia 3, 5 e 7 Se muitas moscas morrem durante todo o experimento, é possível ampliar o número de julgamento original para compensar para a mortalidade. Use a análise estatística adequada para comparar os dados. </li></ol></li></ol> 2. Drosophila espontânea Locomotion Assay <ol><li> Preparação de Alimentos <ol><li> Reconstituir 3 g de meio de Drosophila instante com 15 ml de água desionizada e rotenona pretendido(Ou outro fármaco de interesse) de dosagem. </li><li> Uma vez que a mistura de alimentos tornou-se firme (cerca de 5 minutos), coloque cuidadosamente o alimento a ser de aproximadamente 1 cm de altura em fabricante fornecido tubos transparentes (5 mm X 65 mm). Adicionar o fármaco infundido alimentos para os tubos, colocando cuidadosamente os tubos verticalmente no alimento e torcendo-os até que eles possam ser removidos com o alimento para dentro do tubo. Nota: É útil para colocar um dedo na abertura do tubo, para criar um vácuo. Os alimentos não devem conter quaisquer bolhas de ar ou ter uma superfície irregular, como as moscas podem ficar presos. </li></ol></li><li> Configuração Experimental <ol><li> Colocar uma tampa de plástico na extremidade do tubo mais próximo ao alimento. Empurre a tampa de plástico do tubo tão pouco quanto possível, uma vez que pode criar uma bolha de ar no frasco, se levado a força. </li><li> Sedate masculino 1 dia de idade, voa usando CO 2 e cuidadosamente inserir um homem voar em cada tubo com um pincel. Repetir dependendo do número de ensaios desejados. </li><li> Ligue oextremidade do tubo mais distante do alimento com uma bola de algodão pequeno, que pode ser de mão rolou maior loja comprou bolas de algodão. </li><li> Permitir moscas para recuperar com os tubos em posição horizontal durante 15 min e assegurar que todas as moscas estão vivos e activos. Inserir os tubos em DAM e certifique-se que todos os tubos estão na mesma posição em relação a barragem. Nota: É possível colocá-los com a área de monitorização no meio do recipiente, ou para apertar todos os frascos para o lado, de modo que a extremidade do tubo está a ser monitorizado. Nota: Veja a discussão de variações sobre este método. </li></ol></li><li> Coleta de Dados <ol><li> Coloque o DAM em um escuro de 12 h, 12 h luz incubadora regulada a 25 ° C. Conecte o DAM para o sistema de coleta de dados. Abra o software DAM e sob preferências selecione comprimento bin para 10 min. Comece a coleta de dados e permitir que o programa para coletar dados durante 7 dias. Nota: comprimento Bin pode ser ajustado, se necessário. </li><li> Análise de Dados Nota: Processoos dados para se obter contagens por min como uma medida para a locomoção espontânea de longo prazo. <ol><li> Arquivo DAM abrir o programa e monitorar o acesso de digitalização de dados, clicando em dados de entrada selecionados. </li><li> Selecione a faixa de monitor apropriado e selecione comprimento bin para intervalos de 10 minutos. </li><li> Em tipo de arquivo de saída escolher arquivos do canal. Deixe todas as outras opções como padrão. </li><li> Clique dados de digitalização e salvar em uma pasta designada. </li><li> Importar dados em um software de análise de dados circadiano obter contagens por min. Nota: Para a análise dos dados software Clocklab é comumente usado. Outras opções também estão disponíveis. </li></ol></li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+ethanol+exposure+alters+adult+circadian+free-running+locomotor+activity+rhythm+in+Drosophila+melanogaster.">Larval ethanol exposure alters adult circadian free-running locomotor activity rhythm in Drosophila melanogaster.</a> Chronobiology international. 29, 75-81 (2012).</li><li>Chaudhuri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+genetic+and+environmental+factors+in+a+Drosophila+parkinsonism+model.">Interaction of genetic and environmental factors in a Drosophila parkinsonism model.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 2457-2467 (2007).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+video+tracking+of+locomotion+in+adult+Drosophila+melanogaster.">High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste estudo, são descritos dois procedimentos para medir tanto a locomoção espontânea a longo prazo e a locomoção induzida pelo sobressalto a curto prazo num modelo de doença de Parkinson induzida por Drosophila rotenona. Pode-se também medir essas características de locomoção em moscas expostas a outros agentes farmacológicos conhecidos para modelar a doença de Parkinson, por exemplo, paraquat 14, modelos genéticos da doença de Parkinson, por exemplo, alfa-sinucleína mutantes 15, e outros modelos da mosca de doenças que afetam a locomoção. Para ambos os métodos, os métodos alternativos e modificações podem ser consideradas. As moscas podem ser anestesiados com gelo, o que poderia aliviar limitações de CO 2 anesthetization por exemplo atraso na coleta de dados para permitir que o CO 2 efeito desgastar. No ensaio de locomoção induzida por sobressalto, uma vez que as moscas de variação circadiana da mobilidade, que é importante para a recolha de dados, ao mesmo tempo dodia entre os experimentos. Também é importante introduzir moscas para o aparelho de teste, sem anestesia. Contrariamente à maioria dos ensaios de locomoção resposta de sobressalto, que contam com um instantâneo de passagem de um limiar em um período de tempo predeterminado 10,11,15,16, a nossa abordagem, semelhante à rápida geotaxis negativos iterativos (anel) ensaio 17,18, monitora o movimento em várias instâncias sucessivas ao longo de um período de tempo. Esta abordagem de monitoramento contínuo da distribuição de moscas em diferentes zonas podem resolver as diferenças sutis entre os grupos de tratamento. Além disso, a abordagem de calcular a percentagem de moscas em várias zonas da arena podem ajudar a minimizar a contribuição de valores extremos nos dados. Decidimos também sistematicamente altura em que ponto a ter dados para comparar os grupos de tratamento. Depois de levar os dados a cada 5 segundos para 1 min, nós traçamos os dados e descobriu que as diferenças mais notáveis ​​entre os tratamentos poderia be visto em 30 seg. Depois deste ponto de tempo, moscas expostas a rotenona são capazes de compensar os defeitos de locomoção. Por isso, recomendamos que os usuários otimizem o tempo de aquisição de dados para melhor resolver as diferenças entre seu controle e conjuntos experimentais. Esta abordagem também tem a vantagem de determinar deficiências motoras relativas entre os agentes farmacológicos e / ou em modelos genéticos. Por exemplo, um produto químico mais tóxico do que rotenone podem apresentar diferenças mais notáveis ​​mais cedo do que 30 pontos tempo sec. Para o ensaio de locomoção espontânea de longo prazo, uma vez que as moscas são anestesiados para introduzi-las no interior dos tubos, não se consideram os dados do primeiro 24-48 horas para permitir a anestesia para fora e usar-a aclimatação das moscas nos monitores de tubos. Outra consideração para este ensaio é a posição relativa do tubo e do sensor de movimento em DAM, pensamos que os dados podem ter um impacto na locomoção espontânea. Colocamos os tubos contendo moscas no monitorde modo que o sensor de monitorização foi de um terço do período de mais distante a partir do tubo de alimentação e não do meio do tubo, como é normalmente feito em utilização tradicional de DAM em estudos circadianos. Isto permitiu-nos a examinar a capacidade das moscas para atravessar, pelo menos, dois terços do comprimento do tubo e levado com dados mais consistentes. É provável que as contagens de atividade podem ser afetados em moscas alimentados com rotenona devido a rajadas de movimento e / ou espasmos fenótipo. Outros fatores de confusão possíveis para a contagem de atividade poderia ser uma gustativa e / ou olfactiva uma aversão / atração para rotenone e outras substâncias químicas de interesse para o usuário. Portanto monitoramento de vídeo adicional 17,19 pode ser utilizado para complementar os dados DAM para uma análise mais aprofundada do fenótipo locomoção. Em um cenário onde as moscas experimentais têm contagens de atividades semelhantes, em comparação com moscas de controle, é possível que eles diferem na distribuição circadiana de movimento desde fmentiras são mais ativos em torno de luz on / off e on / off de transição em uma luz-12 ciclo escuro h 12 h. Portanto, seria útil para determinar as contagens por minuto em pontos de tempo múltiplos e comprimentos de lixo durante um período de 24 horas para determinar a distribuição exacta de locomoção. Em conclusão, este ensaio, devido à sua capacidade de avaliar as características de movimento não limitados a movimentos em resposta a assustar, vai fornecer novos insights sobre defeitos de locomoção e caracterização de estratégias terapêuticas.

Deficiências de locomoção são um dos principais sintomas de doença de Parkinson e são em grande parte causadas por deterioração dos neurónios dopaminérgicos da substância negra 1. Rotenone é um inseticida cetônico que tem sido estudado extensivamente para modelar déficits motores de Parkinson em Drosophila 2-6. Rotenone provoca danos oxidativos, bloqueando a via de fosforilação oxidativa, o que acaba por causar a morte de células 7. Neurónios dopaminérgicos são mais propensas a toxicidade de rotenona, fazendo com que os efeitos do produto químico principalmente motor baseado 2,7. Ao induzir sintomas da doença de Parkinson em moscas, podemos entender melhor a doença e seus sintomas remediar 6,8-11. Drosophila fornece um bom modelo para estudar o efeito, porque eles são geneticamente dócil, de fácil manutenção, e têm um ciclo de vida rápido. Vários estudos têm mostrado que provoca rotenona induzida por sobressalto de curto prazodefeitos de locomoção em moscas Drosophila -quando são mantidos em alimentos suplementados com rotenona, eles mostram uma resposta mais lenta geotactic negativo após susto 2-6. Sua incapacidade de subir para cima em um aparelho de frasco tão rapidamente quanto os ensaios de controle é indicativo de defeitos de locomoção induzida pelo sobressalto. O efeito de rotenona no longo prazo, o movimento espontâneo não está bem descrita. Monitores de actividade de Drosophila (DAMS) têm sido utilizados com sucesso para controlar o movimento em Drosophila ritmo circadiano estuda 12,13. As moscas são colocadas em tubos individuais, as quais são carregadas para o DAM. Este aparelho é equipado com um sensor de infravermelhos, o qual conta o número de vezes que uma mosca divide o feixe de infravermelhos. Estas contas podem ser utilizados como uma medida de actividade de locomoção e 12,13 imperturbável. Ao colocar as moscas em um DAM, o efeito de rotenona na sua locomoção de longo prazo pode ser caracterizado. Este estudo descreve métodos para mediçãoure a curto prazo de sobressalto-locomoção induzida e locomoção espontânea de longo prazo, de modo a compreender melhor os efeitos da rotenona mediada deficiências motoras. Caracterização de deficiências de locomoção que imitam a doença de Parkinson são importantes porque permitem o estudo de outros compostos que podem reverter esses defeitos de locomoção.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Standard narrow vials</td>
			<td style="width:127px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32-120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Rotenone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>Store in freezer, make fresh for each experiment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td>Solvent for rotenone</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Instant Drosophila medium</td>
			<td style="width:127px;">Carolina Biological&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Formula 4-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Drosophila activity monitor (DAM)</td>
			<td style="width:127px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">DAM2</td>
			<td>trikinetics.com</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DAM tubes</td>
			<td style="width:127px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">Tubes 5X65 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Recipe for Rotenone +food (125 mM dose)</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to characterize spontaneous and startle-induced locomotion in a rotenone-induced parkinson's disease model of drosophila

A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, principalmente na substantia nigra. A doença provoca deficiências motoras, que apresentam como rigidez, tremores e demência em humanos. Rotenone é um inseticida que causa dano oxidativo, inibindo a função da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria. É também usado para modelar a doença de Parkinson na Drosophila. As moscas têm uma resposta geotactic negativa inerente, o que os obriga a subir para cima ao ser assustado. Foi estabelecido que a rotenona causa defeitos de mortalidade e de locomoção primeiros que perturbam a capacidade das moscas para subir depois de terem sido aproveitado para baixo. No entanto, o efeito de rotenona em movimento espontâneo não está bem documentada. Este estudo descreve dois ensaios sensíveis, reprodutíveis e de alto rendimento para caracterizar deficiências induzida por rotenona ema curto prazo de sobressalto-locomoção induzida e locomoção espontânea de longo prazo em Drosophila. Estes ensaios podem ser convenientemente adaptados para caracterizar outros modelos de Drosophila de defeitos de locomoção e a eficácia de agentes terapêuticos.

Induzida por Startle Drosophila Ensaio locomoção De tipo selvagem, Canton-S, as moscas apresentaram uma resposta negativa geotactic robusta com apenas cerca de 88% e 5% das moscas nas partes superior e inferior, respectivamente, do aparelho duplo frasco após 30 segundos (Figura 1). Moscas expostos a 125 mM e 250 mM rotenone por 3 dias apresentaram um ligeiro decréscimo no número de moscas na parte superior e ligeiro aumento no número de moscas na área do fundo. Moscas expostas a 500 uM rotenona mostrou defeito significativa na resposta geotactic negativo (p &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação inteligente) como evidenciado pelo menor número de moscas na secção superior e mais moscas na secção inferior, em comparação com o controle moscas (Figura 1). Este defeito na resposta geotactic negativo devido à incapacidade de subir rapidamente no aparelho é indicativo de um defeito de sobressalto emduzido locomoção. Drosophila espontânea Locomotion Assay Tipo selvagem, Canton-S, moscas mostrou 0,57 contagens por minuto, como uma medida de mobilidade espontânea no quarto dia na DAM (Figura 2). Moscas expostos a 125 mM rotenona mostrou um nível semelhante de locomoção espontânea. Em contraste, as moscas expostas a 250 uM e 500 uM rotenona medidas mostraram cerca de 50% mais baixos (p &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni par de comparação inteligente) da locomoção espontânea (Figura 2). Estas moscas movido em cerca de 0,20 contagens por minuto, o que é indicativo de um defeito induzida por rotenona na locomoção espontânea. Para explicar as discrepâncias iniciais (se houver) na locomoção, não causada por exposição a rotenona, subtraiu-se dados de locomoção entre o dia 4 eo dia 3. moscas controle apresentaram um aumento de cerca de 0,1 contagens por minuto em spontaneonos locomoção entre dias, enquanto que as moscas expostas a 125 uM rotenona exibiu um ligeiro decréscimo de cerca de 0,15 a contagem por minuto (Figura 3). Moscas expostas a 250 uM e 500 uM rotenona apresentado diminuições mais severas na locomoção entre os dias, sendo as diferenças de aproximadamente 0,3 e 0,5 (p &lt;0,05 ANOVA, par de Bonferroni comparação sábio) contagens por minuto, respectivamente. Estes dados sugerem uma deficiência na locomoção espontânea ao longo do tempo, com exposição a rotenona e confirma a análise único dia mencionado acima - moscas expostos a dosagens mais elevadas de rotenona mostrou uma diminuição na locomoção espontânea. Tomados em conjunto, estes métodos medir de forma confiável deficiências induzida por rotenona em espontânea e assustá-induzida locomoção. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51625/51625fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 induzida por Startle locomoção lote demoscas expostos a doses crescentes. rotenona tipo selvagem, cantão-S, as moscas macho foram expostos a diferentes doses de rotenona, durante 3 dias e as moscas sobreviventes (8-12) foram, em seguida, aproveitado para a parte inferior do aparelho de frasco duplo. Moscas expostas a 500 uM rotenona mostram um decréscimo significativo na percentagem de moscas na parte superior (A) e aumentar a percentagem de moscas da secção de fundo (B) do aparelho, depois de 30 seg. Isto é indicativo de uma deficiência na resposta de sobressalto em moscas expostas a rotenona. As colunas representam a percentagem média de seis experimentos independentes. As barras de erro representam o erro padrão da média; * P &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação sábio. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51625/51625fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. locomoção espontânea trama de moscas expostas a dose crescentes de rotenona. tipo selvagem, Canton-S, moscas macho foram expostos a diferentes doses de rotenona e contagens por minuto no quarto dia após a exposição foram plotados. As contagens foram medidas num DAM. Moscas expostas a 250 uM e 500 uM rotenona mostram uma redução nas contagens por minuto. Isto é indicativo de uma deficiência na locomoção espontânea em moscas expostas a rotenona. As colunas representam média das contagens por minuto no quarto dia de 5 ensaios independentes. As barras de erro representam o erro padrão da média; * P &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação sábio. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51625/51625fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Variação na locomoção espontânea trama de moscas expostas a doses crescentes de rotenona. Tipo selvagem, Canton-S, as moscas macho foram expostos a diferentes doses de rotenona e a diferença de contagens por min on o terceiro e quarto dia após a exposição foram plotados. As contagens foram medidas num DAM. Existe uma tendência para a diminuição dependente da dose na locomoção espontânea com moscas expostos a doses mais elevadas com uma mudança mais negativo na locomoção. Isto é um indicativo de uma redução em movimento. As colunas representam a variação média de locomoção por minuto de 5 ensaios independentes. As barras de erro representam o erro padrão da média; * P &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni par comparação sábio.

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Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson&#039;s Disease Model of Drosophila

A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, causando defeitos de locomoção. Modelos rotenona doença de Parkinson em Drosophila. Este documento descreve dois ensaios que caracterizam as deficiências de locomoção tanto espontâneas e induzidas por assustar causadas por rotenona.

Métodos para caracterizar espontânea e surpreender-induzida Locomotion em um modelo de doença de Parkinson induzida por Rotenone de<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

methods-to-characterize-spontaneous-startle-induced-locomotion

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

10.0K visualizações.  Colby College.  A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, causando defeitos de locomoção. Modelos rotenona doença de Parkinson em Drosophila. Este documento descreve dois ensaios que caracterizam as deficiências de locomoção tanto espontâneas e induzidas por assustar causadas por rotenona. 

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Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model. While ICH
accounts for 10-15% of all strokes, there remains no specific
effective therapy. The autologous blood injection model in mice
involves the stereotaxic injection of arterial blood into the basal
ganglia mimicking a spontaneous hypertensive hemorrhage in man. The
response to hemorrhage can then be studied in vivo and the
neurobehavioral deficits quantified, allowing for description of the
ensuing pathology and the testing of potential therapeutic agents. The
procedure described in this protocol uses the double injection
technique to minimize risk of blood reflux up the needle track, no
anticoagulants in the pumping system, and eliminates all dead space
and expandable tubing in the system.

The autologous blood injection model of intracerebral hemorrhage in mice described in this protocol uses the double injection technique to minimize risk of blood reflux up the needle track, no anticoagulants in the pumping system, and eliminates all dead space and expandable tubing in the system.

Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Neurociência

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta. Gait abnormalities, including decreased arm swing, slower walking speed, and shorter steps are common in PD patients and appear early in the course of disease. Thus, the quantification of motor patterns in animal models of PD will be important for phenotypic characterization during disease course and upon therapeutic treatment. Most cases of PD are idiopathic; however, the identification of hereditary forms of PD uncovered gene mutations and variants, such as loss-of-function mutations in Pink1 and Parkin, two proteins involved in mitochondrial quality control that could be harnessed to create animal models. While mice are resistant to neurodegeneration upon loss of Pink1 and Parkin (single and combined deletion), in rats, Pink1 but not Parkin deficiency leads to nigral DA neuron loss and motor impairment. Here, we report the utility of FTIR imaging to uncover gait changes in freely walking young (2 months of age) male rats with combined loss of Pink1 and Parkin prior to the development of gross visually apparent motor abnormality as these rats age (observed at 4-6 months), characterized by hindlimb dragging as previously reported in Pink1 knockout (KO) rats.

Here we describe the RatWalker system, built by redesigning the MouseWalker apparatus to accommodate for the increased size and weight of rats. This system uses frustrated total internal reflection (FTIR), high-speed video capture, and open-access analysis software to track and quantify gait parameters.

Aplicando o Sistema RatWalker para Análise de Marcha em um Modelo de Rato Genético da Doença de Parkinson

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNc) and dopaminergic striatal deficit. Animal models have been widely used to simulate human pathology in the laboratory. Rodents are the most used animal models for PD due to their ease of handling and maintenance. Moreover, the anatomy and molecular, cellular, and pharmacological mechanisms of PD are similar in rodents and humans. The infusion of the neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OHDA), into a medial forebrain bundle (MFB) of rats reproduces the severe destruction of dopaminergic neurons and simulates PD symptoms. This protocol demonstrates how to perform the unilateral microinjection of 6-OHDA in the MFB in a rat model of PD and shows the motor deficits induced by 6-OHDA and predicted dopaminergic lesions through the stepping test. The 6-OHDA causes significant impairment in the number of steps performed with the contralateral forelimb.

The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model has been used for decades to advance the understanding of Parkinson's Disease. In this protocol, we demonstrate how to perform unilateral nigrostriatal lesions in the rat by injecting 6-OHDA in the medial forebrain bundle, assess motor deficits, and predict lesions using the stepping test.

O Modelo de Rato de 6-hidroxidopamina da Doença de Parkinson

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...