O tutorial apresentado foi realizado e desenvolvido no Núcleo Facility Espectrometria de Massas do National Jewish Health. A facilidade NJH MS é apoiado em parte por CCSTI UL1 TR000154. O financiamento de bolsas NIH P20 HL-113445 e R01 HL-095432 também apoiaram este trabalho.

1. Considerações Iniciais, Preparação dos instrumentos e normas <ol><li> Sempre use vidro para armazenar (tubos de cultura de vidro, frascos do amostrador automático de vidro) ou transferir (pipetas de vidro) lipídios e solventes orgânicos. </li><li> Minimize a exposição de todas as amostras de lipídios e as normas para o ar. Politetrafluoretileno Seal (PFTE) tampas hermeticamente para evitar a exposição ao ar e evaporação. Ressuspender Imediatamente lipídios secas na próxima solvente ou mantê-los em um fluxo constante de nitrogênio. </li><li> Utilizar 100 ul de amostra. Nos casos em que mais (ou menos) de uma amostra está disponível, ajustar os volumes em conformidade. No entanto, durante o fraccionamento de lípidos na coluna NH2 SPE, afirmou volumes devem permanecer como indicado. </li><li> Ligue centrífuga e ajustada para 0 ° C antes do início da preparação da amostra. </li><li> Esta técnica utiliza muitos solventes voláteis de modo a manter todos os solventes tampadas durante a preparação da amostra. </li><li> Prepare dois tipos de normas por recomendação. </li><li> Prepare um controle negativo composto de tudo cravado em padrões de concentração constante. Este é cravado em todas as amostras, assim como uma amostra combinada, que é usado como um lote QC (amostra colectiva cravado utilizado para monitorar amostra preparação reprodutibilidade em dias separados) e instrumento QC (cravado amostras reunidas anteriormente preparado, sub-fraccionados, e usado para monitorar instrumento condições / flutuações durante a análise e em dias separados). <ol><li> Preparar controles positivos em 1x, 2x, 4x e picos padrão. Os controlos positivos são adicionados a todas as amostras, assim como uma amostra de plasma reunidas e são utilizados como compostos de controlo de qualidade para ambos os passos da preparação da amostra e análise instrumental passos para analisar e identificar as diferenças de mudança de dobragem durante a análise dos dados para garantir que todos os aspectos da preparação e análise instrumental foi realizada corretamente. </li></ol></li><li> Normas armazenar a -20 ° C e armazenar amostras a -80 ° C. Certos estande internoSDRA que são propensas a degradação após o armazenamento a longo prazo devem ser armazenadas a -80 ° C. </li><li> Este procedimento requer a utilização de solventes perigosos, inflamáveis ​​ou voláteis, tais como MTBE. Executar todas as etapas de uma coifa. </li></ol> 2. Padrões internos <ol><li> Escolha padrões internos (ISTD) com base em projetos individuais e seu projeto experimental específico. Para fluidos biológicos tais como o plasma, LBA, ou urina, istDS isotopicamente marcados, que são de natureza semelhante aos encontrados biologicamente nestas amostras seria ideal. Estes incluem, mas não estão limitados a aminoácidos, hormonas ou lípidos. Para amostras de plantas metabolomic, padrões marcados, tais como os flavonóides, ou carotenoides pode ser utilizado. O mesmo se aplica a outros estudos metabolomic qual o investigador deve escolher um padrão interno, que é representativo do tipo de amostra a ser analisada. </li><li> Certifique-se de que o ISTD escolhida abrange uma vasta gama de cromatograma; por exemplo, se tque o tempo de aquisição é de 20 minutos, os padrões que eluem a cada 5 minutos pode ser utilizado. </li><li> Criar soluções stock hidrofílicos a 2 mg / ml, utilizando uma variedade de padrões marcados com isótopos e / ou outros compostos polares que são exógenos para a amostra a ser analisada. De cada solução de estoque, criar uma solução de 1:1 de metanol: água a todas as normas para uma concentração final de 25 ug / ml de creatinina D-3, 100 ug / ml de lisina-D 4, e 200 ug / ml de valina D-8 . </li><li> Criar soluções stock hidrofóbicas, utilizando uma variedade de padrões marcados com isótopos e / ou outros compostos não polares que são exógenos para a amostra a ser analisada; concentrações de amostra de 17:00 de ácido gordo (de 4 mg / ml), 19:01 de ácido gordo (de 4 mg / ml), 17:00 ceramida (2 mg / ml), 17:00 PE (1,75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml), e testosterona-D 2 (1 mg / ml). A partir de cada banco de criar uma solução em 1:1 clorofórmio: metanol, com todos os padrões a uma concentração final de 50ug / ml 17:00 ceramida, 100 ug / ml de 15:00 PC, com 100 ug / ml de testosterona-D 2, 200 ug / ml de 17:00 de ácido gordo, de 200 ug / ml de 19:01 de ácido gordo, e 200 ug / ml 17:00 PE na mistura padrão. </li><li> Teste o grau de ionização de cada padrão antes do tempo usando pelo menos cinco concentrações diferentes para cada padrão para determinar o limite de detecção e linearidade do instrumento para estes compostos. A concentração da solução de reserva para cada padrão indivíduo irá variar, dependendo do design experimental, e a concentração de cada padrão no padrão cravado combinado pode variar de 20 ng / ml a 2 mg / ml, dependendo de quão bem que ionizam. </li><li> Criar uma mistura pico de controlos positivos e adicioná-los para as amostras em 1x, 2x ou 4x níveis de concentração para monitorar quantitativamente a força da preparação da amostra e a precisão dos dados instrumentais. A concentração final de controlos positivos podeser: 2 mg / ml de D-glucose, 100 ug / ml de alanina-D 3, 200 ug / ml de ácido D-metilmalónico 3, 20 ug / ml de triglicérido D-5, e / ou outros padrões hidrofóbicos e hidrofílicos. Ajuste as concentrações padrão em função da sensibilidade da instrumentação de MS e HPLC utilizado para a análise. </li></ol> 3. Precipitação Proteína <ol><li> As amostras podem ser descongeladas para a temperatura ambiente e 10 mL de pico ISTD para cada amostra, como descrito abaixo. </li><li> Pico de 10 ml de ambas as soluções padrão hidrofílicos e hidrofóbicos (criados a partir do estoque em passos 2.3 e 2.4) para cada amostra. Ajuste as concentrações padrão como necessárias, com base na sensibilidade da instrumentação de MS e HPLC utilizado para a análise <ol><li> Pico 10 ul de qualquer de 1x, 2x, ou a solução de controlo positiva de 4x (criado a partir da lingua no passo 2.6) para cada amostra. Ajuste as concentrações padrão como necessárias, com base na sensibilidade da MS e HPLC instrumentação utilizada para a análise </li><li> Vortex de cada amostra durante 10 segundos antes do passo de precipitação de proteínas </li></ol></li><li> Adicionar 400 uL de metanol arrefecido em gelo (armazenadas a -20 ° C) a cada amostra. </li><li> Vortex por 10 segundos por tubo. </li><li> Centrifuga-se a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g. </li><li> Transferir todo o sobrenadante para um novo tubo de cultura de vidro, e, em seguida, seca-se sob N 2. </li><li> Se analisar a fração pellet de proteína, proceda aos passos 3,8-3,11. Se não analisar o pellet de proteína, pule para a Seção 4. Nota: Os sedimentos de proteínas podem conter compostos com alta hidrofobicidade que seriam úteis ao realizar estudos de drogas 18, comida análises envolvendo flavonóides hidrofóbicas 19 ou estudos metabolômica relacionados a doenças onde os compostos muito hidrofóbicos se acumulam, como Lipofuscinoses Ceróides Neuronais 20 e armazenamento de lipídios lisossômico doenças 21. </li><li> Adicionar 1 ml de MTBE para tele branco (ou quase branco) pílula de proteína, de vórtice durante 30 segundos por tubo, depois centrifugar a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g. Decantar a camada de MTBE para um novo tubo de cultura de vidro. Este é um passo crítico como erros aqui vai afetar drasticamente os resultados (ver Figura 5 em resultados representativos). <ol><li> Consistentemente aspirar a mesma quantidade de MTBE para todas as amostras desde que o tamanho da pastilha variará entre as amostras. Portanto, se a 900 uL pode ser decantado para a amostra com a menor quantidade de sobrenadante, depois decanta-se 900 ul para todas as amostras. </li></ol></li><li> Repetir o passo 3.9, e combinar a camada orgânica para o mesmo tubo de cultura de vidro preparado na etapa 3.7. </li><li> As amostras secas por um fluxo de N2 e ressuspender em 200 ul de clorofórmio: metanol 01:01. Vortex brevemente. </li><li> Transferir para um tubo de centrífuga. Centrífuga a 0 ° C por 15 min a 18.000 xg, em seguida, transferir o sobrenadante para amostrador automático frascos de vidro com tampa de rosca usandopipetas. </li></ol> 4. Extracção líquido-líquido <ol><li> Usando uma pipeta de vidro, adicionar 3 ml de MTBE para o metanol seco residual (a partir da secção 3, etapa 6), vortex 30 seg, adicionar 750 mL de água, seguida de vórtice 10 segundos por tubo. </li><li> Rotação ~ 200 x g durante 10 min numa centrífuga a RT. </li><li> Aspirar 2,5 ml da camada de MTBE (sem receber água) e transferir para um tubo de cultura de vidro limpo. Nota: Esta é uma etapa crítica como diferenças aqui vai afetar os resultados. 2,5 ml de MTBE deve ser cuidadosamente decantado a partir da camada de topo, porque permite que um volume fixo para ser decantado, sem pipetando a camada aquosa inferior. Se o volume da amostra no início da experiência era menos do que os 100 ul indicados para este método, dimensionar o volume de MTBE para reflectir esta proporcionalmente o volume da amostra de partida. </li><li> Adicionar 3 ml de MTBE para a parte restante da água da amostra, e vortex 10 segundos por tubo. </li><li> Rotação ~ 200g durante 10 minutos na centrífuga à TA. </li><li> Aspirar 3 ml de MTBE (sem obtenção de água) e combine com o tubo de MTBE. </li><li> Concentra-se a camada aquosa restante por secagem sob N2. </li><li> Re-suspender resíduo em 100 ml de água. </li><li> Adicionar 400 mL de gelo MeOH frias para o tubo de cultura de vidro, vortex brevemente, e, em seguida, transferir para tubo de microcentrífuga. </li><li> Deixar a -80 ° C durante 20-30 min. Rotação a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g. Nota: Recomenda-se colocar todo o suporte de amostras em um freezer -80 ° C, pois isso permitirá que qualquer proteína restante para precipitar no metanol. Se um freezer -80 ° C não estiver disponível, as outras opções são: armazenar a -20 ° C, colocando as amostras em gelo seco, ou mantê-los em um balde de gelo. É importante para armazenar de forma consistente as amostras em um ambiente frio e à mesma temperatura, para permitir a precipitação. </li><li> Aspirar 450 mL de sobrenadante e transferir paraum tubo de microcentrífuga limpo. Seca-se completamente num concentrador centrífugo de vácuo a não mais do que 45 ° C. (Leva cerca de 1-2 horas). </li><li> Ressuspender sobrenadante seco em 200 mL de 5% de acetonitrilo / água. Vortex brevemente. Congelar a -80 ° C. </li></ol> 5. Extração em fase sólida <ol><li> Seca-se a fracção de MTBE sob azoto a 35 ° C com um bom fluxo de azoto (demora cerca de 10-15 minutos). </li><li> Quando completamente secas, interromper o fluxo de azoto e rapidamente ressuspender em 1 ml de clorofórmio (CHCI3), utilizando uma pipeta de vidro. Vortex brevemente. Nota: Os solventes, tais como CHCI3 têm baixa viscosidade. Durante pipetagem, baixa tensão superficial faz com que a perda de solvente a partir da pipeta. Recomenda-se que a ponta da pipeta prewet ser pelo menos duas vezes para permitir que se estabeleça o equilíbrio do solvente a ser pipetada e o espaço na pipeta. A seringa à prova de gás pode também ser usado se estiverem disponíveis. </li><li> Configure um colector de vácuo SPE e NH 2 </sub&gt; colunas SPE para fracionamento. </li><li> Amostras quente para RT e sempre manter suspensa sob um fluxo constante de N 2. O aquecimento até à temperatura ambiente vai permitir a ressuspensão de lípidos e o azoto irá impedir a oxidação e polimerização de lípidos. </li><li> Lave e condição SPE 2x cartucho com 400 mL de hexano. Descarte de resíduos e substitua por um novo tubo de recolha de vidro. </li><li> Adicionar amostra à coluna SPE, recolher fluir através de tubos de vidro. </li><li> Com pipeta de vidro adicionar 1 ml de 02:01 CHCl3: IPA, recolher fluir através de mesmos tubos de vidro (esta é a fracção neutra). </li><li> Seca-se a fracção neutra sob N2 para minimizar a oxidação (demora cerca de 10-15 minutos). </li><li> Com pipeta de vidro adicionar 1 ml de ácido acético a 5% em éter etílico, recolher fluir através de novos tubos de vidro (esta é a fração de ácidos graxos). </li><li> Seca-se a fracção de ácido gordo sob N2 para minimizar a oxidação (demora cerca de 10-15 minutos). </li><li> Utilize pontas de plástico para adicionar 800 e# 181; l de metanol para cartucho SPE, e recolher flow-through em 15 ml tubos cônicos de plástico (esta é a Fração Phospholipid). </li><li> Transferir fração de fosfolipídios para 1,5 ml tubos de centrífuga. Seca-se as amostras com um concentrador centrífugo de vácuo, a 45 ° C (demora cerca de 1-1,5 horas). </li><li> Ressuspender cada uma das amostras das três frações em 200 mL de metanol 100%, vortex, e transferência para amostrador automático frascos com tampa de rosca para armazenamento. </li></ol> 6. Amostra Condições de armazenamento <ol><li> Armazenar todas as amostras a -80 ° C até estar pronto para a análise de instrumento. Observação: as amostras extraídas, reconstituídos em solvente orgânico pode ser armazenada a -20 ° C. No entanto isso não é recomendado como potenciais metabólitos de interesse irá degradar a esta temperatura. Armazenamento de nitrogênio líquido também não é recomendado como investigadores relataram problemas de contaminação, frascos especiais de armazenamento são necessários, e não há falta de homogeneidade na cau câmaracantar flutuações de temperatura. </li><li> Se o volume da amostra é pequeno (&lt;100 ul), utilizar inserções nos frascos para evitar a evaporação do solvente na câmara de expansão durante a armazenagem. </li><li> Evitar congelamento-descongelamento das amostras. Descongele as amostras de uma só vez, mesmo antes da análise do instrumento. Repetidas congelar-degelos resultar na degradação da amostra. </li></ol> 7. Líquidos condições cromatográficas <ol><li> Usar um C-18 2,1 milímetros x 50 mm (1,8 mm) com uma coluna analítica C-18 de 2,1 milímetros x 12,5 milímetros (5 um)-coluna para analisar a fracção hidrofóbica. </li><li> Regule a temperatura do amostrador automático para 4 &#160; ° C, a temperatura da coluna para 60 &#160; ° C, o volume de injecção de 2 ul e a taxa de fluxo de 0,25 ml / min. </li><li> Use 0,1% de ácido fórmico em água para a fase móvel A, e 0,1% de ácido fórmico em isopropanol: acetonitrilo: água (60:36:4), para a fase móvel B. </li><li> Execute o seguinte perfil de eluição gradiente: Iniciar umt 30% de B, e aumento de 70% de B de 0 a 1 min, em seguida, subir para 100% de B de 1 a 15 minutos e manter durante 5 min, seguido de 5 min 10% de B e de lavagem de 5 min pós prazo. </li><li> Usar um x 50 mm HILIC 2,1 milímetros (2,6 mm) coluna analítica com uma coluna de guarda para analisar a fracção hidrofílica. </li><li> Regule a temperatura do amostrador automático para 4 &#160; ° C, a temperatura da coluna para 20 &#160; ° C, o volume de injecção de 2 ul e a taxa de fluxo de 0,5 ml / min. </li><li> Usar 50% de acetonitrilo em acetato de amónio 10 mM, pH 5,8, para a fase móvel A e 90% de acetonitrilo em 10 mM de acetato de amónio pH 5,8, para a fase móvel B. </li><li> Executar o seguinte perfil de eluição gradiente: Inicio a 100% de B de 0 a 2 min, depois diminua para 50% de B, 2-15 min, seguido de 5 min 0% de lavagem B e 10 min após a execução. </li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+the+human+circulating+endocannabinoid+metabolome:+clinical+sampling+and+sample+storage+parameters.">Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).</li><li>Bahr, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um dos objetivos dos estudos clínicos metabolômica é identificar mudanças no metaboloma relacionados com a doença ou tratamentos. Portanto as técnicas de preparação de amostras precisa ser robusto, consistente e transferíveis de técnico para técnico e de laboratório para laboratório 22. Os dados resultantes precisa ser representativa da amostra, e as mudanças identificadas precisam refletir a amostra definida em vez de erros de preparação de amostras. Portanto pipetagem precisa, a temperatura correta, decantação eficiente de camadas imiscíveis, secagem em atmosfera de azoto, e uso das mesmas marcas e tamanhos de copos e dicas são necessárias. Durante o passo de precipitação de proteína, é fundamental que a mesma quantidade de solução é decantada a partir de cada pelete. Isto reduz a variação de volume e, como tal, reduz a variação nos dados de exemplo. Este passo de precipitação de proteínas é necessária para estudos metabolomic e não pode ser ignorada, uma vez que remove a proteína a partir deas amostras antes da análise de perfil de molécula pequena sobre o espectrómetro de massa. Ele elimina patógenos e grandes macromoléculas, e libera obrigado metabólitos de proteínas 7. A falta de acumulação de proteínas nas amostras aumenta a vida útil da coluna de HPLC e aumenta a precisão e qualidade dos resultados. Figura 5 é uma representação da pelete de proteína formado quando da realização desta técnica em amostras de plasma. Isto permite a detecção de moléculas pequenas, aumenta a abundância de iões, e reduz os efeitos da matriz de proteínas na amostra. Além disso, uma vez que se assume que todas as proteínas são removidos nesta etapa, os aminoácidos que são detectadas durante a análise por LC-MS que originam alterações metabólicas, em vez de a partir de degradação de proteínas. A fase de extracção líquido-líquido é crítica, uma vez que separa os metabolitos hidrofílicos e hidrofóbicos em duas camadas imiscíveis. Figura 6 mostra o processo LLE e um representantepresentação da camada LLE. Uma separação indevida das duas camadas resulta em metabolitos ou ser perdidos ou sendo eluídas em ambas as fracções. Aplicação cuidadosa deste passo reduz o número de compostos hidrofílicos que aparecem na fracção hidrofóbica. Os resultados para estes compostos tornam-se pouco fiável, uma vez que não pode ser determinado que fracção contém os resultados representativos. Quando feito corretamente, metabólito sobreposição é reduzida. Para evitar a degradação oxidativa, principalmente em lípidos, mas também, em pequenas moléculas que podem conter grupos tiol, por exemplo, a exposição ao oxigénio tem de ser mantida a um mínimo. Por conseguinte, este procedimento é sempre realizada sob azoto para reduzir / evitar a oxidação dos lípidos ou compostos contendo tiol. Além disso, a transferência da amostra e / ou a solução é rápida (dentro do primeiro minuto), para reduzir a exposição ao oxigénio, em seguida, as amostras são rapidamente colocados sob um fluxo constante de azoto para secar para baixo. Uma vez secos, são imediatamentediatamente ressuspensas em 100% de metanol para as razões acima discutidas. Laboratórios podem se beneficiar deste método abrangente de várias maneiras; Os pesquisadores procuram isolar uma classe de compostos pode escolher a parte do método que melhor se adapte às suas necessidades. Aqueles que procuram para realizar apenas uma precipitação de proteínas para obter um pool de metabólitos podem fazê-lo. Se os metabolitos hidrofílicos são desejados, tais como muitas drogas farmacêuticas, aminoácidos e açúcares, ou se apenas metabolitos hidrofóbicos são desejados, tais como triglicéridos, epóxidos, vitaminas solúveis em gorduras, e fosfolípidos, por exemplo, em seguida, os investigadores podem realizar a extracção líquido-líquido passo seguinte precipitação de proteínas e descartar a fração indesejada. Os investigadores que necessitam de mais sub-classificação dos compostos hidrofóbicos (lipídios neutros, ácidos graxos e fosfolipídios) podem avançar para a etapa de fracionamento. Considerações de armazenamento são importantes na maintaining a viabilidade das amostras para análise posterior. Se as amostras são armazenadas de forma incorreta, a degradação ou decomposição pode ocorrer. Idealmente, as amostras devem ser armazenadas em frascos âmbar com tampa de rosca longe de luz para evitar a degradação das espécies sensíveis à luz. As amostras também deve ser mantido congelado a -80 ° C para evitar degradação do metabolito 23-25. Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, as amostras são sempre mantidas a 4 ° C no tabuleiro amostrador automático durante a análise por LC-MS. Isto assegura que todas as amostras são mantidas a uma temperatura constante e que as alterações na temperatura ambiente, não afectam a viscosidade, solubilidade, estabilidade ou das amostras. Recomenda-se que os aspectos manuais deste procedimento, como LLE e SPE, ser praticada, a fim de ganhar a confiança e conforto com as etapas envolvidas. Existem algumas limitações para esta técnica. Discreto separação dos metabólitos hidrofílicos e hidrofóbicos não é garantida como certos compostos vontade inherSuavemente particionar em ambas as frações, devido à sua composição química e taxa de Estado. Além disso, como mostrado na Figura 4, a técnica inadequada durante o passo de extracção do sedimento da proteína pode resultar em fraca reprodutibilidade metabolito em ambas as amostras e os controlos de qualidade. Isso afeta as estatísticas, especialmente em pequenos conjuntos de dados, porque o poder estatístico não está disponível. Portanto, é fundamental que esta etapa ser realizada exatamente no mesmo tempo cada para cada amostra. Outra limitação é o tempo. Embora existam pontos de parada ao longo deste protocolo, onde as amostras podem ser congeladas e a preparação continuou no dia seguinte, um dia inteiro deve ser anulado para realizar esse procedimento. Em terceiro lugar, nem todos os compostos dentro de uma amostra biológica pode ser avaliada para a supressão de iões. Como não é possível identificar como a matriz está afetando cada metabólito individual, a opção é avaliar os padrões internos que teoricamente imitam algumas classes de endogenous metabolitos. Por último, as identificações absolutos não pode ser realizado apenas com este método. Tandem MS em colaboração com pesquisas de banco de dados e padrões são necessários para a identificação absoluta metabólito. Uma parte importante do metaboloma, é a identificação de compostos. Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, as amostras de controle de qualidade foram analisados ​​utilizando LC-MS. Vários espaços de preparação de amostras e espaços em branco instrumento foram preparadas para uso como pano de fundo a subtração de reduzir a taxa de falsos positivos de contaminantes, resultando em visitas metabólitos mais confiáveis. Após esta etapa, o número de &quot;características moleculares&quot; foram agrupados com base em m / z, tempo de retenção, razão isotópica, e adutos para produzir uma lista de compostos reais. Embora a lista de compostos foi grandemente reduzida, os resultados foram mais fiável porque não eram baseados em vários adutos do mesmo composto. O método integral é abrangente e permite isolation de metabolitos hidrofóbicos tais como lípidos neutros, fosfolípidos, ácidos gordos, triglicéridos, e esteróides, enquanto também isolar as classes hidrofílicos na fracção aquosa, dos quais os eicosanóides, açúcares, flavonóides e aminoácidos foram identificados 12, 26.

As reacções biológicas gerar metabólitos como produtos finais de processos celulares. Metabolomics é uma coleção de todos os compostos presentes no organismo, como resultado desses processos. Ele fornece uma imagem da fisiologia das células e reflete a resposta de um organismo a estímulos externos ou internos 1, 2. Esses estímulos podem ser ambientais, toxicológicos, farmacológicos, dietética, hormonal, ou relacionados à doença. Muitas aplicações metabolômica têm e estão actualmente a ser estudada por pesquisadores e incluem descoberta de biomarcadores 3, estudos de nutrição 4, ciência dos alimentos 5 e testes de drogas 6. Independentemente da aplicação, as variações nos dados, contaminação e presença de falsos positivos têm de ser reduzidas ou, de preferência removido. Na descoberta de biomarcadores ou, no caso de se determinar as diferenças entre um controlo e um grupo de doenças, ou de investigação dos efeitos de drogas em indivíduos, um f biológicaLUID é escolhido com base nas perguntas que estão sendo feitas e os tipos de metabólitos sendo investigado 7. Por exemplo, se a estudar os efeitos imediatos de uma droga inalada nos pulmões de asmáticos, em seguida, explorar metabólitos em lavado broncoalveolar de líquidos (LBA) amostras, antes e após a administração seria preferencial. Para garantir que observadas diferenças são devido à variação biológica real em vez de amostra inadequada técnica de preparação, protocolo laboratorial padronizada e consistente é essencial 8. Informações da amostra deve ser cuidadosamente documentadas para garantir que variáveis ​​como fluido biológico, a estirpe animal, tempo de amostragem, idade sujeito, sexo, só para citar alguns, são todos considerados e tidos em conta no estudo 9. Além disso, para reduzir a possibilidade de contaminação ou de falsos positivos, recomenda-se que os esboços de solventes e espaços em branco do instrumento ser analisado 10. Para este protocolo, o termo &quot;metabolismolites &quot;será usado para referir-se os compostos identificados reais. Usando o software de fornecedor, um algoritmo inicial pico constatação é usado para detectar picos do espectro de massa. Estes picos estão alinhados com base na massa-para-carga razão (m / z) e tempo de retenção. Um segundo algoritmo é então usado para combinar múltiplas funções num único composto. Isso inclui características tais como sódio, potássio, amónio ou adutos no modo de ionização positivo, e cloreto de no modo de ião negativo. Opções adicionais do software incluem recursos como dímeros e outros adutos. Utilizando a glicose como um exemplo, com picos a 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH4), e 203,05261 m / z (M + Na), haveria três picos correspondentes ao mesmo composto com o primeiro algoritmo. No entanto, quando o segundo algoritmo, que se baseia na fórmula molecular, é aplicada nestes três adutos tornar agrupados em conjunto, resultando em um composto. Metabólitos podem causar interferências no samples devido à complexidade dos compostos presentes. A presença de milhares de metabólitos em uma amostra causas sinalizar supressão particularmente dos metabólitos menor abundância. Exemplo de limpeza para remover proteínas interferentes, e subsequente separação em várias fracções reduz a complexidade da amostra, melhorando assim a separação de pico, aumentando a resolução, e reduzindo metabolito co-eluição. Portanto, é necessária a limpeza da amostra e uma melhor separação dos compostos. Demonstrou-se que a precipitação da proteína por si só, mesmo com o uso de vários solventes de polaridade, não é possível resolver este problema 11, 12. No entanto, através da combinação de um solvente orgânico forte, tal como o MTBE com um passo de fraccionamento subsequente, a cobertura de metabolito é aumentada. 12 Yang et al. Relataram um aumento nos metabólitos de 1.851 ou 2.073 com metanol ou sozinho precipitação metanol-etanol, respectivamente, para 3.806 metabólitos utilizando MTBE combinado extração por solventeseguido de extracção em fase sólida (SPE) passos. Reduzido sobreposição metabolito, melhor separação de pico e aumento da abundância metabolito foi observada com este método. Contaminação de não-metabólitos, tais como polímeros, pode ser resultado de coleta de amostras, solventes ou ruído do instrumento, e pode resultar em supressão do sinal de metabólitos potencialmente significativas. Recomenda-se que o técnico (s) e aqueles que recolhem as amostras antes da preparação da amostra usar consistentemente a mesma marca, tipo e tamanho de frascos de coleta de amostras, pontas para pipetas e quaisquer outros tubos utilizados durante a coleta e preparação das amostras. Isso permite que o analista de dados para ter plena confiança de que as mudanças observadas são reais e não devido a diferenças de fundo de outras fontes. Eficácia do tratamento, as variações entre grupos de doenças e controle, ou quaisquer outras análises metabólicas então pode ser investigado com maior confiança. A metanfetaminaod discutido aqui se concentra na combinação de métodos de preparação de amostras 13-15, que podem ser aplicadas a plasma, LBA, ou amostras para profiling metabolomic não-alvo de espectrometria de cromatografia de massa líquida (LCMS) análise com base no líquido cefalorraquidiano (LCR). Tanto a cromatografia líquida (CL) e cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC) técnicas de separação pode ser acoplado a MS subsequente a este procedimento. Muitos pesquisadores realizando estudos metabolômica usar uma técnica de precipitação de proteínas e / ou uma técnica de extração líquido-líquido 16, 17. Nos nossos estudos, o que resultou em menos metabolitos ser detectado. O método descrito aqui 12 permite a detecção e identificação de um maior número de metabolitos, abrangendo uma vasta gama do metaboloma. Este aumento é devido à maior pureza das amostras e os efeitos da matriz reduzidas provocadas pela separação anterior das classes de metabolitos. Um prot inicialein passo de precipitação é realizada utilizando-se metanol frio (MeOH) para remover a proteína da amostra. Extracção líquido-líquido (LLE) usando éter metil-terc-butílico (MTBE) e água é usada para separar os compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Em seguida, a extracção em fase sólida (SPE), é realizado na camada hidrofóbica para separar os compostos hidrofóbicos em três classes - ácidos gordos, lípidos neutros, e fosfolípidos. As fracções hidrofóbicas são reconstituídos em 100% de metanol, enquanto que a fracção hidrófila é reconstituída em 5% de acetonitrilo em água. A extracção (SPE)-passo em fase sólida proporciona um nível adicional de confiança nos resultados, reduzindo o número de compostos coeluting que seria de outro modo estar presentes tinham um passo de separação não foi realizada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A955-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methanol</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L-6815</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C606-1</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Hexane</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34859</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">49199-50ML-F</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Methyl tert-butyl ether</td>
			<td style="width:163px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">9042-03</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:163px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34965-2.5L</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Water</td>
			<td style="width:163px;">Honeywell Burdick &#38; Jackson</td>
			<td style="width:119px;">365-4</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">OA-SYS heating system</td>
			<td style="width:163px;">Organomation Associates, Inc</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">12-position vacuum manifold</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:167px;">Strata NH2 (55&#181;M, 70&#197;) 100mg/mL SPE cartridges</td>
			<td style="width:163px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:119px;">8B-S009-EAK</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass pipette tips</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20C</td>
			<td style="width:183px;">Used to transfer sample to SPE column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Plastic pipette tips</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1182-1830</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used when glass tips are not necessary</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">1182-8810</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-681-320</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:167px;">Graduated glass pipets</td>
			<td rowspan="2" style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-27B</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;">Used to transfer organic solvents during sample prep</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:119px;">13-678-27E</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Pyrex glass culture tubes</td>
			<td style="width:163px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:119px;">99499-16X</td>
			<td style="width:183px;">Used to store aqueous and lipid fractions until the next step</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:167px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0545</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Snap cap vials for autosampler vials</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5182-0541</td>
			<td style="width:183px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Glass inserts</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5183-2085</td>
			<td style="width:183px;">Used for small sample volumes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Qualitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.06.00</td>
			<td style="width:183px;">Used to monitor retention times and pressure curves</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:167px;">Mass Hunter Quantitative Analysis software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.05.02</td>
			<td style="width:183px;">Used to analyze quality control and sample data</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">Mass Profiler Professional software</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">Version B.12.50</td>
			<td style="width:183px;">Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-step preparation technique to recover multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic analysis

Metabolomics é uma área emergente que permite perfis de amostras a partir de organismos vivos, a fim de obter uma visão sobre processos biológicos. Um aspecto vital da metabolômica é a preparação da amostra em que técnicas inconsistentes gerar resultados não confiáveis. Esta técnica envolve a precipitação de proteínas, a extracção líquido-líquido, e de extracção em fase sólida como um meio de fraccionamento de metabolitos em quatro grupos distintos. Melhoria enriquecimento de moléculas de baixa abundância, com conseqüente aumento na sensibilidade é obtida, e, finalmente, resulta em uma identificação mais confiante de moléculas. Esta técnica tem sido aplicada ao plasma, lavado bronco-alveolar, e amostras de líquido cefalorraquidiano com volumes tão baixos quanto 50 ul. As amostras podem ser utilizados para várias aplicações, a jusante; por exemplo, o sedimento resultante da precipitação de proteína pode ser armazenada para posterior análise. O sobrenadante do passo que sofre de extracção líquido-líquido usandoágua e solvente orgânico forte para separar os compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Uma vez fracionado, a camada hidrofílica pode ser processado para posterior análise ou descartados se não for necessário. A fracção hidrofóbica é ainda tratada com uma série de solventes, durante três passos de extracção em fase sólida para o separam em ácidos gordos, lípidos neutros, e fosfolípidos. Isto permite que o técnico a flexibilidade para escolher qual a classe de compostos é a preferida para análise. Ela também ajuda na identificação metabólito mais confiável, já que existe algum conhecimento da classe química.

Toda a técnica de preparação da amostra foi realizada como descrito acima e os aspectos mais importantes e / ou relevantes são apresentados abaixo. Padrões internos hidrofílicos e hidrofóbicos foram incrementadas em amostras de plasma agrupados para realizar comparações diretas dos padrões internos e abundâncias de metabólitos endógenos usando vários métodos de extração. Espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) Os dados foram analisados ​​utilizando o software qualitativa e quantitativa e resultou em excelente recuperação e separação de ambos os compostos endógenos e os padrões internos. Figura 1 demonstra a eficácia do método de MTBE-SPE em extrair ambos os padrões de lípidos (A) e compostos endógenos (B). No geral, melhor extração e cobertura dos metabólitos foram obtidos em comparação com outros métodos, como a extração de metanol, ou &#39;só MTBE «extracção quando o número ocaracterísticas f foi comparado usando software qualitativa e quantitativa seguinte análise LC-MS. Por exemplo, utilizando apenas a extracção de metanol, a variação de creatinina D-3 foi de 15,2%. No entanto, com MTBE LLE, este foi reduzido para 1,04% CV. Usando o MTBE, a reprodutibilidade de lípidos e compostos aquosas foram &lt;8% e &lt;5%, respectivamente, comparado com uma simples extracção metanol o que resultou em maior variação de 29% e 15%, respectivamente, para lípidos e compostos aquosos. Os padrões internos utilizados para monitorar as recuperações de lípidos - testosterona-D 2, C17 ceramida, 15:00 PC, PE e 17:00 aumentou em 26%, 200%, 100%, 400%, respectivamente, em relação ao uso de metanol. Aumentos semelhantes foram detectados por padrões internos de ácidos graxos e phosphotidylcholine e metabolitos endógenos phosphotidylethanolamine. Outros metabolitos endógenos, tais como ceramidas, esfingosinas, diacilgliceróis, triacilgliceróis, colesterol e esfingomielina, ou não foram detectadasusando metanol ou foram detectados em níveis insignificantes. No entanto, estes lipídios endógenos foram facilmente detectadas usando extração MTBE. Na nossa análise comparando protocolos padrão, os resultados seguintes foram obtidos: precipitação com metanol sozinho resultou em 1,851 metabolitos, precipitação com metanol-etanol deu 2,073 metabolitos, MTBE com a extracção líquido-líquido, deu 3,125, e com MTBE líquido-líquido e de extracção em fase sólida recuperadas 3.806 metabólitos. Portanto, esta abordagem resulta em um maior número de metabólitos sendo extraídos, muito provavelmente devido à supressão de íons reduzidas e das amostras mais limpas antes de LC-MS. A Figura 2 demonstra a eficiência na separação dos metabolitos hidrófobos nas respectivas categorias de produtos químicos para a identificação do metabolito mais confiantes. Há uma sobreposição mínima de compostos identificados nas três fracções lipídicas seguintes SPE. Em apoio, a Figura 3 mostraa recuperação dos padrões internos que demonstram que foram eluídas da ISTD na fracção relacionada com a sua classe de produtos químicos. As amostras de controlo de qualidade são usados ​​para avaliar a qualidade da preparação da amostra, para determinar quaisquer efeitos batch quando vários dias de análise são necessários para um grande conjunto de amostras, e para monitorizar instrumento reprodutibilidade. Os cromatogramas são examinados para assegurar que os padrões são enriquecidas em mais do que 90% recuperado com massa de erro inferior a ± 3 ppm e retenção de janela de tempo de menos do que ± 5%. Se estes critérios não forem satisfeitos, os resultados são descartadas e as amostras são novamente analisadas. No caso de efeitos de lote através do qual uma mudança na retenção é observado para um lote, o software de análise de dados pode corrigir por este. Um lote previamente preparada de amostras de plasma reunidas foram submetidos a preparação da amostra. As fracções foram em seguida sub-divididas em alíquotas para frascos de auto-amostragem e armazenado a -80 ° C para uso na monitorização instrumento condições ao longo de cada análise de amostras. Tabela 1 mostra os resultados a partir destes padrões de pico-a. A fracção modo de ionização negativa de ácidos gordos (dados não apresentados na tabela) não foi utilizado para análise, porque o CV% dos padrões de pico-a para a amostra QC foi maior do que 10%. O conjunto de dados para a fracção que foi, portanto, descartado e o instrumento inspeccionado e mantido. Tabela 2 mostra os resultados de metabolitos endógenos nas amostras seguintes três dias diferentes de preparação da amostra e as injecções de instrumentos em triplicado. Os metabolitos endógenos na preparação de amostras de amostras QC são reproduzíveis, significando a força da preparação da amostra, bem como o aparelho de injecção de reprodutibilidade. Quando os passos de preparação de amostra não são adequadamente seguidos, no entanto, obtêm-se a resultados pouco fiáveis ​​e inconsistentes. Figura 4 mostra os resultados quando o passo de precipitação de proteína do métodonão é seguido, conforme descrito. Três operadores, A, B, C e realizou o mesmo procedimento de preparação da amostra em amostras de plasma reunidas. Um operador, em vez de pipetando a quantidade necessária de sobrenadante por o protocolo experimental, em vez pipetados&gt; 1 ml para ambas as lavagens com algum do pelete. Isto não só resulta em um maior número de falsos positivos para a fracção, mas o aumento da variabilidade dos dados. A reprodutibilidade dos dados cromatográficos pode ser visto na Figura 7. Amostras de bancos de plasma foram preparadas em triplicado, em dias separados utilizando a precipitação de proteínas, a extracção líquido-líquido, e de extracção em fase sólida como descrito no presente protocolo. Cada fração foi analisada utilizando a separação cromatográfica descrito no capítulo 7 do protocolo. As amostras foram então injectadas em triplicado em LC-MS para avaliar instrumento e preparação da amostra de reprodutibilidade. Esta sobreposição consistente demonstra tanto a strength da reprodutibilidade da preparação da amostra, quando preparado em três dias diferentes, bem como a força do método de cromatografia em produzir resultados reprodutíveis. Observa-se um aumento do ruído químico para o modo de ionização negativa da fração de ácidos graxos. Isto pode ocorrer devido a contaminantes nos solventes de LC-MS e pode resultar em resultados quantitativos metabolomic inconsistentes. Por isso foram analisados ​​apenas metabólitos que eluídas antes de 9 min. Ao executar as listas de trabalho longos, uma perda de sensibilidade do instrumento e mudança em concentrações de tampão podem ocorrer ao longo do tempo, resultando em diminuição da intensidade do sinal e desvio de tempo de retenção. Se a variação de sobreposição tempo de retenção é menor do que 5% e a variação da intensidade do sinal é menor do que 10%, os dados ainda está dentro dos limites normais de laboratório. O software de análise pode ser utilizado para alinhar e normalizar os dados para corrigir desvio instrumento e tempo de retenção. No entanto, se a variação for large, em seguida, o motivo tem de ser determinado. Uma vez que isto seja corrigido, as amostras podem ser re-analisados. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. A abundância de istDS lipídicas (A) e os metabolitos endógenos (B) a seguir a extracção e cromatografia de fase reversa (RPC) 12. A extracção foi efectuada e as amostras resultantes foram separadas usando RPC e analisadas utilizando LC-MS no modo de ionização positivo e negativo. Esta figura foi modificado a partir de Yang et ai, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Uma comparação de MTBE-SPE frações 12. Os metabolitos identificados em cada fração foram comparadas para identificar a quantidade de sobreposição durante a porção de SPE da prep. Os números no diagrama de Venn reflectir o número de metabolitos detectados em cada fracção. Aqui menor sobreposição é observada entre as três frações, representando extração composto de sucesso e separação classe metabólito durante a etapa de SPE. Esta figura foi modificado a partir de Yang et ai, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. A recuperação de istDS nas fracções, utilizando o método de MTBE-SPE 12. A extracção foi efectuada e as amostras resultantes foram separadas usando RPC e analisados ​​utilizando LCMS no modo positivo e negativo como descrito no texto. Este valor foi modificado de Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013). &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Resultados da fração pellet elaborado por três operadores. Três amostras preparação operadores A, B, C e realizada no mesmo passo de preparação de proteína em amostras de plasma reunidas. Os números no diagrama de Venn reflectir o número de metabolitos detectados por cada operador. Operadores B e C pipetado o volume necessário por o protocolo de preparação da amostra, enquanto operador Um pipetados todo o sobrenadante e algum do pelete, resultando em mais de 500 mais metabolitos, a maioria sendo falsos positivos para a fracção específica. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Formação de sedimento de proteína durante a etapa de precipitação de proteína &lt;. / Forte&gt; (A), 100 ul de plasma humano, antes da preparação da amostra, (B) no plasma após adição de metanol arrefecido em gelo, (C) pílula de proteína formada no fundo do tubo de centrifugação, depois a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Separação das camadas hidrofílicos e hidrofóbicos durante a extracção líquido-líquido (LLE) passo. O solvente de éter metil terc-butílico orgânico (MTBE) e água, foram utilizadas para separar os metabolitos hidrofílicos e hidrofóbicos. A camada de MTBE foi dissolvido compostos não-polares, e a camada de água foi dissolvido compostos polares (A) sobrenadante do plasma, após a remoção de proteína,. (B) no plasma, após secagem sob azoto, (C) no plasma após adição de MTBE; <str<html> ong&gt; (D) adição de água de plasma e MTBE, (E) camada de MTBE-água formada após a centrifugação, (F) a remoção da camada de MTBE topo, (L), principalmente camada hidrófila permanece após a remoção de MTBE. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Cromatogramas de fracções de um conjunto seleccionado de preparação da amostra. Foi realizado em três amostras de QC plasma reunido separadas e cada amostra foi injectada em triplicado no instrumento LC-MS. Representado são cromatogramas de íons totais das amostras de plasma adquiridos usando os parâmetros de LC-MS indicados na seção 7 do protocolo de método. A representação cromatográfica de outros fluidos biológicos podem variar devido a diferenças na composição do metabolito.k &quot;&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="485"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> Fração </td><td style="width:72px;"> Modo de ionização </td><td style="width:127px;"> Padrão interno </td><td style="width:23px;"> n </td><td style="width:103px;"> Área Média Peak </td><td style="width:77px;"> Área do pico% CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Aquoso </td><td> Positivo </td><td> Creatinina D-3 </td><td> 31 </td><td> 2217311 </td><td> 3,8% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Lípido neutro </td><td> Positivo </td><td> Triglicérides-D 5 </td><td> 31 </td><td> 4837032 </td><td> 9,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td&gt; <td></td><td> C17 ceramida </td><td> 31 </td><td> 12736707 </td><td> 7,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Phospholipid </td><td> Positivo </td><td> 15:00 PC </td><td> 32 </td><td> 1248929 </td><td> 9,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 17:00 PE </td><td> 32 </td><td> 517234 </td><td> 7,9% </td></tr></tbody></table> Os resultados do controlo de qualidade tabela 1. Dos padrões internos cravado. Amostras de plasma obtidos a partir de um conjunto de dados modelo enfisema rato foram analisados ​​para monitorar as condições do instrumento em uma base diária para este estudo multi-semana. O software de análise quantitativa foi usada para determinar as áreas dos picos dos padrões internos (n = número de instrumento injecções de CQ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="555"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> Fração </td><td style="width:76px;"> Modo de ionização </td><td style="width:212px;"> Metabolitos endógenos </td><td style="width:103px;"> Área Média Peak </td><td style="width:80px;"> Área do pico% CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Aquoso </td><td> Positivo </td><td> Creatinina </td><td> 2554574 </td><td> 2,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Valina </td><td> 3712151 </td><td> 3,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Glicose </td><td> 2669190 </td><td> 6,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Lípido neutro </td><td> Positivo </td><td> 3-Dehydrosphinganine </td><td> 226644 </td><td> 3,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td&gt; DG (16:0 / 16:1 / 0:0) </td><td> 11301 </td><td> 8,2% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> DG (P-14: 0/18: 1) </td><td> 364119 </td><td> 1,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Phospholipid </td><td> Positivo </td><td> PC (24:0 / 0:0) </td><td> 27599 </td><td> 0,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PC16: 0/22: 6) </td><td> 2873326 </td><td> 4,5% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PI (16:00 / 18:01) </td><td> 112998 </td><td> 4,4% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ácido graxo </td><td> Positivo </td><td> -5-oxo-10 ,8-decadienoic </td><td> 1363284 </td><td> 2,3% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Ácido 16-oxo-heptadecanóico </td><td> 83700 </td><td&gt; 2,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Ácido 2-metil valérico </td><td> 285782 </td><td> 5,7% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Ácido graxo </td><td> Negativo </td><td> Ácido 10-hidroxi-8-octadecenóico </td><td> 10042 </td><td> 4,9% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> (R)-laballenic ácido </td><td> 173929 </td><td> 6,5% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> Ácido valérico ácido 2-ceto </td><td> 35488 </td><td> 6,0% </td></tr></tbody></table> Os resultados do controlo de qualidade tabela 2. Dos metabolitos endógenos. Amostras de plasma obtidos a partir de um conjunto de dados doença humana foram analisadas para monitorar amostra preparação reprodutibilidade em dias separados. As amostras foram preparadas em triplicado, durante três dias, (n = 9 prep injecções de CQ).

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Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

A confiabilidade dos resultados em experimentos de metabolômica depende da eficácia e reprodutibilidade da preparação de amostras. Descrito é um método rigoroso e em profundidade que permite a extração de metabólitos a partir de fluidos biológicos com a opção de seguida, analisar-se a milhares de compostos, ou apenas as classes de compostos de interesse.

Preparação Técnica Multi-passo para recuperar várias classes compostas metabólito para em profundidade e análise metabolômica Informativo

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

32.2K visualizações.  National Jewish Health.  A confiabilidade dos resultados em experimentos de metabolômica depende da eficácia e reprodutibilidade da preparação de amostras. Descrito é um método rigoroso e em profundidade que permite a extração de metabólitos a partir de fluidos biológicos com a opção de seguida, analisar-se a milhares de compostos, ou apenas as classes de compostos de interesse. 

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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Preparação de amostras, Imaging, and Analysis Protocolos para Faca de ponta microscopia de varredura

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE: Uma biodegradável Hemostática Glue Inspirado por um Composto Ubiquitous em plantas para aplicação cirúrgica

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-passo fotolitografia Variável Altura para Valved multicamada microfluídicos Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...