We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

1. Manual Abstracted Modelo de Geração Nota: Os detalhes da metodologia descrita a seguir são específicos para Chimera, mas outros pacotes de software pode ser usado em seu lugar. Use essa abordagem quando o único objetivo é criar um modelo geométrico (por exemplo, um modelo de bola e stick), a fim de fazer medições geométricas, em vez de exibir a forma de volume dos objetos. <ol><li> Importe o volume de dados em um programa adequado para a geração do modelo abstraído manual. <ol><li> Selecione Arquivo&gt; Abrir Mapa de puxar para cima a caixa de diálogo Abrir Arquivo. Navegue até o local do mapa desejado arquivo. </li><li> Puxe o Visualizador de Volume (Ferramentas&gt; volume de dados&gt; Volume Viewer) e selecione Recursos&gt; Estilo de exibição para exibir dados com diferentes estilos de renderização. </li><li> Ajuste o limite para a apresentação, arrastando a barra vertical no histograma no Visualizador de Volumejanela. </li></ol></li><li> Navegue pelo volume 3D (por exemplo, fatia por fatia) para selecionar uma área de interesse para a segmentação e recortar um sub-volume menor, se necessário. <ol><li> Na caixa de diálogo Visualizador de Volume, clique em Eixo, em seguida, selecione X, Y, ou Z. </li><li> Na caixa de diálogo Visualizador de Volume, selecione Recursos&gt; Planes. Clique One para definir Profundidade para apresentar o plano correspondente ao número na caixa à esquerda, e clique em Todos para exibir todos os planos. </li><li> Na caixa de diálogo Visualizador de Volume, selecione Recursos&gt; seleção sub-região. <ol><li> Clique e arraste para criar uma caixa retangular em torno da região de interesse. </li></ol></li></ol></li><li> Coloque marcadores ao longo da característica de interesse e conectá-los com ligantes se for o caso (muitas vezes feito automaticamente pelo programa) até que o modelo esteja completo. <ol><li> Na barra de menu Visualizador de Volume, selecione Ferramentas&gt;Diálogo Tracer Volume para abrir o diálogo Volume Tracer. Na caixa de diálogo Tracer Volume, selecione File&gt; New marcador Set. </li><li> Na caixa de diálogo Tracer Volume, verifique Mouse&gt; Coloque marcadores em alta qualidade, marcadores de lugar em planos de dados, Mover e redimensionar marcadores, Link novo marcador para marcador selecionado, e Link consecutivamente marcadores selecionados. </li><li> Clique na amostra de cores marcador, e selecione uma cor. Repita este passo para a cor Link. </li><li> Digite raios para o marcador e link elementos de construção de modelos. </li><li> Na Janela Tracer Volume, selecione marcadores de lugar com o botão [direita] do mouse, e inserir raios de marcadores e links. </li><li> Clique com o botão direito sobre os dados de volume para começar, que estabelece marcadores. Marcadores serão conectados automaticamente. </li><li> Na caixa de diálogo Tracer Volume, selecione Arquivo&gt; Salvar conjunto marcador atual, depois em File&gt; Fechar marcador set. </li></ol></li&gt; <li> Abra um novo conjunto marcador (Passo 1.3.1) para iniciar a construção de um modelo em uma segunda característica desejada de interesse. Utilize cores contrastantes entre as séries de marcadores para enfatizar as diferenças de características. </li></ol> 2. traçado manual de características de interesse Nota: Os detalhes da metodologia descrita a seguir são específicos para Amira, mas outros pacotes de software pode ser usado em seu lugar. Use essa abordagem quando a densidade populacional é relativamente pequena e quando a precisão da extração de características é fundamental, já que o traçado manual é uma abordagem demorado. <ol><li> Dados de volume de importação para um programa com opções de traçado manual. Software com esta capacidade geralmente oferecem, pelo menos, uma ferramenta básica pincel. <ol><li> Para grandes volumes ou tomografias (por exemplo, 16-bit 2048 x 2048 ou maior .rec ou .mrc tomogramas gerada em Imod): Selecionar Dados Abertos&gt; Botão direito do mouse sobre filename.rec&gt; Formatar ...&gt; Selecione Raw como LargeDiskData </i&gt;&gt; Ok&gt; Load. Selecione Raw apropriado parâmetros de dados a partir de informações de cabeçalho&gt; OK. Alterne e Salvar como um novo <a href="http://filename.am/">filename.am</a> arquivo para uso nas etapas seguintes. </li><li> Para arquivos menores 3D imagem Pilha (por exemplo, .tif 3D ou .mrc ou .rec): Open Data&gt; Select filename.tif ou filename.mrc. Alternar e clique direito&gt; Salvar como <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . Se um erro é gerado ou o programa não está respondendo, o arquivo pode ser muito grande e pode ser aberto seguindo a Etapa 2.1.1. </li></ol></li><li> Navegue através das fatias para selecionar um sub-volume 3D para a segmentação, e em seguida, cortar a esta área de interesse. <ol><li> Na janela 3D Viewer, selecione Orthoslice para abrir arquivo de imagem. Use controle deslizante na parte inferior para navegar por fatias. </li><li> Para cortar dados maiores abertos como LargeDiskData, alternar nome do arquivo na janela Piscina&gt; clique com o botão direito&gt; LatticeAccess. Enter tamanho da caixa desejada&gt; Aplicar. Salve novo arquivo. </li></ol></li><li> Criar arquivo de segmentação. <ol><li> Alterne o arquivo na janela do Exterior&gt; Clique direito&gt; Etiquetagem&gt; LabelField. Um novo arquivo será criado e carregado automaticamente no separador Segmentação Editor. </li></ol></li><li> Traçar a fronteira da primeira característica de interesse, em seguida, preencher o traço à mão ou usando um comando específico para o software utilizado. Siga o recurso de interesse através de todas as fatias e repita a segmentação rastreamento manual. Utilize os seguintes comandos ao usar Amira: <ol><li> Para usar a ferramenta Pincel, alterar o tamanho do pincel, como desejado, em seguida, usar o mouse para traçar a fronteira da característica de interesse. </li><li> Preencha a área traçada com atalho &quot;f&quot;. Adicione a seleção clicando no botão com o símbolo de mais, ou o atalho &quot;a&quot;. Se necessário, pressione &quot;u&quot; para desfazer, e &quot;s&quot; para subtrair ou apagar. </li></ol&gt; </li><li> Gerar uma renderização de superfície para visualização e qualitativa básica ou análise quantitativa por software de instruções do guia do usuário. <ol><li> Na guia Objeto Pool, alternar o nome do arquivo-labels.am na janela de Piscina&gt; clique com o botão direito&gt; SurfaceGen. </li><li> Selecione Propriedades superfície desejada&gt; Aplicar. Um novo filename.surf arquivo será criado no exterior. </li><li> Para visualizar o volume segmentado, alternar filename.surf na janela Piscina&gt; clique com o botão direito&gt; SurfaceView. </li><li> Use as ferramentas na janela de 3DViewer para mover, girar e ampliar o volume 3D. </li></ol></li><li> Extraia as densidades exatas e determinar medidas como volume ou a superfície. Exportação para outros programas para visualização mais avançada, análise e simulação. <ol><li> Na janela 3DViewer, clique em ferramenta de Medida&gt; Selecione a opção apropriada (comprimento e ângulo 2D 2D para medições em um único plano 2D, 3D e comprimento Ângulo 3Dpara a medição em um volume 3D). </li><li> Clique na superfície de malha para medir o comprimento desejado, distância e ângulos. Os valores serão listados na janela Propriedades. </li></ol></li></ol> 3. automatizada segmentação baseada na densidade Nota: Os detalhes da metodologia descrita a seguir são específicos para Amira, mas outros pacotes de software pode ser usado em seu lugar. <ol><li> Use essa abordagem em conjuntos de dados com toda a variedade de contraste, nitidez, ou lotação para retirar as densidades de interesse. </li><li> Dados de volume de importação para um programa equipado com thresholding, varinha mágica, ou outras ferramentas baseadas em densidade para segmentação automática. Siga os passos descritos no 2.1-2.1.2 Nas instruções de rastreamento manual. </li><li> Navegue através fatias e selecione a área de segmentação. Se necessário, cortar um menor sub-volume 3D para a segmentação. Siga os passos descritos no 2.2-2.2.2 Nas instruções de rastreamento manual. </li><li> Seleccione a densidade deuma característica de interesse, normalmente, clicando ou a colocação de um marca ou âncora ponto sobre o recurso. Se for permitido no software, insira um intervalo de números abrangendo intensidade de pixel do recurso e ajustar a tolerância como desejado. Densidades pertencentes ao recurso será escolhido de acordo com a intensidade do pixel ou tolerância do valor da âncora. Utilize os seguintes comandos ao usar Amira. <ol><li> Use a ferramenta Magic Wand para recursos com margens distintas. <ol><li> Clique na área de interesse, em seguida, ajustar controles deslizantes na exibição e Masking para capturar correto intervalo de valores para que o recurso é totalmente destacado. Adicionar seleção com atalho &quot;a&quot;. </li></ol></li><li> Use a ferramenta de Threshold para recursos sem margens claramente distinguíveis. </li><li> Selecione o ícone do Threshold. Ajuste deslizante para ajustar a densidade dentro da faixa desejável para que apenas as características de interesse são mascarados. Clique no botão Selecionar, em seguida, adicione seleção com atalho220; uma &quot;. </li><li> Para o volume de todo segmento, selecione todas as fatias antes de acrescentar seleção. </li><li> Para eliminar o ruído, selecione Segmentação&gt; Remover Islands e / ou segmentação&gt; rótulos suaves. </li></ol></li><li> Gerar uma superfície para visualização e análise qualitativa, conforme descrito na seção traçado manual 2.6-2.6.2. Se desejar, a exportação para outros programas para exibição em 3D adequada, análise quantitativa e simulações. </li></ol> 4.-customizado Automated Segmentação Nota: Use essa abordagem para criar scripts personalizados para segmentação automática, que requer experiência anterior em ciência da computação, mas permite que a capacidade de criar um modelo de densidade precisa de um grande volume. <ol><li> Ferramentas (exemplo específico de Segmentação Supervisionada-Shape em MATLAB 27) <ol><li> Imagem de pré-processamento:, remoção de fundo e realce de imagem Execute de-noisingusando o seguinte gasoduto: <ol><li> Carregar a imagem usando o comando imread. <ol><li> Na linha de comando, digite: &gt;&gt; im = imread ($ image_path), onde $ image_path é a localização da imagem a ser analisada. </li></ol></li><li> A partir da caixa de ferramentas de processamento de imagem, chamada de filtro Wiener usando uma proporção estimada ou conhecida Noise-poder-para-sinal (NSR). </li><li> Na imagem processada anteriormente, chame a função de abertura imagem imopen para estimar a camada de fundo, em seguida, atribuir o resultado como uma máscara diferente. <ol><li> Na linha de comando, digite:. &gt;&gt; Background = imopen (im, Strel ($ shape_string, $ size)), neste método, $ shape_string é igual a &#39;disco&#39; a variável $ tamanho é dado pelo analisador ie &gt;&gt; background = imopen (im, Strel (&#39;disco&#39;, 15)). </li></ol></li><li> Subtrair a imagem filtrada com o fundo. <ol><li> Na linha de comando, digite: &gt;&gt; im2 = im -fundo </li></ol></li><li> Consoante a qualidade dos resultados, realizar a normalização da imagem, com ou sem processo adaptativo do Otsu 28, que pode ser chamada usando o imadjust função do Processamento de Imagem de ferramentas. <ol><li> Na linha de comando, digite: &gt;&gt; IM3 = imadjust (im2) </li></ol></li><li> Prepare as características de interesse para a segmentação, o que limita as regiões de interesse cortando a imagem normalizada. <ol><li> Usando o comando imtool, explorar a região de interesse que está a ser cortada e fornecer as coordenadas para o comando: &gt;&gt; im3_crop = imcrop (IM3, [x1 y1 x2 y2]), onde o vetor [x1 y1 x2 y2] corresponde a região quadrado a ser cortada. </li></ol></li></ol></li><li> Forma reconhecimento / classificação forma Supervisionado: treinar o algoritmo, fornecendo exemplos específicos para cada tipo diferente de objetos (traços lineares em uma imagem 2D através das características de interesse). <ol><li> Verifique se VLFEAT 29 API foi instalado com sucesso e visite o site da VLFEAT para documentação mais aprofundada. </li><li> Na linha de comando, digite: &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K, $ NLEAVES) onde $ K é o número de cluster para ser usado ou o número de classes o observador quer organizar os dados em, e US $ NLEAVES é o número desejado de conjuntos da folha, ou seja, &gt;&gt; [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100) </li><li> Use os recursos segmentados manualmente como entrada para VLFeat. NOTA: Esta biblioteca de código aberto baseado em C irá executar patch pixel remendo clustering, e posicionamento do centro do cluster, dependendo do tipo de método escolhido para funcionar melhor para os conjuntos de dados. As opções disponíveis variam a partir de k-agrupamento significativo a base texton aproxima-30, e a saída é uma matriz numérica que descreve as características desejadas de acordo com os exemplos apresentados. </li></ol></li></ol></li><li> Segmentação: Utilize este fully automatizado, embora dispendiosa, abordagem ao segmento de múltiplas classes de objetos simultaneamente, que serão escritos como mapas separados para posterior visualização e análise. <ol><li> Coloque a matriz numeral gerado anteriormente (modelo). </li><li> Chame a função de máquina de vetor de suporte (SVM) em VLFeat, utilizando o modelo ea imagem a ser segmentado como uma entrada. <ol><li> Na linha de comando, entre: &gt;&gt; [w, b] vl_svmtrain = (x, y, 0.1), em que x é o original imagem recortada im2_crop e y é o objectivo da imagem, a imagem que foi segmentado manualmente. Use &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, etiquetas) para colorir os resultados de acordo com os rótulos gerados pelo clustering. NOTA: Com base nas características do modelo, VLFeat classificará a imagem do número de classes (características de interesse) atribuídos desde o início. Dependendo do grau de precisão desejado, é possível combinar este método com outras abordagens ou estimativa clustparâmetros er, tais como centros de casco e de fragmentação. A saída do algoritmo SVM é um modelo probabilístico e várias máscaras binárias das classes pretendidas nos novos conjuntos de dados. </li></ol></li><li> Salve resultados, digitando o comando: &gt;&gt; imwrite (im, $ formato, $ filename) onde $ formato é &#39;tiff&#39; e $ filename é o caminho para o arquivo de saída. </li><li> Para visualizar as imagens, digite o comando: &gt;&gt; imshow (im). </li></ol></li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Estratégias eficazes para a extração de características relevantes de volumes EM 3D são urgentemente necessárias, a fim de manter-se com o tsunami de dados que atingiu recentemente imagem biológica. Embora os dados possam ser gerados em horas ou dias, são necessários muitos meses para analisar os volumes 3D em profundidade. Portanto, é evidente que a análise de imagem tornou-se o gargalo para descobertas científicas; sem soluções adequadas para estes problemas, os cientistas de imagem se tornam vítimas de seu próprio sucesso. Isto é em parte devido à grande complexidade dos dados e também a aglomeração de macromoléculas tipicamente encontrado em células biológicas, que as proteínas e complexos proteicos uma borda outra, e, essencialmente, aparecem como um gradiente contínuo de densidade em escala de cinzentos. O problema é complicado pela preparação de amostras e de imagem imperfeições e, em alguns artefatos de reconstrução da imagem dos casos, levando a menos do que perfeito dados volumétricos que podem representar desafios para abordagem totalmente automatizadaes. O mais significativo, porém, é o fato de que os especialistas em preparação de amostras, tratamento de imagens, ea interpretação biológica raramente são bem versados ​​em ciência da computação, e, portanto, necessitam de orientação sobre como abordar de forma eficaz a extração de características e análise. Por conseguinte, através do uso de vários exemplos, o protocolo explica como preparar dados para segmentação, bem como os passos para a geração Manual abstraída modelo, segmentação automatizada baseada em densidade, marcação manual de características de interesse, e a segmentação automatizado sob medida. As abordagens manuais e automáticos descritos no procedimento pode ser encontrada numa grande variedade de software de segmentação, alguns dos quais são aqui mencionadas, mas outros executam funções semelhantes e são igualmente adequadas. Os resultados demonstram que a eficácia de cada um dos métodos de segmentação 3D varia para cada tipo diferente de conjuntos de dados. Embora as diferentes abordagens s produzidos qualitativamenterenderings 3D imilar como o produto final, a quantidade de tempo e esforço gasto em cada um durante o processo de segmentação variou significativamente. As recomendações para as características da imagem apropriados e objetivos pessoais por abordagem de segmentação são resumidos na Figura 5, o que é explicado nas quatro subseções seguintes. Estes critérios foram aplicados para os seis conjuntos de dados, como mostrado no diagrama de fluxo de decisão da Figura 6. Embora Figuras 5 e 6 são meramente para fornecer uma justificativa para cada conjunto de dados e como cada um dos critérios foram ponderados no processo de tomada de decisão, eles não fornecem uma orientação infalível, mas sim um ponto de partida. Há simplesmente demasiados critérios que influenciam o processo de tomada de decisões: algumas são critérios objectivos, tais como as características do conjunto de dados, enquanto outros são critérios mais subjetivos, como o objetivo desejado. É seguro dizer que os conjuntos de dados que exibem um alto level de contraste com fronteiras nítidas, têm características que são bem separados e relativamente homogênea (não muito diversificada), e são processados ​​com o objetivo de apresentar um modelo de densidade para um grande número de objetos, abordagens automatizadas será superior, se não para o fato de que as abordagens manuais seria simplesmente de recursos (tempo) -prohibitive. Por outro lado, se o contraste é baixo, os dados é confuso e, portanto, requer o conhecimento de um especialista, os objetos estão lotados, e as características mostram uma alta diversidade e são, portanto, heterogêneo, não pode ter qualquer outra escolha a não extração de características manual / segmentação. Manual de Abstracted Modelo de Geração Manual de abstraída traçado modelo é particularmente eficaz na segmentação de elementos lineares, proporcionando pontos sementes (bolas) que podem ser conectados automaticamente (sticks). Essas bolas e paus-modelos pode ser muito poderosa para medir o comprimento de umnd orientação de tal modelo e fornecer um modelo adequadamente captada tanto para inspeção qualitativa e análise quantitativa. Geração do modelo abstraído manual é comumente usado quando minimizando recursos gastos na análise é mais importante do que a fidelidade absoluta para as formas dos dados originais. É o mais bem sucedido com características lineares e homogêneas de interesse (por exemplo, filamentos, tubos). Os dados de contraste, nitidez, e aglomeração não desempenham um papel importante na determinação do sucesso do método, enquanto que o olho humano é capaz de reconhecer o objecto de interesse. Por vezes, tais modelos pode também ser utilizado como um esqueleto para o segmento de mapa em 3D, em uma zona em torno do esqueleto. Embora o modelo é abstrato e não um reflexo de densidades exatas, ele representa uma versão esqueletizada da densidade 3D e, portanto, permite a visualização livre de desordem e análise qualitativa. As medições quantitativas, tais como o comprimento pode também ser determinada a partir do modelo aproximada. Para umaexemplo de software com o manual de geração do modelo abstraído, visite o guia do usuário detalhado do Chimera on-line em <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html</a> . Rastreamento manual de características de interesse Pincel traçado manual funciona bem com quase todas as características de dados, mas também é o mais método consome tempo. Às vezes, é a única técnica para extrair uma característica de interesse a partir de um conjunto de imagens complexo contendo uma grande variedade de recursos, como a membrana celular fina e complicada. Uma ferramenta útil disponível em alguns programas permite a interpolação entre fatias intermitentemente segmentados quando o recurso de interesse muda suavemente. Manual de rastreio pode ser aplicado de forma mais eficiente se os dados é nítido e tem a forma de alto contraste, mas também pode ser utilizadapara conjuntos de dados mais desafiadoras, desde que o usuário está familiarizado com o objeto de interesse. A complexidade de dados pode variar de objetos discretos para conjuntos de dados complexos e lotados, onde os objetos estão intimamente embalados. Neste último caso, a segmentação manual pode ser a única opção, como abordagens automáticas muitas vezes lutam para segmentar o volume desejado e extrair muito ou pouco. Morfologias apresentam difíceis, tais como folhas ou volumes complicadas, também pode ser extraído por meio deste método. No entanto, o usuário deve ter em mente que um conjunto de dados com várias características difíceis só podem ser segmentados se a densidade populacional das características de interesse é baixo, como segmentação de altas densidades populacionais das características de interesse torna-se tempo proibitivo. Para um exemplo de software com traçado manual, visite o guia de usuário detalhado do Amira online em <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guid</a>e.pdf. Segmentação automática à base de Densidade Em contraste com as técnicas manuais, os métodos automatizados são geralmente menos demorado, o que é um fator importante a considerar quando se segmentar uma grande pilha de imagens. No entanto, limite simples pode não ser tão preciso, e muito mais tempo pode ser gasto em requinte e curadoria do volume automaticamente segmentado. Segmentação baseada em densidade automatizado funciona melhor em conjuntos de dados que exibem um grande número de características semelhantes de interesse que todos necessitam de segmentação. Se os dados é mais complexa, essas técnicas automatizadas ainda pode servir como um passo inicial, mas provavelmente vai exigir alguma intervenção manual para baixo da linha, a fim de especificar um subvolume contendo a característica de interesse. Esta estratégia geralmente funciona bem em morfologias lineares ou volumes complicadas, mas raramente é bem sucedida com folhas convolutas finas, comomembranas celulares. Mínima intervenção do usuário com abordagens automatizadas permite a segmentação através de volumes grandes ou pequenos, enquanto gastando poucos recursos do usuário, tais como tempo, em troca de alta fidelidade. Para um exemplo de software com a segmentação baseada em densidade automatizado, visite o guia do usuário detalhado do Amira online em <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf</a> . Sob medida Automated Segmentação Segmentação automatizada sob medida permite a personalização do poder de algoritmos para um conjunto de dados específico, mas muitas vezes é específica para o conjunto de dados ou tipo de dados, adequados para um número limitado de características de recurso, e não pode ser generalizada facilmente. O procedimento apresentado aqui difere das abordagens de segmentação automatizados gerais, tais como a imersão de bacias hidrográficas e outro nível<html> métodos set, que dependem de uma determinação programada de pontos críticos de sementes, seguido de expansão cubo-marchando rapidamente a partir desses pontos de sementes. Uma variação sobre este tema é a segmentação fronteira, onde a informação gradiente informa limites de recursos. Em contraste, o script de personalização utilizado aqui baseia-se na formação de uma fase em que o utilizador manualmente traça alguns exemplos. Através da aprendizagem de máquina, algoritmos específicos irá detectar e, em seguida, aprender a reconhecer de forma independente propriedades e características de dados consistentemente encontrados nos traços. Um usuário experiente pode treinar os algoritmos e melhorar a precisão da segmentação, incluindo mais exemplo rastreia para fornecer um conjunto maior de critérios metragens. No geral, limiarização e abordagens afins, ou mesmo sob medida abordagens podem não ser tão útil para extrair uma única característica de interesse de uma imagem com a diversidade complexa de organelas ou formas, como a curadoria pode ser tão trabalhoso como o rastreamento manual. &quot;&gt; Estratégias para Triagem de dados e escolher uma abordagem de segmentação Tendo em conta os critérios subjetivos e objetivos apresentados na Figura 4 e resumo dos conjuntos de dados adequados na Figura 5, o sistema de tomada de decisão descrito na Figura 6 pode ajudar uma avaliação eficaz das estratégias de extração de características para uma grande variedade de conjuntos de dados. Os conjuntos de dados é feita uma triagem em quatro decisões consecutivas, cada uma das quais pode incluir qualquer um dos quatro respectivos objectivos, bem como as quatro critérios subjectivos introduzidas na Figura 4. Como um exemplo, a Figura 6 é o racional para a triagem de cada um dos seis dados conjuntos mostrado na Figura 3. Sem dúvida, para cada conjunto de dados, não há um único caminho único, mas sim caminhos diferentes através dessa matriz seguintes critérios diferentes para a tomada de decisão que pode levar to o mesmo ou diferente recomendação para segmentação de dados. Enquanto cada conjunto de dados terá seu próprio conjunto de propriedades que não podem ser previstos, seis exemplos são dados, cada par com uma explicação sobre a lógica por trás o recurso preferido abordagem de extração / segmentação. Mais ainda incluir uma proposta para uma rota alternativa decisão que tanto os resultados da utilização da mesma ou de uma diferente abordagem de segmentação (Figura 6). O cinocílio é um conjunto com limites claramente definidos, o que torna as abordagens automatizadas mais probabilidade de êxito dados nítidos. Todas as características de interesse são bem separados, novamente favorecendo uma abordagem automatizada. Além disso, as características de interesse são semelhantes uns aos outros, tornando-se um conjunto de dados relativamente homogénea ideal para segmentação sob medida. Por fim, o objetivo era extrair todo o recurso, favorecendo uma abordagem semi-automática. Em consequência, concluiu-se que um limiar automatizado (linha verde sólido), bem como um (por exemplo, a forma de segmentação supervisionada) abordagem de design personalizado (linha verde pontilhada) são ambos propensos a fazer bem a este conjunto de dados. Critérios similares, embora colocado em uma ordem diferente da rede tomada de decisão, são aplicáveis ​​para o caso de bactérias. Uma abordagem sob medida é recomendada, em parte, porque este conjunto de dados era muito grande; portanto, recursos limitados proibir um manual abordagem intervenção / segmentação de trabalho intensivo. Enquanto limiar teria rendido resultados aceitáveis, a abordagem de design personalizado foi capaz de executar principal objectivo do estudo para separar as formas bacterianas arredondadas dos depósitos de metais extracelulares, localizados quer no meio da bactéria ou ao lado das bactérias, e, portanto, o abordagem sob medida foi preferido. Para conjuntos de dados estereocílios, a primeira consideração foi o objetivo desejado: o objetivo pode ser o de mostrar toda a densidadeou para criar modelos geométricos. O volume de juros era uma área movimentada, eo objetivo era segmento um grande número de objetos como objetos separados, a fim de executar posteriormente análise volumétrica quantitativa, incluindo comprimentos, números, distâncias, orientação, etc Era útil que os objetos de interesse foram principalmente lineares, e este feito geométrica modelo traçando o método de escolha. No entanto, se em vez disso o objetivo foi mostrar toda a densidade, a morfologia característica linear, bem como relativamente alto contraste com fronteiras bem definidas faria um protocolo de limiar automático viável. As membranas celulares e casos de dados mitocôndrias são um desafio para abordagens automatizadas devido às suas categorias de morfologia característica: folhas complicado e volumes, respectivamente. O objetivo é traçar o contorno de célula ou mitocôndrias com precisão, mas há recursos finitos só para fazê-lo. Além disso, as características de, interest são complexos e não podem ser facilmente detectadas ou moldar-codificado automaticamente, embora para a mitocôndria dados define a abordagem de script personalizado feita para as bactérias podem, eventualmente, ser aplicada com uma personalização. Felizmente, a membrana e as mitocôndrias si só representam uma pequena fracção do volume total e, portanto, o rastreio manual é uma abordagem simples ainda que demorado. Rastreamento manual também é o método de escolha para esses conjuntos de dados quando o contraste é bastante baixo e as fronteiras são bastante confuso. Como resultado, mesmo que constituem uma parte significativa dos conjuntos de dados, tais folhas convolutas deve ser traçada manualmente, simplesmente devido à falta de uma alternativa melhor. O conjunto de dados de plantas posou seus próprios desafios, pois o objetivo era segmento todos os objetos, que são densamente espaçados e compõem um cenário lotado. Exibindo a densidade como está permitirá medições sobre a forma ea organização dos objetos, mas because segmentar manualmente cada objeto filamentosa é muito caro, limiarização automática foi utilizada em seu lugar. Os vários passos e os resultados correspondentes a criação de um modelo 3D foram indicados aqui, mas mais importante ainda, as características dos dados pessoais e os critérios que se verificou ser importante na determinação do melhor caminho de segmentação também foram elucidados. As características importantes dos dados de imagem incluem-se o que é descrito aqui como o contraste, aglomeração, friabilidade, e o número de diferentes formas ou características (por exemplo, organelos, filamentos, membranas). Critérios subjetivos a serem considerados incluem o objetivo desejado de segmentação (medição / contagem, representação skeletonized dos dados / exibindo volumes em renderings 3D), as características morfológicas da característica de interesse (linear, alongado, em rede, complexa, complicada), a densidade de características de interesse em relação a todo o volume (a fração dos objetos que sãoimportante e precisa ser extraído), e equilibrar as vantagens e desvantagens de gastar recursos a fidelidade da segmentação dos dados originais eo retorno sobre o investimento a diminuir, resultando em melhorias incrementais para substancialmente maior alocação de recursos. O campo de segmentação de imagem amadureceu significativamente ao longo dos últimos anos, ainda não há nenhuma bala de prata, nenhum algoritmo ou programa que pode fazer tudo. Tamanhos conjunto de dados tem crescido de centenas de megabytes para rotineiramente dezenas de gigabytes, e agora eles estão começando a exceder terabytes, tornando segmentação manual quase impossível. Assim, mais recursos precisam ser investidos nas abordagens de extração de características inteligentes e tempo efetivo que imitam o processo de tomada de decisão humana. Terá Tais esforços para ser combinado com (1) sistema de informação geográfica (SIG) à base de bases de dados hierárquicas semânticas (semelhante ao Google Earth), (2) técnicas de captação de dados (ou seja, a transiçãoa partir de um voxel a representação geométrica / volumétrica) compatível com desenho assistido por computador (CAD) software, a fim de reduzir significativamente a quantidade de dados e permitindo assim a visualização de volumes maiores de 35, (3) técnicas de simulação, como eles são usados ​​com freqüência na disciplinas de engenharia, bem como (4) animação avançado e criação de filmes capacidades, incluindo animações mosca-through (semelhante ao que é desenvolvido para a indústria de jogos). Claramente, a extração de características eficiente e segmentação está no cerne desta vinda revolução em imagens de alta resolução celular, e ao mesmo tempo será sempre necessária melhores abordagens, os princípios aqui apresentados, bem como os exemplos do que abordagem foi feita para diferentes tipos de dados , irá fornecer algumas informações valiosas para a tomada de uma decisão sobre qual abordagem a adoptar.

Tradicionalmente, a microscopia eletrônica de campo (EM) foi dividido em 1) o ramo da biologia estrutural usando TEM alta e super-alta resolução, geralmente combinados com dados implícitos ou explícitos média para investigar a) estrutura tridimensional (3D de complexos macromoleculares com uma composição definida e normalmente um tamanho relativamente pequeno 1-4, e 2) o ramo imagem celular em cenários celulares inteiras que são visualizados 1,5,6. Enquanto o ramo da biologia estrutural sofreu um desenvolvimento espetacular nos últimos quatro décadas, o ramo da biologia celular foi praticamente restrito a duas dimensões, muitas vezes, em amostras de menos-que-otimamente preservada. Somente com o advento da tomografia de elétrons na última década tem célula de imagem ultra-biológica expandiu-se para a terceira dimensão 5,7, onde normalmente a média não pode ser realizada como os cenários celulares e, assim, as características de interesse, são tipicamente único. Embora as cenas visualizadas celulares são muitas vezes deslumbrante para os olhos, a extração eficiente dos recursos de interesse e análise quantitativa posterior de tais volumes celulares altamente complexos ficam atrás, em parte porque a composição de proteína precisa é geralmente desconhecida, portanto, tornando-se um desafio para interpretar estes celular volumes 3D. Para esta data, uma vasta experiência biológica é muitas vezes necessária para interpretar tomograms complexas, ou mesmo para identificar as regiões importantes e componentes essenciais no volume 3D. Como uma complicação adicional, visualização de volumes 3D é notavelmente não-trivial. Volumes 3D pode ser pensado e assim exibir como pilhas de imagens 2D. Inspecção fatia-a-fatia de imagens 2D sequenciais reduz a complexidade, mas também possuem limites de extracção e análise quantitativa, assim, para as duas dimensões. No entanto, para a maioria dos objetos 3D, a representação de volumes 3D apenas como uma pilha de planos consecutivos leva a uma incompleta umad perspectiva enviesada em 3D a natureza de um sistema particular. Modos alternativos de inspeção visual, necessitem de renderização de volume ou prestação superfície, o que, dada a natureza muitas vezes densa de um celular volume-pode facilmente levar a uma visão obstruída de objetos aninhados ou sobrecarregar um usuário por completo, tornando assim segmentação manual interativo difícil. Para suprir estas barreiras, uma grande variedade de extração de características automatizado (segmentação) abordagens têm sido desenvolvidos que são tipicamente quer Densidad ou 8-10 baseado em gradiente. No entanto, estes métodos tendem a segmentar todo o volume independentemente de quais áreas ou recursos são de interesse para o especialista, apesar de alguns métodos recentes pode direcionar uma característica específica de interesse, como os filamentos de actina 11. Além disso, os programas de execução segmentação automatizada pode, por vezes, resultar na produção de um grande número de sub-volumes (por exemplo, quando se aplica immersio bacias hidrográficasn segmentação), que muitas vezes precisam ser fundidas manualmente de volta para compreendendo toda a característica de interesse ou ser submetido a uma nova segmentação. Isso vale particularmente para conjuntos de dados complexos e cheios de gente, assim algoritmos de computador mais de renderização são incapazes de extrair apenas as características de interesse com fidelidade, e esforços substanciais de curadoria por um especialista muitas vezes são necessários para produzir um volume segmentado desejado. Além disso, soluções personalizadas para um problema muito específico muitas vezes são publicados como um documento de reunião científica, com pouca ou nenhuma ênfase em fazer-lhes ampla e ferramentas abrangentes acessível a pesquisadores que não têm conhecimento íntimo dos campos da matemática, ciência da computação e / ou computação gráfica. Um ambiente de software de programação personalizada, contendo uma série de bibliotecas de análise de imagem, pode ser um poderoso conjunto de ferramentas que permite aos usuários escrever de forma eficiente os seus próprios módulos de segmentação precisa. No entanto, esta abordagem requer extformação ensive e um fundo em ciência da computação, a fim de tirar proveito de suas muitas características ou capacidades para análise de imagem. Pode-se trabalhar dentro de um ambiente tão versátil software para determinados conjuntos de dados, onde os recursos são mais escassos, por exemplo, através da utilização de poderosas abordagens baseadas na forma que se baseiam na geometria original de &quot;modelos&quot; para separar os objetos de interesse de seus arredores 12,13 . Uma variedade razoável de pacotes de visualização de gráficos de computador existem para segmentação manual interativo e modelo de construção. Alguns pacotes estão disponíveis comercialmente, enquanto outros são de origem acadêmica e distribuídos gratuitamente, tais como: University of California San Francisco Chimera 14, University of Colorado Imod 15, e da Universidade do Texas, Austin VolumeRover 16. No entanto, a grande variedade e complexidade de recursos e capacidades desses programas possuem steepens a curva de aprendizado each. Certos programas de visualização fornecem modelos geométricas simples, tais como esferas e varas de vários tamanhos, os quais podem ser colocados em mapas de densidade, a fim de criar um modelo simplificado do volume 3D complexo. Estes modelos, em seguida, permitir que as medições geométricas e volumétricas simples e, portanto, ir além de apenas a &quot;imagem bonita&quot;. Tal método manual de objectos funciona bem para os volumes, onde apenas um pequeno número dos objectos necessitam de ser identificados e extraída. No entanto, o recente desenvolvimento de grandes volumes de imagens ultra 3D usando microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) 17-20 ou microscopia eletrônica de varredura face do bloco de série (SBF-SEM) 21 apresenta a complicação adicional de que o tamanho dos dados 3D conjuntos podem variar de gigabytes a dezenas e centenas de gigabytes e até mesmo os terabytes. Portanto, tais grandes volumes 3D são praticamente inacessíveis para extração de características manual e, portanto, eficiente façanha semi-automatizado guiado pelo usuárioextração ure será um dos gargalos para a análise eficiente dos volumes 3D em um futuro previsível. Apresentamos aqui quatro abordagens de segmentação diferentes que são rotineiramente usados ​​em uma grande variedade de tipos de imagem biológicos. Estes métodos são então comparados para a sua eficácia para diferentes tipos de conjuntos de dados, permitindo uma compilação em um guia para ajudar os biólogos decidir o que pode ser a melhor abordagem de segmentação para extração de características eficaz de seus próprios dados. Como manuais do usuário detalhados estão disponíveis para a maioria dos programas descritos, o objetivo não é fazer os usuários potenciais familiarizado com qualquer um destes pacotes particulares. Em vez disso, o objetivo é demonstrar os pontos fortes e limitações dessas estratégias de segmentação diferentes, aplicando-os a seis exemplo conjuntos de dados com características diversas. Através desta comparação, um conjunto de critérios que têm sido desenvolvidos baseiam-se em qualquer das características da imagem objectivas doConjuntos de dados em 3D, como o contraste de dados, crocância, lotação, e complexidade, ou tronco a partir de considerações subjetivas, como o objetivo desejado para segmentação, morfologias dos recursos a serem segmentados, a densidade populacional das características de interesse, ou seja, a fração de o volume ocupado pela característica de interesse, e como se procede de forma ideal com recursos finitos, como tempo e disponibilidade de pessoal. Estes exemplos de diferentes conjuntos de dados de ilustrar a forma como estes critérios objectivos e subjectivos podem ser aplicados sequencialmente em uma variedade de combinações, para se obter um emparelhamento de certas abordagens de extracção de característica com certos tipos de conjuntos de dados. As recomendações dadas, esperamos ajudar os novatos diante de uma grande variedade de opções de segmentação de escolher a abordagem de segmentação mais eficaz para o seu próprio volume 3D. Embora o foco deste trabalho é a extração de características, a atenção para a coleta de dados e os dados de pré-processamento é crucial para s eficientesegmentation. Muitas vezes, a coloração das amostras pode ser irregular, e portanto, potenciais artefactos de coloração deve ser considerado no processo de segmentação. No entanto, a mancha geralmente dá maior relação sinal-ruído e, portanto, requer menos de filtragem e outros tratamentos matemático de volumes celulares, o que poderia também resultar em artefatos. Os respectivos conjuntos de dados de imagem em bruto precisa ser adquirida com as configurações de contraste e pixel câmera correta, alinhado e reconstruído em um volume 3D. Para tomografias, imagens alinhadas são reconstruídos normalmente utilizando ponderada volta-projecção, e, em seguida, o conjunto de dados é geralmente submetida a algoritmos denoising tais como a difusão não-linear 22 anisotrópica, filtragem bilateral 23, ou mediano recursiva filtragem 24. Dados de imagem FIB-SEM-SBF e SEM são alinhados por cortes transversais consecutivos correlacionando-em programas que utilizam XY como ImageJ 25. Aumento de contraste e de filtragem pode ser aplicado para aumentar as características deinteresse e, portanto, a de-ruído a pilha de imagens. A filtragem pode ser realizada quer em todo o volume antes de subvolume selecção ou nas subvolumes seleccionados, como abordagens de filtragem pode ser dispendiosa. A sub-amostragem dos dados (criação de faixas), que às vezes é usado para redução de ruído e / ou redução de tamanho de arquivo, só é recomendado se os dados tiverem sido oversampled significativamente em comparação com a resolução antecipada. Após redução de ruído, as imagens processadas podem ser segmentados por vários métodos, eo foco neste estudo é sobre os quatro seguintes: (1) geração do modelo abstraído o manual através da criação de um modelo de bola-e-vara, (2) traçado manual de características de interesse, (3) densidade à base de limiar automático, e (4) segmentação automatizada sob medida por meio de um roteiro para a segmentação de projeto específico. Segmentação limite de 8 e segmentação watershed imersiva 10 são melhores alternativas para limite simples, mas they pertencem à mesma categoria e não foram incluídas explicitamente nesta discussão. Rastreamento manual de densidades requer delineando as características de interesse, corte-a-slice, que permite a manutenção da densidade original das respectivas áreas sub-celular. Esta abordagem permite o máximo controle do processo de segmentação, mas é um processo demorado e trabalhoso. Abordagens de segmentação densidade (e afins) com base em limiares automáticos são semi-automática, onde um algoritmo escolhe pixels com base em um conjunto de parâmetros definidos pelo usuário. Vários acadêmicos (grátis) pacotes de visualização, tais como UCSF Chimera, Imod, Fiji 26, e VolumeRover estão disponíveis, bem como comercial (exigindo licenças pagas) pacotes, e ambos os tipos normalmente incluem um ou mais dessas abordagens de segmentação. Os pacotes de software utilizados neste trabalho para ilustrar esses diferentes métodos incluem ambos os programas comerciais e acadêmicas s abertasource programas para gerar manualmente um modelo abstrato, bem como a segmentação densidade manuais e automatizados. No entanto, o software de fonte aberta pode, por vezes, oferecer opções mais avançadas, através da possibilidade de personalização. Uma comparação destas técnicas que utilizam diferentes tipos de conjuntos de dados levou à seguinte apresentação de regras e orientações sobre como abordar a segmentação de diversos volumes de dados biológicos 3D, que a nosso conhecimento ainda não foi publicada. Assim, esta é a primeira comparação sistemática das diferentes abordagens e sua utilidade em conjuntos de dados com diferentes características para usuários com diferentes objetivos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

Abordagens de microscopia eletrônica 3D modernos têm permitido recentemente visão sem precedentes sobre a organização 3D ultraestrutural de células e tecidos, permitindo a visualização de grandes máquinas macromoleculares, tais como complexos de adesão, bem como estruturas de ordem superior, como o citoesqueleto e organelas celulares em sua respectivo contexto celular e tecidual. Dada a complexidade inerente de volumes de células, é essencial para o primeiro extrair as características de interesse, a fim de permitir a visualização, a quantificação, e, por conseguinte, a compreensão da sua organização em 3D. Cada conjunto de dados é definida pelas características distintas, por exemplo, na relação de sinal-para-ruído, friabilidade (nitidez) dos dados, a heterogeneidade das suas características, lotação de características, a presença ou ausência de formas características que permitem a identificação fácil e a percentagem de todo o volume de que uma determinada região de interesse ocupa. Todas estas características devem ser consideradosno momento de decidir qual abordagem a tomar para a segmentação. Os seis conjuntos de dados ultra 3D diferentes, apresentados foram obtidos por três imagens diferentes abordagens: resina incorporado tomografia elétron manchado, focada íon de feixe por intermédio e bloco de série microscopia eletrônica de varredura rosto- (FIB-SEM, SBF-SEM) das amostras levemente coradas e fortemente coradas , respectivamente. Para esses conjuntos de dados, quatro abordagens de segmentação diferentes foram aplicados: (1) construção de modelos totalmente manual seguido apenas por visualização do modelo, (2) segmentação traçado manual dos dados, seguido por prestação de superfície, (3) abordagens semi-automáticas seguido por prestação de superfície, ou algoritmos de segmentação de design personalizado (4) automatizados seguidos de renderização de superfície e análise quantitativa. Dependendo da combinação das características do conjunto de dados, verificou-se que tipicamente, um destes quatro métodos categóricos supera os outros, mas, dependendo da sequência exacta de critérios, more de uma abordagem pode ser bem sucedido. Com base nesses dados, propomos um esquema de triagem que classifica as duas características do conjunto de dados e critérios objetivos pessoais subjetivos para a análise dos diferentes conjuntos de dados.

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From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

O gargalo para microscopia eletrônica 3D celular é a extração de características (segmentação) em alta complexidade mapas de densidade 3D. Temos desenvolvido um conjunto de critérios, que fornece orientação sobre qual abordagem de segmentação (manual, semi-automática ou automática) é o mais adequado para os diferentes tipos de dados, proporcionando, assim, um ponto de partida para a segmentação eficaz.

De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K visualizações.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  O gargalo para microscopia eletrônica 3D celular é a extração de características (segmentação) em alta complexidade mapas de densidade 3D. Temos desenvolvido um conjunto de critérios, que fornece orientação sobre qual abordagem de segmentação (manual, semi-automática ou automática) é o mais adequado para os diferentes tipos de dados, proporcionando, assim, um ponto de partida para a segmentação eficaz. 

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Light Fabricação Stage Microscopia de Luz Correlacionados / Microscopia Eletrônica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativa luz e de Microscopia Eletrônica Usando Quantum Dot Nanopartículas

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Um guia para construir um altamente inclinado varreu o microscópio de telha para a imagem latente de único-molécula campo de visão alargado

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...