Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Todos os cuidados com os animais e experimentos foram feitos em conformidade com um protocolo aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso da Universidade Duke. Cocem3D resultou de uma combinação dos protocolos previamente publicados 10,11 e foi aplicado aqui a estudar numa célula enteroendï¿½rina específica utilizando um repórter rato PyyGFP 12. Este método pode ser facilmente aplicada a outras células de interesse utilizando ratinhos transgénicos repórter disponíveis comercialmente. O método é descrito em três seções: microscopia confocal Correlative, bloco-face de microscopia eletrônica de varredura de série (SBEM), e dados de renderização em 3D. Correlativo microscopia confocal O objetivo desta seção é para colher um segmento de tecido do cólon distal de dimensões que permitem confocal correlativa e SBEM imagem. O protocolo é como se segue: 1. Colheita de Tecidos <ol><li> Preparar10 ml de solução / ml de heparina de 50 ug em PBS. </li><li> Prepare estoque anestésico xilazina / cetamina misturando 10 ml de cetamina (100 mg / ml) e 1 ml de xilazina (20 mg / mL). <ol><li> Diluir xilazina / cetamina estoque 1: 4 em 0,1 M PBS. </li></ol></li><li> Prepare de 100 ml de solução fixadora contendo 4% de paraformaldeído e 0,1% de glutaraldeído em PBS. </li><li> Anestesiar um rato PyyGFP, 6 a 10 semanas de idade, com uma dose letal de xilazina / cetamina anestésico. Injetar o anestésico por via intraperitoneal a 0,15 ml por 20 g de peso mouse. </li><li> Confirme anestesia adequada rato por beliscar a cauda ou dos pés, e usar pomada nos olhos para evitar o ressecamento. </li><li> Use um fluxo de bomba peristáltica variável para perfundir fixador intracardial 10. Usando uma tesoura cirúrgica (13 cm de comprimento) corte abrir a cavidade abdominal para expor os intestinos, coração e pulmões. Coração com fórceps estreito-padrão de curvas (comprimento 12 cm) segurar e inserir a agulha butterfly (19 g) de bomba peristáltica into do ventrículo esquerdo. Imediatamente, corte átrio direito com mola tesoura reta (comprimento 4 mm). Perfundir a uma taxa de 2 ml / min primeiro com solução de heparina durante 1 min, e, em seguida, com solução fixadora arrefecido com gelo durante 15 minutos até a cauda do ratinho é completamente rígida. Nota: É muito importante para perfundir a uma velocidade lenta para evitar a rotura dos pequenos vasos na mucosa intestinal. Estourando de navios irá comprometer a ultra-estrutura do tecido. Se a perfusão for adequada, o fígado deve girar de cor pálida dentro de 3-5 min. </li><li> Com uma tesoura pequena abrir a cavidade abdominal e excisar todo o cólon a partir da junção com o ceco até ao recto distal. Colocar o tecido em PBS gelado. Enquanto submerso em PBS, cortado com uma tesoura pequena mola do cólon ao longo do mesentério. </li></ol> 2. Fixação de dissecação e segmentos de tecido <ol><li> Utilizando um bisturi, cortar cerca de 6 segmentos de tecido pequenos (2 mm 2) a partir do cólon distai. Faça isso em uma folha ocera dentária f e submerso em algumas gotas de PBS. </li><li> Pós-fixar os segmentos de tecido em solução fixadora durante 3 horas a 4 ° C. </li></ol> 3. Blocos dissecando-tissue micro <ol><li> Prepare 5% de agarose de baixo ponto de fusão em PBS e mantê-lo em um banho de água a 45 ° C. </li><li> Incorporar os segmentos de tecido em 5% de baixo ponto de fusão agarose utilizando um pequeno recipiente de plástico, como o tamanho padrão Tissue-Tek Cryomold. </li><li> Montar as seções embutidas em uma lâmina micrótomo vibrando e encher a bandeja de tampão com PBS gelado. </li><li> Corte 300 mm tiras de tecido em 0.8 amplitude e 0,04 mm Velocidade / seg. Nota: Neste ponto, as tiras de tecido serão desalojados da agarose. </li><li> Re-incorpore tiras de tecido 300 uM em agarose e montá-los em micrótomo perpendicularmente à lâmina do vibratome. </li><li> Usando um vibratome, cortar tiras de tecido com uma espessura de 50 um. Nota: Os blocos de tecido finais devem ser de cerca de 300 m de largura x 50 mm de espessura. Estes dimensions são optimizadas a partir de experiências piloto confocal que mostraram que a espessura da célula enteroendï¿½rina é entre 15-20 um e o comprimento de neuropod 30-70 nm. Portanto, uma célula inteira pode ser contido dentro de um bloco de tecido 300 um de largura por 50 mm de espessura se a orientação da célula é paralela à face do bloco de tecido. Estas dimensões variam, dependendo do tipo de células e tecidos de interesse. </li><li> Armazenar os blocos de tecido em PBS a 4 ° C. </li></ol> 4. Imagem Confocal <ol><li> Prepara-se uma solução de corante nuclear DAPI por diluição em PBS a 1: 4000. </li><li> Incubar blocos de tecidos em corante nuclear DAPI, durante 5 min. Nota: coloração DAPI facilita células individuais de distinção pelos seus núcleos, o que é útil para correlacionar as imagens confocal e SBEM. </li><li> Blocos de tecido montar em cobrados lâmina de vidro, adicione algumas gotas de PBS, e cobri-los com uma lamela. </li><li> Usando um microscópio confocal, identificar blocos com vilosidades intacto e as células PyyGFP de interesse e fotografada-los para obter z-stacks secções ópticas. <ol><li> Use um Zeiss Plano Apochromat objetivo 20X / 0.8 para obter z-pilhas de 1 mícron secções ópticas. </li><li> Para o z-pilha, usar os canais para 405 nm (DAPI) para determinar a relação a outras células, 488 nm GFP endógeno para localizar a célula de interesse, e contraste de interferência diferencial (DIC) para determinar a localização da célula em relação ao lúmen. </li><li> Use resolução de imagem de 1024 pixels ou superior. </li></ol></li></ol> 5. Incorporação de Blocks em Agarose <ol><li> Preparar 10 ml de fixador contendo 4% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído em PBS. </li><li> Remover os blocos de tecido de a lâmina de vidro por adição cuidadosa de PBS nas bordas da tampa de deslizamento para deslizar a lamela de distância da lâmina de vidro, sem danificar o bloco de tecido. Em seguida, use um pincel fino arte para transferir o bloco de tecido a partir do slide para um 10,5 ml de tubo de microcentrífuga contendo 4% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído fixador. </li><li> Blocos de tecido pós-fix O / N a 4 ° C. </li><li> Transferir os blocos de tecido de PBS. Em seguida, inserir blocos de apartamento em 5% baixo ponto de fusão agarose por intercalando-os entre duas lâminas de vidro. Nota: Incorporação os blocos em uma fina camada de agarose facilita a manipulação posterior durante a coloração. </li><li> Corte a agarose em uma praça e fazer um entalhe no lado superior. Nota: Este passo é necessário para manter a orientação em passos subsequentes. </li><li> Armazenar em blocos de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com PBS a 4 ° C até posterior processamento. </li></ol> Serial Block-cara Microscopia Eletrônica de Varredura (SBEM) Nesta seção, o bloco de tecido é preparado e fotografada com SBEM em baixa ampliação. A imagem levantamento da face do bloco é então correlacionado com os dados confocal para identificar a região contendo a célula de interesse. Uma vez que a regiãoé identificado, o tecido é fotografada em uma resolução de 7 nm / pixel e fatias de 70 nm. Isso foi suficiente para resolver e distinguir vesículas secretoras centrais grandes densa de outras organelas. Em células enteroendócrinas, este tipo de vesículas varia entre 100 e 150 nm de diâmetro 13. O protocolo é como se segue: 6. As secções de tecido de coloração <ol><li> Remover o tecido de PBS e lavar três vezes, 5 min cada, em tampão cacodilato 0,1 M. </li><li> Blocos Mancha para ácido tânico 1 hora em 0,1% dissolvido em tampão cacodilato 0,1 M para aumentar o contraste das membranas celulares 14. </li><li> Levar a cabo a coloração e a desidratação do tecido subsequente de acordo com o protocolo publicado a 11. Seguindo Deerinck et ai. protocolo, preparar as seguintes soluções: 1) 1% (w / v) thiocarbonhydrazide (THC); 2) levar solução de aspartato; 3) acetato de uranilo a 1%, e 4) de ferrocianeto de ósmio tetraoxyde / potássio (OsO4 / K Ferrocianeto). Misturar 4% OsO4 e 2xFerrocianeto de estoque K [K Ferrocianeto de 0,3 g e 0,86 g de Na em cacodilato de 10 mL de H2O] em proporção 1: 1 para fazer OsO4 / K Ferrocianeto. Nota: Tendo o tecido embebido em agarose facilita o manuseamento durante a coloração. Remova cuidadosamente agarose para posterior infiltração de resina. </li><li> Lavar as amostras três vezes, 5 min cada, em tampão de cacodilato 0,1 M e em seguida são coradas com solução de OsO4 / K Ferrocianeto durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Enxágüe em água ultra pura três vezes, 5 min cada, e mancha com TCH durante 30 minutos a 60 ° C. </li><li> Lavar em água ultra-pura, três vezes, 5 minutos cada e mancha com 2% de OsO4 (sem K Ferrocianeto) durante 60 min à TA. Enxágüe novamente em água ultra-pura três vezes, 5 min cada. </li><li> Mancha com acetato de uranilo 1% O / N a 4 ° C. Enxágüe em água ultra-pura três vezes, 5 min cada. </li><li> Mancha com aspartato chumbo durante 30 min a 60 ° C. Enxágüe em água ultra-pura três vezes, 5 min cada. </li><li> Desidratar tecidos por lavagem em solutions com concentrações crescentes de etanol. Lavar 2 vezes, 5 minutos cada, com 50%, 75%, 85%, 95%, e etanol absoluto 100%. No final, lavar com secções de óxido de propileno duas vezes, 10 min cada. </li></ol> 7. infiltrando e incorporação de cortes de tecido em Resina <ol><li> Infiltrar os blocos com resina utilizando o kit comercialmente disponíveis atualmente. Incorporar tecidos em resina usando um kit epon incorporação. Prepara-se uma mistura de resina de epóxi de 48%, 20% DDSA ml, 30% NMA ml, e 2% DMP30. Agita-se mistura resina-se vigorosamente durante 5 min e, em seguida, colocar mistura em vácuo durante 30 min para permitir que as bolhas de vir à superfície. </li><li> Misture resina com óxido de propileno a proporção 1: 1 e agitar vigorosamente. Remover o enxaguamento final, a desidratação a partir de tecidos, e adicionar resina misturada com óxido de propileno. Coloque o frasco com amostras em um rotador O / N e deixar frasco destapado. No dia seguinte, adicione resina epon feitos na hora e misture por 90 min em rotador. </li><li> Incorporar em blocos de resina mais plano possível por imprensando-los ementre lâminas de vidro que foram curados com agente de libertação de líquido para evitar que grudem uns aos outros 15. </li><li> Uma vez que os blocos são incorporados plana, curar os blocos para uma adição de 48 h a 60 ° C. </li><li> Puxe lâminas além de liberar os blocos. </li></ol> 8. Montagem e aparar o bloco de tecido for Imaging <ol><li> De acordo com um escopo de dissecação, corresponder à orientação dos blocos de tecido embebidos em resina com o das micrografias confocal para facilitar a identificação de regiões que contêm as células de interesse antes de cortar o bloco. </li><li> Apare o bloco de resina incorporado manualmente para baixo para um bloco mm-face ~ 500 x 500. </li><li> Montar o bloco plano sobre um pino contendo epóxi condutora e seco durante 30 min. Em seguida, coloque o bloco sobre uma superfície plana e seca O / N a 60 ° C. </li><li> Brasão do bloco com líquido prata coloidal. Manter a cortes de tecido plano para garantir o corte do bloco em um ângulo direito para facilitar a correlating os seriais de bloco-face e confocal micrografias. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Imagem do bloco usando um Microscópio Eletrônico de Varredura equipado com um sistema SBEM (por ex., 3Ver). </li><li> Definir secção espessura inicial no ~ 2 uM incrementos e corte até que a face do tecido emerge do bloco. </li><li> Adquirir uma imagem Surver de toda a face do bloco. </li><li> Usando o software de Fiji, fazer medições, tanto do bloco-face e confocal de série micrografias para gerar um denominador comum e conta para amostra deformação durante a fixação e coloração 16. </li><li> Localizar a área de interesse sobre a face do bloco através da multiplicação do denominador para as coordenadas nas imagens confocais. Use também outras características estruturais, tais como a posição das microvilosidades, células caliciformes, ou lâmina própria, como uma referência. </li><li> Região da imagem de juros a uma 2.25 kV e 7 nm / pixel (ou ampliação 15,147X) no modo de alto vácuo. Incrementos fatia deve ser definidoa 70 nm ou menos. </li><li> Coletar dados SBEM em formato .dm3 16-bit cru. </li></ol> 10. Otimização SBEM Imagens para a superfície Segmentação <ol><li> Converter imagens de formato SBEM .dm3 bruto para 8-bit .tiff. </li><li> Filtro .tiff imagens usando um filtro de 0,8 Gaussian Blur em Fiji. </li><li> Reduza o conjunto de dados a 25% do tamanho original e salvá-la como uma pilha .tiff para minimizar a quantidade de memória necessária para lidar com o conjunto de RAM. </li><li> Alinhe a pilha de imagens SBEM usando o plug-in Fiji &quot;alinhamento pilha linear com SIFT&quot; em modo de tradução e cortada usando o plugin &quot;cultura 3D&quot;. Nota: O corte ajuda a reduzir ainda mais a quantidade de memória RAM necessária para segmentar e renderização de volume. </li></ol> Renderização de dados em 3D 11. Microscopia Confocal <ol><li> Reconstruir z-stacks usando o modo da ferramenta &quot;superfícies&quot; a superar automática. Figura 1D, mostra uma reconstrução de cada canal usando a opção suave em, o detalhe área superfícies em 0,126 mm, e de limiares de intensidade absoluta. </li></ol> 12. Serial SEM Bloco-face Nota: segmentação de dados manual é um processo muito demorado e, dependendo dos recursos a serem prestados, o procedimento pode levar várias semanas. Segmentação para os vídeos e números apresentados em Bohórquez et al 2014 8. Era feito manualmente e levou cerca de 500 horas de trabalho. Recomenda-se a priorizar as características essenciais que necessitam de renderização antes de iniciar o processo de segmentação. O procedimento é o seguinte: <ol><li> Use a ferramenta &quot;superfícies&quot; no modo de tração ea opção &quot;contorno&quot; no modo de 50 ms chegando ao segmento manualmente eo volume rendeu a célula de interesse. </li><li> Traçar contornos em cada fatia da célula para renderização mais suave ou a cada 5 fatias para processamento mais rápido. </li><li> Exportação im definitivaas idades usando a função &quot;snapshot&quot; com uma resolução de 300 dpi ou mais. </li></ol>

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Dr. Satish Medicetty é um empregado de e recebe 100% do salário Renovo Neural Inc; no entanto, isso não altera a adesão do autor de políticas JoVE sobre a partilha de dados e materiais. Não há conflito de interesse é declarada para autores restantes.

<html> Chemosensation gastrointestinal está a emergir como um novo campo emocionante na pesquisa biomédica. Isto é, em grande parte devido à descoberta de receptores gustativos funcionais em células enteroendócrinas 18. Estudos subsequentes têm mostrado que as células enteroendócrinas expressam receptores específicos para nutrientes, incluindo hidratos de carbono, lípidos, aminoácidos e 5,6,19,20. O factor catalítica para estas descobertas tem sido o desenvolvimento de ratinhos repórter, em que as células são enteroendócrinas marcado por fluorescência 20. Desenvolvemos um destes ratinhos, o rato PyyGFP, para estudar enteroendócrinas células do intestino delgado e cólon distai 17,21. Estas células são de interesse porque eles segregam PYY e glucagon-like peptide 1, ambos os quais são indutores da saciedade 22,23. Na época, uma conta de ultra-estrutural completa destas células era ausente, que acreditava que era essencial para compreender os seus mecanismos de sinalização. ontent &quot;&gt; Aqui, descrevemos um visualmente um método para colmatar microscopia confocal com SBEM. O método é conhecido como Cocem3D, o que nos permitiu documentar a ultra-estrutura completa das células enteroendócrinas. Temos informou que estas células têm uma neuropod que contém três quartos de todas as vesículas secretoras 8. Dentro do neuropod, há neurofilaments e muito parecido com axônios neuronais, neuropods são alimentados por células gliais entéricas 8. Mais importante, é que estes neuropods que enteroendócrinas células conectar fisicamente aos neurônios que inervam o intestino e 9 cólon. Um dos pontos fortes do cocem3D é a sua simplicidade. A redução da amostra de tecido em um bloco que pode ser trabalhada por SBEM confocal e facilita a identificação de uma célula específica dentro de um tecido. Vesículas secretoras e outras organelas pode ser identificado com facilidade em uma resolução de 7 nm / pixel. Porque as seções em SBEM são descartados, outros procescantar de tecidos para identificar proteínas específicas não é uma opção neste momento. No entanto, o desenvolvimento de métodos, tais como ATUM 24, em que secções de tecido do bloco são preservados, são susceptíveis de permitir a identificação de proteínas específicas na célula. Determinação do local específico de receptores quimiossensoriais em células enteroendócrinas é informação essencial para o desenvolvimento de terapias com drogas para obesidade, porque as células enteroendócrinas são uma interface entre sensorial alimentos no intestino e saciedade no cérebro.

A vida dentro de uma célula tem lugar no tempo e no espaço. Mudanças ao longo do tempo são frequentemente estudadas usando microscopia de lapso de tempo combinado com técnicas de imagem de fluorescência, como a microscopia de super-resolução. Espacial, em particular, o arranjo de organelas no interior de uma célula ou interacções célula-para-célula, só pode ser obtido por um relato completo da estrutura fina da célula. Um relato abrangente da estrutura fina de uma célula pode também trazer clareza de função genómica nos casos em que o genoma está disponível, como o C. elegans nematóide 1 ou o tricoplax Placozoa plana adherens 2. Microscopia eletrônica de cortes seriados é agora um reprodutível, tempo eficiente, e de tarefas graças menos dispendioso para o desenvolvimento de tecnologias automatizadas de microscopia eletrônica 3D, como bloco de série-face microscopia eletrônica de varredura 3 (SBEM). A necessidade de informações estruturais para elucidar a função é muito evidente em certos cell tipos em que a função depende de interações físicas célula-célula, como neurônios, glia, ou células epiteliais sensoriais. Estamos particularmente interessados ​​em elucidar como sinais sensoriais de nutrientes no lúmen do intestino são traduzidas em um sinal elétrico que, em última análise modula comportamentos apetitivas. O circuito é complexa, mas começa na parede do intestino, onde os nutrientes entrar em contacto com as células epiteliais sensoriais, chamadas células enteroendócrinas. Ao contrário de outras células epiteliais sensoriais, tais como células de sabor, enteroendócrinas células estão dispersas por todo o epitélio intestinal numa razão de um a mil 4-7. Conseqüentemente, eles têm sido difíceis de identificar e estudar, e por muito tempo eles eram vistos apenas como uma fonte de hormônios intestinais. Mas, com o desenvolvimento de ratinhos fluorescência repórter específicos de células, a função sensorial complexo destas células está a emergir. Usando um desses ratos repórter, um YY-GFP (PyyGFP) do mouse peptídeo, descobrimos que enteroendocrine células têm um proeminente cauda citoplasmática que nós nomeamos neuropod. O aparecimento de neuropods sugeriu uma função conservada na comunicação célula-a-célula. Assim, nós concluímos que ao documentar a ultra-estrutura de uma célula enteroendï¿½rina, a função de neuropods podia ser derivado. A necessidade de compreender a estrutura de um apêndice numa célula dispersa que é difícil de identificar era a principal razão para o desenvolvimento de um método para combinar microscopia confocal e SBEM. A célula de interesse foi identificada usando PyyGFP enteroendï¿½rina ratinhos repórter específicos de células. O método permitiu-nos para documentar toda a ultra-estrutura de uma célula enteroendï¿½rina e sua neuropod. Dentro neuropods, encontramos características estruturais dos axónios neuronais, e fora neuropods, encontramos uma relação física com glia entérico 8. Com efeito, neuropods conter cerca de 70% de todas as vesículas secretoras que sugerem um papel fundamental na função de secreção dessas células. Com base nadados estruturais, mais recentemente, verificou-se que através destas neuropods, células enteroendócrinas e neurónios que enervam o intestino formar um circuito neuroepitelial, semelhante ao de células gustativas na língua 8,9. Descobrindo tais características dos mecanismos de quimio gastrointestinais provindos de dados estruturais reunidos usando este método de microscopia correlativo. Acreditamos que este método pode ser útil em outras áreas da biologia das células, em particular em que as células estão dispersas dentro dos tecidos a uma razão muito baixa. Nós que se refere ao método confocal como correlativo e microscopia de série rosto bloco eletrônico de varredura em 3D (Cocem3D). O método é composto das seguintes etapas principais: dissecção dos tecidos, microscopia confocal, imagens SBEM, SBEM e correlação imagem confocal, e segmentação manual. Em comparação com outros métodos de correlação, o conceito é simples, porque a correlação é física em vez de química.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Delineação de ultra-estrutura de uma célula é importante para compreender a sua função. Isto pode ser difícil para um projecto de tipos de células raras difundidos em tecidos feitos de diversos tipos de células, tais como células enteroendócrinas do epitélio intestinal. Estes sensores gastrointestinais de alimentos e bactérias têm sido difíceis de estudar porque a dispersão por outras células epiteliais, na proporção de 1: 1000. Recentemente, os ratinhos transgénicos repórter foram gerados para identificar células enteroendócrinas por meio de fluorescência. Uma delas é o peptídeo YY-GFP mouse. Usando este rato, foi desenvolvido um método para correlacionar e microscopia confocal de série bloco-face eletrônica de varredura. Nós chamado o método cocem3D e aplicou-o para identificar uma célula enteroendï¿½rina específico no tecido e desvendar ultra-estrutura das células em 3D. A resolução de cocem3D é suficiente para identificar os organelos tão pequeno como vesículas secretoras e para distinguir as membranas celulares para o volume de rendering. Cocem3D pode ser facilmente adaptado para estudar a ultraestrutura 3D de outros tipos de células específicas no tecido nativo.

O método aqui descrito foi usado para estudar a ultraestrutura de uma célula específica dentro de uma camada de epitélio. A célula de interesse, neste caso, é a célula enteroendï¿½rina elusiva. A sua identificação in situ foi possível apenas nos últimos anos com o desenvolvimento de ratinhos fluorescência repórter específicos de células. Em 2011, foi desenvolvido um rato em que o promotor do hormônio PYY dirige a expressão da proteína verde fluorescente 17. Neste PyyGFP rato, células enteroendócrinas da parte distal do intestino delgado e cólon são facilmente distinguidos sob luz UV. Este modelo do rato foi uma base para identificar um bloco de tecido contendo uma célula enteroendï¿½rina e processá-lo para SBEM. O método de correlação é referido aqui como cocem3D e foi construído em protocolos previamente publicados 10,11. Optimizar as dimensões do bloco de tecido é crítica para a correlação. Em experiências preliminares,determinou-se que num bloco de tecido 300 um de comprimento x 50 mm de espessura o número de imagens SBEM é reduzida a um mínimo, enquanto que cobre todo o corpo da célula de interesse. A Figura 1A mostra uma vista do dissecção usando uma lâmina vibrante para microtrome obter o bloco de tecido com as dimensões corretas. Pelo menos 100 blocos são obtidos antes de classificar através deles para escolher aqueles com células intactas de interesse. Blocos selecionados são visualizados por microscopia confocal e de imagem z-stacks são espaçados opticamente cada 1 mm (Figura 1B e C). A Figura 1D mostra um volume vista renderizada de uma célula enteroendï¿½rina no íleo do rato. A sua neuropod proeminente se estende por baixo de células epiteliais para ~ 60 mm. A célula de interesse é encontrada ao correlacionar os confocal z-stacks uma imagem SBEM de toda a face do bloco com. Um exemplo é apresentado aqui de um bloco a partir do cólon distal de um PyyGFPrato. Após a obtenção confocal z pilhas (Figura 2A), o bloco é incorporado em uma fina camada de agarose de baixo ponto de fusão (Figura 2B). Isto é necessário para subsequente manipulação do bloco. É importante para manter a orientação do bloco tão plano quanto possível combinar as fatias ópticos com as fatias SBEM. Na Figura 2C, uma imagem representativa é mostrada de toda a face do bloco de tecido. Partes desta figura foram anteriormente publicados em Bohorquez et al., 2014 8. Este foi posteriormente correlacionado com a imagem confocal, tendo em conta os pontos de referência do tecido e às dimensões. A Figura 2D mostra uma sobreposição da imagem SBEM confocal e do bloco, revelando o localização precisa da nossa célula de interesse. Uma vez que a célula tenha sido identificado, a imagem latente SBEM é feito com uma resolução suficientemente alta para identificar vesículas secretoras e outros organelos celulares. O conjunto de dados apresentados,re foi fotografada em 7 nm por pixel como imagens do bloco foram tomadas todas as 70 nm. O conjunto de dados contidos imagens 643 que se estendem por 45 um de profundidade do tecido. A poucos microns são raspadas durante o exame inicial de toda a face do bloco a baixa ampliação. O conjunto de dados SBEM-prima foi adquirido em formato .dm3 e transformado para .tiff para o tratamento subsequente. A pilha SBEM foi cortada usando o software Fiji plugin &quot;safra (3D)&quot; bloco de forma a conter apenas a região de interesse. Isto reduz a quantidade de memória RAM necessária para renderização de volume. A célula foi identificado pela sua posição e vesículas secretoras, e segmentado utilizando software Imaris. A Figura 3 contém uma representação em 3D da célula enteroendï¿½rina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Figura 1:. Microscopia confocal Correlative (A) Fluxo de trabalho de dissecar um pedaço detecido intestinal para bloquear um tecido de 300 x 50 mm de espessura. (B) Um bloco de as dimensões corretas tecido representativo. Note-se que um bloco de tecido destas dimensões do intestino delgado do rato mede cerca de 3 vilosidades ou, no caso do cólon cerca de 8 criptas. (C) Uma das vilosidades do intestino delgado, contendo uma célula de interesse. (D) A confocal z-stack rendido em 3D usando software Imaris mostra uma célula enteroendï¿½rina com um neuropod proeminente corrida sob o epitélio intestinal. Azul = DAPI mancha nuclear. Barras = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Figura 2: microscopia Serial bloco-face eletrônica de varredura (A) imagem confocal de uma sele.bloco de tecido CTED a partir do cólon contendo células PyyGFP enteroendï¿½rina (verde) de interesse. (B) Uma vez que o bloco é fotografada por microscopia confocal, é então incorporado apartamento em baixo ponto de fusão agarose usando lâminas de vidro. Incorporando o bloco de tecido em agarose facilita a manipulação subseqüente, eo entalhe no canto esquerdo ajuda a montar o bloco dentro da SBEM na orientação correta. (C) SBEM imagem da face do bloco. (D) A correlação de dados confocal com SBEM para identificar células de interesse (seta branca). São modificados Imagens em c e d desta figura de Bohorquez et al., 2014 8. Azul = DAPI mancha nuclear. Barras = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Figura 3:. Renderização de dados em 3D (A) a prestação Volume de célula enteroendï¿½rina usando software Imaris. A célula contém um neuropod embalado com vesículas secretoras. Para uma descrição completa da ultra-estrutura de uma célula enteroendï¿½rina, consulte Bohórquez et al., 2014 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Correlativo Confocal e Microscopia Eletrônica 3D de uma célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K visualizações.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Vídeo: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Biologia

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Microscópio óptico e Eletrônica (CLEM) como uma ferramenta para visualizar moléculas microinjetados e seus eucarióticas Sub-celulares Metas


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Imagem de peróxido mitocondrial em células vivas de levedura usando mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa mitocondrial - biossensor mtHyper7 para análise subcelular 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Imagem de mtHyPer7, um biossensor ratiométrico para peróxido mitocondrial, em células vivas de levedura

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...