Este trabalho foi financiado pela American Heart Association e Fundação Cardiomiopatia das Crianças (SDG2462390204001) e os Institutos Nacionais de Saúde (HL114669). CM é um receptor de um pós-doutorado concessão bolsa de pesquisa concedido pela Fundação Miocardite, NJ.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pela Universidade de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. 1. Indução de EAE <ol><li> Para induzir a EAE, preparar a emulsão de péptido / adjuvante completo de Freund (CFA), como descrito em 11, com as seguintes modificações: Passo 1.1:. Preparar PLP 139-151 a uma concentração de 1 mg / ml em tampão fosfato salino 1x (PBS) Passo 1.4:. utilizar 200 ul de CFA emulsão contendo 100 ug de PLP 139-151 por animal Passo 1.4.1: imunizar dez animais, preparar 2 ml de emulsão por mistura de 1 ml de PLP 139-151 (1 mg / ml em 1x . PBS) e um volume igual de CFA Passo 1.5: injectar 200 ul de emulsão em doses divididas por via subcutânea, nas duas regiões inguinais (~ 75 ul de cada um) e a região do esterno (~ 50 ul) de cinco a seis semanas de idade femacamundongos le SJL / J. Passos 1.7 e 1.8 não são aplicáveis ​​para a indução de EAE. </li></ol> 2. Scoring Clínica de Ratos do EAE e colheita de Cerebrums <ol><li> Monitorar os animais para aparecimento de sinais clínicos, e marcar a doença gravidade diariamente a partir do dia 9 após a imunização da seguinte forma: 0 - saudável; 1 - mole cauda ou posterior membro fraqueza, mas não ambos; 2 - mole cauda e posterior membro fraqueza; 3 - paralisia parcial dos membros posteriores; 4 - paralisia completa dos membros posteriores; 5 - moribundo ou morto 12. </li><li> Eutanásia dos ratinhos quando atingem uma pontuação neurológica de 3 ou 4 com CO 2. Para eutanásia os ratos, pré-preencher a câmara de eutanásia primeiro com CO 2, rodando o regulador do CO 2 tanque não superior a 6 psi e permitir que os animais para ficar dentro da câmara por cerca de 5 min para conseguir asfixia completa. Mergulhe os animais sacrificados em 70% de álcool. Imediatamente, colocar os animais sobre uma almofada absorvente e utilizando um par de estéril paraceps e tesouras expor os corações, cortando através da cavidade torácica. Perfurar o aurículas direita e perfuse injetando 10 ml de frio 1x PBS nos ventrículos esquerdos dos corações. </li><li> Escavar o crânio cortando o crânio em uma forma circular usando um par de tesouras curvas, e com cuidado, virar os ossos do crânio com uma pinça. Colha o cérebro por embotar dissecção e com um bisturi limpo, cérebro separado do cerebelo. Coloque o cérebro num tubo contendo frio 1x PBS e deixar o tubo em gelo até ao processamento. </li></ol> 3. In Situ A coloração das secções cerebrais com MHC Classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers <ol><li> Prepare-se 4% de agarose tamponado com PBS de ponto de fusão baixo, derreter-se aquecimento a 50 ° C e deixá-lo em um banho de água a 40 ° C até à sua utilização. </li><li> Coloque o cérebro em um cassete histologia molde base profunda descartável mantido sobre o gelo, e despeje fundido (40 ° C) de agarose. Imediatamente, pressione suavemente o cérebrocom uma pinça para submergir o tecido. Deixar a cassete em gelo durante 15-20 minutos até a solidificação é completa. </li><li> Encha a banheira com vibratome refrigerados 1x PBS. Encher o espaço em torno de vibratome banho com cubos de gelo para manter a temperatura de PBS entre 0 e 2 ° C. Corrigir uma lâmina de barbear limpa no vibratome e definir o ângulo da lâmina de 15 °. </li><li> Colocação de tecido em vibratome. Aparar o excesso de agarose a partir de todos os lados do tecido embebido e ligeiramente expor a superfície ventral do cérebro. <ol><li> Smear vibratome bloco de tecido com super cola e transferir o tecido incorporado-agarose sobre a superfície colada, colocando a superfície ventral do cérebro exposto sobre a cola para seccionamento transversal. Não mova o tecido, uma vez que o tecido é definido sobre o bloco. </li><li> Colocar o bloco vibratome contendo o tecido embebido-agarose em gelo, e permitir que a cola seque durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Enquanto isso, coloque o tecido chamBers por um poço de uma placa de 24 poços. Encha as cavidades que contêm as câmaras de tecidos com 1 ml de PBS 1x frio, e deixar a placa em gelo. <ol><li> Prepare as câmaras do tecido, anexando uma fina malha de nylon para o corte final de uma pipeta de 25 ml de polipropileno com super-cola; após a remoção do excesso de malha em volta da pipeta, a pipeta para cortar um comprimento de 1 cm da malha. </li></ol></li><li> Diminuir a lâmina vibratome ao nível da superfície superior do tecido; definir a velocidade vibratome a 0,22 mm / seg e iniciar o corte com um movimento para frente para fazer 200 mm de espessura. Transferir uma parte cerebral por poço usando uma escova macia da aguarela nas câmaras de tecido colocados dentro dos poços de uma placa de 24 poços. Manter a placa em gelo até o corte está completa para evitar a degradação do tecido. Nota: Siga estes passos para obter no total, três seções pares de três regiões diferentes do cérebro dorsal à superfície ventral (Figura 2). Uma seção decada par (um total de três secções) colocados em três câmaras de tecido individuais são designadas por coloração com dextramers específicos (IA s / PLP 139-151) e anti-CD4. Da mesma forma, um outro conjunto de três seções que são colocados em três câmaras do tecido são atribuídas a cada coloração com dextramers controle (IA s / TMEV 70-86) e anti-CD4. </li><li> Transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers específicos em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço no qual, a 300 uL de um cocktail contendo aloficocianina (APC)-conjugados PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-ficoeritrina (PE, 5 ug / ml) em solução (PBS 1x bloqueio com 2% de soro normal de cabra) foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. </li><li> Da mesma forma, transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers controlo em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por nósll, em que, a 300 uL de um cocktail contendo TMEV APC-conjugado 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. Nota: Consulte o Massilamany et al, 8 para a preparação de dextramers, e as moléculas de dextrano para preparar dextramers foram gentilmente cedidas pelo Immudex, Copenhaga, Dinamarca.. </li><li> Rotular os poços, e enrole a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma plataforma de balanço definido para rotações suaves durante 1,5 horas no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Após o período de incubação, lavam secções de tecido na plataforma oscilante, através da transferência das câmaras de tecido para um novo poço contendo 1 ml de PBS 1x frio, e evitar que pinga do conteúdo de um poço para o outro. Repita três vezes de lavagem, permitindo que pelo menos 10 min por lavagem. Certifique-se que as secções de tecido não ficar seco como eles podem ficar com os lados da câmara. </li><li> Corrigir as seções transferindo o cham tecidobros num fresco bem na placa de 24 poços contendo 1 ml de filtrado de PBS paraformaldeído a 4% tamponado (pH 7,4) sobre uma plataforma oscilante durante 2 horas com rotação suave. </li><li> Repetir a lavagem três vezes tal como descrito no passo 3.10. </li><li> Coloque os cortes corados e fixas em uma lâmina de microscópio limpa com uma escova macia aquarela. Limpe o excesso de água, sem tocar na seção, e montar a seção usando meio de montagem. Cobrir com uma lamela microscópica e permitir que os slides para secar à temperatura ambiente O / N no quarto escuro. </li><li> Armazenar os slides em uma caixa de armazenamento de slides à prova de luz, a 4 ° C. </li></ol> 4. Indução de EAM e cobrança de corações <ol><li> Induzir EAM, como descrito na referência 11. </li><li> Eutanásia os ratos no dia 21 após a imunização usando câmara limpa equipados com CO 2 cilindro de gás, e mergulhar os animais em álcool 70%. Imediatamente, colocar os animais numa almofada absorvente, e usando um par de fórceps e tesouras expor o coraçãos, cortando através da cavidade torácica. Perfurar o aurículas direita e perfuse injetando 10 ml de frio 1x PBS nos ventrículos esquerdos dos corações. Colete os corações e coloque em tubos contendo frio 1x PBS. </li></ol> 5. In Situ Coloração de Seções do coração com MHC Classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers <ol><li> Prepare 4% PBS-tampão baixo ponto de fusão agarose, derreter por aquecimento a 50 ° C e deixá-lo em um 40 &#160; ° C banho de água até o uso. </li><li> Colocar o coração numa cassete descartável profunda histologia do molde da base mantidos em gelo, e derramar fundido a 40 ° C até que os tecidos de agarose são completamente submersa tal como descrito na etapa 3.2. </li><li> Siga o passo 3.3. </li><li> Aparar o excesso de agarose a partir de todos os lados do tecido embebido e ligeiramente expor a base do coração. Esfregaço vibratome bloco de tecido com super-cola e transferir o tecido embebidas em agarose sobre a superfície colada, colocando a superfície exposta dacoração sobre a cola. Não mova o tecido, uma vez que o tecido é definido sobre o bloco. <ol><li> Colocar o bloco vibratome contendo o tecido embebido-agarose em gelo, e permitir que a cola seque durante 15 minutos. </li></ol></li><li> Siga os passos 3.5 e 3.6. </li><li> Transferir as secções de coração utilizando uma escova macia aguarela nas câmaras de tecido colocadas no interior das cavidades de uma placa de 24 poços. Manter a placa em gelo até o corte está completa para evitar a degradação do tecido. Nota: Siga estas etapas para obter no total, oito seções pares do ápice para a base do coração (Figura 2). Coloque todas as seções em câmaras do tecido, destinando até 3 seções por câmara. Uma secção de cada par (um total de oito pontos) é designado por coloração com dextramers específicos (IA k / myhc 334-352) e anti-CD4. Da mesma forma, um outro conjunto de oito seções é designado para coloração com dextramers controle (IA k / RNase 43-56) e anti-CD4. </li><li> Transferir otrês câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers específicos em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço, em que, a 300 uL de um cocktail contendo APC-conjugados myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. <ol><li> Da mesma forma, transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers controlo em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço, em que, a 300 uL de um cocktail contendo RNase APC-conjugado 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. </li></ol></li><li> Rotular os poços, e enrole a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma plataforma de balanço definido para rotações suaves durante 1,5 horas no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Siga os passos, 3,10-3,11 </li><li> Repita thr lavagemgelo tal como descrito na etapa 3.10. </li><li> Coloque os cortes corados e fixos (até três seções / slide) em uma lâmina de microscópio limpa com uma escova macia aquarela. Limpe o excesso de água, sem tocar as seções, e montar as seções usando meio de montagem. Cobrir com uma lamela microscópica e permitir que os slides para secar à temperatura ambiente O / N no quarto escuro. </li><li> Armazenar os slides em uma caixa de armazenamento de slides à prova de luz a 4 ° C. </li></ol> 6. Análise de Dextramer + Cells (DEXT +) T CD4 + por Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) (comum a ambos cérebro eo coração Seções) <ol><li> Use Nikon A1-Eclipse sistema de microscópio confocal 90i para a digitalização de rotina e aquisição de imagens. Para iniciar clique em Abrir o software NIS Elements AR (versão 4.13). <ol><li> Escolha &quot;TRITC&quot; e &quot;Cy5&quot; canais do painel. Os comprimentos de onda, respectivamente excitação / emissão para canais TRITC e Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm e 640,7 nm / 663-738 nm aparecem por padrão. </li><li> Atribuir o pseudocolors &quot;verde&quot; e &quot;vermelho&quot; para o TRITC (CD4-PE) e Cy5 canais (dextramer-APC), respectivamente. </li><li> Coloque o slide a ser examinado no palco microscópico e focar manualmente com aumento de 100X. Defina o &quot;HV&quot; para 110 e compensar a &quot;0&quot;. Clique em &quot;Focus&quot; e ajuste a &quot;tensão&quot; para otimizar os lasers. </li><li> Clique em &quot;Focus&quot;; digitalizar a seção de cima para baixo, e definir o nível de &#39;Z&#39; para a aquisição da imagem. Clique em &quot;séries CH&quot; e adquirir a seqüência de imagens. Identificar DEXT + células T CD4 + células aparecendo puntiformes como amarelas com base na co-localização dos sinais gerados a partir de ambos os canais vermelho (dextramers) e verde (CD4). </li></ol></li><li> Use Olympus FV500-BX60 microscópio confocal para enumeração quantitativa fácil de células T CD4 + + DEXT. Para começarclique aberto, o software FluoView (versão 4.3). <ol><li> Selecione o corantes &quot;Cy3&quot; e &quot;Cy5&quot; a partir do menu drop-down, e clique em &quot;aplicar&quot; para carregar os respectivos lasers. Nota: os comprimentos de onda de excitação / emissão para Cy3 (543 nm / pseudocolored &quot;verde&quot;; CD4-PE); canais e Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored &quot;vermelho&quot;). </li><li> Coloque o slide a ser examinado na lâmina de microscópio, e concentrá-la manualmente em pequeno aumento (4X ou 10X). Clique em &quot;Focus&quot;, enquanto o laser Cy3 está ligado, e se concentrar o foco inflamatório. </li><li> Altere o objetivo de aumento de 100X. Defina o tamanho do arquivo para &quot;512/512&quot; a partir do menu drop-down. Clique em &quot;Focus&quot; e ajuste os valores para &quot;PMT&quot;, &quot;Gain&quot; e &quot;Offset&quot; parâmetros para otimizar os lasers separadamente para Cy3 e Cy5. </li><li> Clique em &quot;fase Z&quot; e clique em &quot;Focus&quot;, enquanto ambos os lasers estão. Conjuntoa espessura da &quot;fase Z&quot; clicando no botão &quot;up&quot; e &quot;down&quot; setas. Defina o intervalo de &quot;Z&quot; para 2 m. </li><li> Clique em &quot;Stop&quot;, e escolha &quot;Seq123&quot;. Em seguida, clique em &quot;XYZ&quot; e começar a aquisição de imagens da série &quot;Z&quot; para a área selecionada dentro do foco inflamatório. Salve as &quot;imagens de série Z&quot;, como arquivos AVI. Para salvar os arquivos de imagem, selecione a imagem da &quot;imagem de série Z&quot;, e, em seguida, salvar como formato &quot;tiff&quot;. </li></ol></li><li> Examine três seções pares do cérebro, onde um conjunto de três seções foi corado com IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 eo outro conjunto de três seções com IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 para executar análise quantitativa. <ol><li> Da mesma forma, analisar oito seções emparelhados para o coração, no qual, um conjunto de oito seções estava manchada de IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 e outro set de oito seções com RNase 43-56 dextramers/anti-CD4. </li></ol></li><li> Examine de 10 a 15 focos inflamatórios por seção no cérebro, e em cada foco, adquirir um conjunto de 15 a 25 imagens de série sequencial. <ol><li> Examine um total de 20 focos inflamatórios de todas as oito seções do coração e de cada foco adquirir de 10 a 15 imagens de série sequencial. Pegue as imagens de série &#39;Z&#39;, digitalizando os slides em um &quot;up-horizontal-vertical no horizontal-vertical&quot; movimento de modo que a repetição da série &#39;Z&#39; dentro do mesmo foco é evitado. </li><li> Uma vez que as imagens de série &quot;Z&quot; são capturados, nomear os arquivos, identificando os números de slides, nome das seções, eo número das imagens em série &#39;Z&#39; tomadas. <ol><li> Use o software &quot;ImageJ&quot; para contagem de células CD4 + T + DEXT em relação ao número total de células T CD4 +. Selecione o &quot;tipo de balcão &#39;em&#39; ImageJ, verifique e# 8216; mostrar todos &quot;e começará a contar clicando no centro de cada célula e continuar contando em diferentes &#39;&#39; Z imagens de série usando as setas laterais. Após a contagem de todas as células T CD4, escolha outro tipo de balcão e contagem de CD4 + DEXT + células T. Clique na guia resultados para obter o número total de células contadas com os dois contadores diferentes. </li><li> Para se obter o número total, adicionar o número de células em todas as imagens seriais &#39;Z&#39; representando todas as três secções cerebrais ou todas as secções de coração oito. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+MHC+class+II+tetramers+to+investigate+CD4++T+cell+responses:+problems+and+solutions.">Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions.</a> Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).</li><li>Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+difficulties+and+future+promise+of+MHC+multimers+in+autoimmune+exploration.">Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration.</a> Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).</li><li>Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+class+II+tetramers+for+identification+of+CD4++T+cells.">Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells.</a> J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).</li><li>Landais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+design+of+MHC+class+II+tetramers+to+accommodate+fundamental+principles+of+antigen+presentation.">New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation.</a> J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).</li><li>Nepom, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II+tetramers.">MHC class II tetramers.</a> J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).</li><li>Vollers, S. S., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+II+major+histocompatibility+complex+tetramer+staining:+progress,+problems,+and+prospects.">Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects.</a> Immunology. 123, 305-313 (2008).</li><li>Wooldridge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricks+with+tetramers:+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide-MHC.">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC.</a> Immunology. 126, 147-164 (2009).</li><li>Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+CD4+T+cells+using+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers.">Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers.</a> BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).</li><li>Batard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextramers:+new+generation+of+fluorescent+MHC+class+I/peptide+multimers+for+visualization+of+antigen-specific+CD8++T+cells.">Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells.</a> J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).</li><li>Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+staining+with+major+histocompatibility+complex+class+II+dextramers+permits+detection+of+antigen-specific,+autoreactive+CD4+T+cells+in+situ.">Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ.</a> PLoS One. 9 (1), (2014).</li><li>Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Assessment+of+Cardiac+Abnormalities+in+Experimental+Autoimmune+Myocarditis+by+Magnetic+Resonance+Microscopy+Imaging+in+the+Mouse.">Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse.</a> J Vis Exp. (88), e51654 (2014).</li><li>Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epitope+from+Acanthamoeba+castellanii+that+cross-react+with+proteolipid+protein+139-151-reactive+T+cells+induces+autoimmune+encephalomyelitis+in+SJL+mice.">An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice.</a> J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).</li><li>Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis-inducing+epitope+of+myosin+binds+constitutively+and+stably+to+I-Ak+on+antigen-presenting+cells+in+the+heart.">Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart.</a> J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).</li><li>Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alpha-myosin+heavy+chains+differ+in+their+induction+of+myocarditis.+Identification+of+pathogenic+epitopes.">Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes.</a> J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).</li><li>Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+detection+of+antigen-specific+CD4++T+cells+by+HLA-DR1+oligomers+is+dependent+on+the+T+cell+activation+state.">Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state.</a> J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).</li><li>Novak, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high,+proliferating+subset.">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li><li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+(IAs)+tetramers.">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesses foram declaradas.

Ao contrário I tetrâmeros de MHC de classe, o uso de tetrâmeros de MHC de classe II para aplicações de rotina continua a ser um desafio, especialmente para enumerar as freqüências precursoras de células CD4 T auto-reativas de baixa afinidade, em parte devido à sua dependência de ativação 6,15-17. Recentemente, este problema foi contornado pela criação da nova geração de tetrâmeros, chamado &quot;dextramers&quot;, permitindo-nos para as células específicas para o antigénio T CD4 para um con...

O uso do complexo principal de histocompatibilidade tetrâmeros (MHC) de classe II, para a detecção de células específicas para o antigénio T CD4 tem sido um desafio 1-7. Para aumentar a sensibilidade de detecção de tetrâmeros de MHC de classe II, a equipe de pesquisa criou tetrâmeros de próxima geração, designadas &quot;dextramers&quot; 8. Dextramers conter esqueletos de dextrano na qual várias unidades químicas da estreptavidina-fluoróforo são conjugados, de tal modo que vários monómeros, de péptidos biotinilados de MHC-tethered pode ser ligado a uma molécula de dextrano 9. Assim, grandes agregados de dextramers MHC que contêm vários complexos MHC-péptido podem interagir com múltiplos receptores de células T (TCRs). Este grupo recentemente gerado dextramers para vários auto-antigénios e demonstrado que a sensibilidade de detecção de dextramers foi aproximadamente cinco vezes mais do que 8 tetrâmeros. Os sistemas experimentais incluem encefalomielite auto-imune experimental (EAE) induzida com proteína proteolipidica (PLP) em murganhos SJL 139-151; EAE induzida com glicoproteína de mielina oligodendrócitos (MOG) 35-55 em camundongos C57BL / 6; e miocardite auto-imune experimental (EAM) induzida com miosina cardíaca pesada cadeia-α (MyHC) 334-352 em camundongos A / J. Este estudo demonstra a utilização de PLP 139-151 - e MyHC 334-352 dextramers para detectar células específicas para o antigénio T CD4 in situ com especificidade pelo desenvolvimento de um protocolo de coloração directa, eliminando assim a necessidade de amplificar os sinais de utilizar anticorpos fluoróforo, uma aproximar comumente empregado com o uso de tetrâmeros. Além disso, um método global de avaliar tecidos também foi concebida de forma fiável para enumerar as frequências de células T CD4 + específicas para o antigénio in situ 10. Detecção de células T específicas para o antigénio in situ permite a delineação dos eventos causados ​​por estímulos antigénicos específicos de as causadas pela activação do espectador. De igual modo, a técnica em si tu também provides oportunidades de acompanhar a cinética de infiltração de células T específicas de antigénios nos órgãos-alvo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

Neste relatório, a detecção in situ de antígeno-específicas, autoreactive células T CD4 por coloração direta com dextramers MHC classe II é descrito. Seções cerebrais Corte recentemente foram derivadas de camundongos EAE e corados com cocktails contendo PLP 139-151 (específico) ou TMEV 70-86 (controle) dextramers e anti-CD4. Os painéis de topo da Figura 1 mostra a análise de secções cerebrais LSCM costained com PLP 139-151 dextramers (vermelho) e anticorpo CD4 (verde), onde as c...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers at JoVE.com

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K visualizações.  University of Nebraska, Lincoln.  O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Na diferenciação in vitro de células T CD4 + humano FOXP3 + Induzida T reguladoras (iTregs) a partir de células naive T CD4 + usando um protocolo de TGF-β contendo

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantificação de células T antígeno-específicas humanas proliferating de CD4+ usando o éster do Succinimidyl do carboxyfluorescein

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A well-studied function of major histocompatibility complex class I (MHCI) is the presentation of cell-derived peptides to the adaptive immune system, particularly in response to infection. More recently it has been shown that the expression of MHCI molecules on neurons can modulate activity-dependent changes in the synaptic connectivity during normal development and neurologic disorders. The importance of these functions to the brain health supports the need for a sensitive assay that readily detects MHCI expression on neurons. Here we describe a method for primary culture of murine hippocampal neurons and then assessment of MHCI expression by flow cytometric analysis. Murine hippocampus is microdissected from prenatal mouse pups at the embryonic day 18. Tissue is dissociated into a single cell suspension using enzymatic and mechanical techniques, then cultured in a serum-free media that limits growth of non-neuronal cells. After 7 days in vitro, MHCI expression is stimulated by treating cultured cells pharmacologically with beta interferon. MHCI molecules are labeled in situ with a fluorescently tagged antibody, then cells are non-enzymatically dissociated into a single cell suspension. To confirm the neuronal identity, cells are fixed with paraformaldehyde, permeabilized, and labeled with a fluorescently tagged antibody that recognizes neuronal nuclear antigen NeuN. MHCI expression is then quantified on neurons by flow cytometric analysis. Neuronal cultures can easily be manipulated by either genetic modifications or pharmacologic interventions to test specific hypotheses. With slight modifications, these methods can be used to culture other neuronal populations or to assess expression of other proteins of interest.

This protocol describes a method for culturing primary hippocampal neurons from embryonic mouse brain. The expression of major histocompatibility complex class I on the extracellular surface of cultured neurons is then assessed by flow cytometric analysis.

Avaliando a expressão do complexo de histocompatibilidade maior classe I em neurônios hipocampais murinos primários por citometria de fluxo

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &amp;#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

Estabilidade e Estrutura do Complexo de Histocompatibilidade Maior do Morcego Classe I com β Heterologous2-Microglobulina

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cell line&#160;and three-dimensional (3D) cultures of human airway epithelium. The method allows highly specific and sensitive visualization of viral RNA by relying on HCR initiated by probe localization. Split-initiator probes help amplify the signal by fluorescently labeled amplifiers, resulting in negligible background fluorescence in confocal microscopy. Labeling amplifiers with different fluorescent dyes facilitates the simultaneous recognition of various targets. This, in turn, allows the mapping of the infection in tissues to better understand viral pathogenesis and replication at the single-cell level. Coupling this method with immunofluorescence may facilitate better understanding of host-virus interactions, including alternation of the host epigenome and immune response pathways. Owing to sensitive and specific HCR technology, this protocol can also be used as a diagnostic tool. It is also important to remember that the technique may be modified easily to enable detection of any RNA, including non-coding RNAs and RNA viruses that may emerge in the future.

Here, we describe a simple method that combines RNA fluorescence in situ&#160;hybridization (RNA-FISH) with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. This protocol may increase understanding of the molecular characteristics of SARS-CoV-2 RNA-host interactions at a single-cell level.

Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" of a T cell needs to be assessed by function, and higher function is associated with more powerful immune protection. T cells that can simultaneously produce two or more cytokines or chemokines at the single-cell level are called polyfunctional T cells (TPFs), which mediate immune responses through a variety of molecular mechanisms to express degranulation markers (CD107a) and secrete interferon (IFN)-&#947;, tumor necrosis factor (TNF)-&#945;, interleukin (IL)-2, or macrophage inflammatory protein (MIP)-1&#945;. There is increasing evidence that TPFs are closely related to the maintenance of long-term immune memory and protection and that their increased proportion is an important marker of protective immunity and is important in the effective control of viral infection and reactivation. This evaluation applies not only to specific immune responses but also to the assessment of cross-reactive immune responses. Here, taking the Japanese encephalitis virus (JEV) as an example, the detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs produced by peripheral blood mononuclear cells of children vaccinated against Japanese encephalitis were tested to provide a reference for similar studies.

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

The present protocol combines ex vivo stimulation and flow cytometry to analyze polyfunctional T cell (TPF)&#160;profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) within Japanese encephalitis virus (JEV)-vaccinated children. The detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs were tested to provide a reference for similar studies.

Detecção de Células T Polifuncionais em Crianças Vacinadas com Encefalite Japonesa através da Técnica de Citometria de Fluxo

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...