Este trabalho foi apoiado pelo financiamento para a RAW a partir do seguinte: NIH concede K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Iniciado Scholar Award # 5-FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame Faculdade de Ciências e Departamento de Ciências Biológicas; e uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame de Elizabeth e Michael Gallagher, em nome da família Gallagher para fomentar a investigação em células estaminais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa em Zebrafish Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de peixe-zebra. Agradecemos a GF Gerlach para tirar as fotografias fornecidas na Figura 4. Finalmente, agradecemos a todos os membros de nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e insights sobre este trabalho.

NOTA: Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use na Universidade de Notre Dame. NOTA: Embora o seguinte protocolo fornece uma demonstração de isolamento esperma que envolve a eutanásia dos machos, o esperma pode ser a coleta do poro genital da anestesiados vivendo peixe-zebra macho usando pressão abdominal suave e uma microcapilar para coleta de esperma 17,18. Espremendo do sexo masculino vivos exige diversos machos a ser utilizado, a fim de recolher a quantidade equivalente de espermatozóides que podem ser obtidos a partir de um macho sacrificados 17,18. No entanto, os machos que tenham sido submetidos a compressão permanecem bastante saudáveis ​​e podem ser utilizados para acasalamento naturais ou subsequentes procedimentos in vitro 17. Sempre que possível, os procedimentos escolhidos devem minimizar sacrifício peixe desnecessário. 1. Preparação de Soluções e Zebrafish acasalamento Chambers &lt;ol&gt; <li> Preparar soluções stock de Hank (# 1, 2, 4, 6) e da solução de pré-mistura de Hank (ver tabela Materiais) 19, em seguida, autoclave e armazenar a 4 ° C. </li><li> Selecione o número desejado de fêmea de peixe-zebra adulto (s) para a coleta de embreagem haplóides. NOTA: Com base na experiência, utilizando um composto de Fórmula 1 mutagenizado consanguínea zebrafish estirpe Tubingen, aproximadamente, 50% do sexo feminino, sexualmente maduros eram &quot;compressível&quot; em média após a activação deles colocando-os em uma gaiola de acoplamento durante a noite com um macho - ou seja, uma embraiagem foi obtido através do processo de compressão - e que a maioria destas garras (variando entre 70-90%) produziu haplóides viáveis. Com dois pesquisadores realizando a preparação haplóides, cerca de 80 adultos F1 fêmea de peixe-zebra pode ser espremido em uma manhã. Para calcular os reagentes necessários para o experimento haplóides, factor de tanto a taxa de compressão da geração F1 e o número de investigadores disponível para executar a experiment. Tenha em mente que o número de fêmeas que produzirão garras haplóides de alta qualidade é extremamente variável, com diferenças observadas entre as fêmeas de peixe-zebra de diferentes linhagens, idades e dieta 15. </li><li> Prepare gaiolas de acasalamento, colocando cada adulto fêmea de peixe-zebra com um peixe-zebra adulto masculino em uma câmara de água do sistema de modo que eles são separados por um divisor durante a noite. NOTA: As fêmeas devem ser expostos a uma noite do sexo masculino para privilegiada, ou prepará-los, para desova através de compressão. </li></ol> 2. Dissecção de Testes <ol><li> Adicione da Solução # 6 fresco de Hank através da adição de 0,35 g de bicarbonato de sódio a 10 ml de água destilada. Misture bem para dissolver o pó de bicarbonato de sódio. </li><li> Combina-se o seguinte num tubo em gelo, a fim de fazer a solução de trabalho final do tamponada de Hank para o esperma: 9,9 ml de Hanks Premix I com 100 ml de solução de estoque # 6. </li><li> Misture bem, então alíquota de 500 mL da Hank7; s solução de trabalho final em um tubo de microcentrífuga e colocar no gelo. NOTA: Cada 500 ul alíquota irá ser utilizado para preparar o esperma dos testículos de peixe-zebra macho 4-5. </li><li> Escolha entre 4-5 peixe-zebra macho para cada colheita de esperma. NOTA: Este vai colher esperma suficiente para ser recolhidos, processados ​​e guardados em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, o qual pode ser utilizado para fertilizar aproximadamente 15 embraiagens haplóides. Selecione coortes adicionais de machos, a fim de preparar tubos adicionais dependendo da escala do experimento. Se o peixe-zebra macho selecionado são pequenos ou a dissecção testículos é incompleta, geralmente serão necessários cinco homens. </li><li> Eutanásia cada macho usando um líquido para transferir os peixes suavemente um prato contendo 0,2% tricaina de aproximadamente 5-6 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Tenha cuidado para assegurar que o homem tenha sido devidamente sacrificados antes do início da dissecção. Normalmente, esperar vários (2-3) minutos após as guelras do peixe parar de se mover e os peixesjá não é sensível ao toque. </li><li> Escolha o macho se suavemente com uma colher de plástico e cuidadosamente apagar a seco masculino de líquido. Em seguida, remover a cabeça do macho com uma tesoura afiada e depois cortar uma incisão ao longo da linha média ventral. NOTA: A remoção do excesso de líquido a partir do peixe é essencial para evitar desencadear a activação do esperma. </li><li> Retire o tubo digestivo e órgãos viscerais associadas da cavidade abdominal usando uma pinça fina e coloque em um recipiente para eliminação de risco biológico. </li><li> Use uma pinça fina para remover os testículos, que estão localizadas ao longo da parede do corpo dorsal, laterais à bexiga natatória, e têm um aspecto branco opaco, quando vistas sob o microscópio estereoscópico. NOTA: Mantendo os testículos intacto pode ajudar a evitar a exposição do esperma à base de água e fluidos corporais, assim, evitar a activação prematura. </li><li> Colocar os testículos na solução de esperma em gelo e manter o tubo em gelo enquanto as outras testículos são dissecados. Repita os passos 2,6-2,9 até que todo o males foram dissecados. </li><li> Coloque as carcaças e quaisquer tecidos animais restantes em um recipiente para eliminação de risco biológico institucional adequado. </li></ol> 3. UV Sperm Inativação <ol><li> Homogeneizar os testículos por moagem suavemente o tubo de microcentrífuga com um pilão microtubo estéril. </li><li> Transferir o sobrenadante para uma pequena placa de petri ou de vidro de relógio em gelo. NOTA: Não transferir restos de tecido junto com a solução sobrenadante. Isto irá criar sombras e comprometer a inativação UV de esperma. </li><li> Lavar o tubo de espermatozóides com entre 300-400 mL de solução de trabalho final adicional de Hank (preparado na Fase 2.2 e armazenado em gelo), e adicionar esta lavagem sobrenadante para a pequena caixa de Petri ou vidro de relógio no passo 3.2. </li><li> Expor o prato de UV de uma lâmpada de bancada (254 nm) para um total de 2 min a uma distância da fonte de luz de cerca de 15 em (38,1 centímetros). NOTA: Tenha cuidado ao trabalhar com uma lâmpada UV e usar uma viseira ououtro equipamento de protecção individual dos olhos. </li><li> Devolver o prato para o balde de gelo, em seguida, transferir o esperma inactivado UV para um tubo de microcentrífuga fresco e armazenar a amostra em gelo. NOTA: Neste ponto, haverá cerca de 800 mL de esperma para a fertilização UV inativado embreagem haplóides. O esperma deve ser mantido no gelo durante toda a duração do tempo gasto em apertar as fêmeas. Esperma no frio Hank pode ser usado por até 6 horas, sem qualquer redução no resultado da fertilização. Interessantemente, outros investigadores relataram que o esperma em frio de Hank é viável a partir de várias horas a vários dias 18. </li></ol> 4. Procurement Egg do Zebrafish Adulto Feminino e Fertilização In Vitro da embreagem <ol><li> Prepare banho tricaina para anestesia através da combinação de 20 ml de 0,2% estoque tricaina com 80 ml de água sistema de peixe. </li><li> Selecione a fêmea para coleta de ovos, usando uma rede para colocá-la suavemente no prato de tricaine. </li><li> Espere por 2-3 min até que a fêmea é anestesiado e já não responde ao toque. NOTA: Se os espasmos femininos ou provoca outros movimentos, dar-lhe mais tempo para sucumbir à anestesia. </li><li> Use uma colher de plástico para levantar delicadamente a mulher, decantação da solução antes de colocar a fêmea em uma toalha de papel para afastar o excesso de líquido. NOTA: Tenha cuidado para não deixar solução extra no feminino, como fluido irá desencadear a activação de ovo antes da adição de esperma. </li><li> Coloque a fêmea em seu slide na caixa de Petri limpa e visualizar sua barriga sob o microscópio estereoscópico. </li><li> Curso barriga da fêmea suavemente por cerca de 10-20 segundos usando um ou dois dedos de uma mão para apertar os ovos de seu abdômen, enquanto isso apoiando as costas do sexo feminino, posicionando um ou dois dedos da outra mão atrás dela parede do corpo dorsal. NOTA: Após a acariciar o abdômen da fêmea, os ovos devem sair muito facilmente. Se os ovos não surgem sagacidadeh facilidade, não é aconselhável a &quot;empurrar com mais força &#39;e ovos força do feminino. Isso indica que os ovos não estão presentes e / ou não está pronto para a fertilização, e continuou empurrando está associada a um risco considerável de prejudicar a fêmea (por exemplo, esvaziar a bexiga natatória ou causar outros danos internos letal). Se uma fêmea é espremido, mas fornece nenhum ou poucos ovos, a fêmea retornar à facilidade animal. Após 1-2 semanas de descanso, emparelhar a fêmea com um macho para um acasalamento natural para limpar os restos de ovo residual. Segregar fêmeas que acasalam-se naturalmente em um tanque por mais 1-2 semanas de descanso antes de tentar uma segunda squeeze. Alternativamente, as fêmeas podem estar descansado durante 4 semanas, durante o qual eles podem ser criados para acasalamentos naturais 15. </li><li> Use uma fina sonda ou pequena espátula para colher os ovos para fora sob a fêmea e / ou sua superfície barriga. </li><li> Levante cuidadosamente a fêmea e devolvê-la a um tanque de isolamento devidamente rotulados contendo água sistema de peixe. &lt;/ Li&gt; <li> Adicionar 50 ul de solução de esperma inactivado por UV para a embraiagem de ovos, e incubar à temperatura ambiente durante 30 segundos durante o qual o tempo, fixar uma etiqueta correspondente ao prato para segui-lo com o número atribuído ao progenitor feminino. </li><li> Adicionar 1 ml de E3 para os ovos, e incubar à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Adicionar solução E3 suficiente para encher o prato intermediário, e colocar os embriões a 28 ° C durante a incubação subsequente. NOTA: A adição de penicilina / estreptomicina (1% (v / v) de solução para canetas-strep contendo 5.000 unidades de penicilina e estreptomicina a 5 mg por ml) de 19 a E3 pode ajudar na saúde geral dos embriões haplóides. </li></ol> 5. Observação e manipulação de embriões haplóides <ol><li> Depois de 4-8 horas, remover embriões não fertilizados do prato e lavar os embriões restantes, substituindo a mídia embrião E3 com solução E3 fresco. NOTA: não fertilizada embriões irá exibir uma aparência branca, opaca ou pode exibir uma forma transparenteppearance com uma única célula disforme. </li><li> Incubar até ponto de tempo desejado de interesse, e depois utilizar no ensaio tela desejada ou outro aplicativo (s) de pesquisa. </li></ol>

<ol>
	<li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-26 (1996).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-43 (1996).</li><li>Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+make+a+big+splash.">Zebrafish make a big splash.</a> Cell. 87, 969-977 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Bradford, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFIN:+enhancements+and+updates+to+the+zebrafish+model+organism+database.">ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li><li>Bowen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mapping+and+cloning+of+mutations+in+zebrafish+by+low-coverage+whole-genome+sequencing.">Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing.</a> Genetics. 190, 1017-1024 (2012).</li><li>Leshchiner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+mapping+and+identification+by+whole-genome+sequencing.">Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing.</a> Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).</li><li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+positional+cloning+of+zebrafish+mutations+by+linkage+and+homozygosity+mapping+using+whole-genome+sequencing.">Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing.</a> Development. 139, 4280-4290 (2012).</li><li>Voz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+homozygosity+mapping+and+identification+of+a+zebrafish+ENU-induced+mutation+by+whole-genome+sequencing.">Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>Walker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploid+screens+and+gamma+ray+mutagenesis.">Haploid screens and gamma ray mutagenesis.</a> Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).</li><li>Steisinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+2,+Embryo+Production+by+in+vitro+fertilization.&#8221;.">Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Walker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+gynogenetic+diploid+zebrafish+by+early+pressure.">Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure.</a> (28), (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10:+Recipes.&#8221;.">Chapter 10: Recipes.&#8221;.</a> The Zebrafish Book 4th ed. , (2000).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+medaka+fish+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells.</a> Science. 326, 430-433 (2009).</li><li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+haploid+embryonic+stem+cell+cultures+in+medaka+fish.">Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish.</a> Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).</li><li>Layton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.&#8221; Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed. , (2009).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Triagem Haplóide é uma técnica útil para descobrir genes essenciais necessárias para os estágios iniciais de desenvolvimento. Além disso, a cultura de células haplóides do peixe medaka foi utilizado para isolar as linhas de células ES semelhantes que têm inúmeras aplicações de investigação e de potencial, o que demonstra que as células haplóides pode proporcionar um local futuro valioso para outros tipos de estudos genéticos vertebrados 20,21. Este protocolo proporciona uma demonstração dos métodos envolvidos com a realização da produção de embriões de peixes-zebra haplóides por fertilização in vitro com esperma inactivado por UV. Esta metodologia pode ser utilizada para realizar telas frente haplóides com peixe F1 mutagenizado, o qual pode ser feito utilizando o tipo selvagem, transgénicos ou estirpes mutantes para o rastreio potenciador / supressora. Embora o tempo de triagem usando uma estratégia haplóide é muito reduzido em comparação com o rastreio diplóide, será, no entanto, levar vários meses para ser concluído. Como nós descricama anteriormente, existem muitos benefícios que existem através da realização de uma tela usando um esquema haplóides, que pode ajudar a fazer novas contribuições para o conhecimento atual sobre qualquer número de eventos de desenvolvimento. A metodologia tela haplóides é mais eficiente para a identificação de alelos mutantes recessivos do que telas diplóides baseados em função da redução do tempo, do espaço e do número de peixes que são necessários. No entanto, existem várias armadilhas para uma tela haplóide. Uma tela haplóides só pode identificar mutantes em genes que estão ativos nos primeiros dias de desenvolvimento, como o embrião só pode sobreviver por um tempo limitado, com um genoma haplóide. Os genes que são expressos mais tarde no desenvolvimento terão de ser identificado por um método diferente, tal como uma tela de diplóide. Além disso, alguns órgãos não se desenvolvem adequadamente em um organismo haplóide. Pode haver anormalidades anatômicas, ou uma hora atrasada de desenvolvimento, que podem causar a mutação para ser desperdiçada pela técnica de triagem haplóides. Eun disso, algumas cepas de peixe não se desenvolvem bem em uma condição haplóide 15. Haplóides podem ser categorizadas por uma série de classificação de bons, intermediários e pobres características embrionárias, com embriões sendo o mais normal, B para designar embriões com defeitos no eixo, mas a cabeça limpa e cauda, ​​e C / D para designar embriões com irreconhecível características (massas de células em cima de bolas de gema) 15,17. As proporções de embriões dentro destas categorias varia de acordo com a tensão peixe-zebra, com aumento do número de haplóides de melhor qualidade mais prevalentes em determinadas origens genéticas 15,17. Devido a esses fatores, é necessário encontrar uma cepa adequada de peixe-zebra para realizar a mutagênese e cruzes subseqüentes. Em nossa experiência recente, o tipo selvagem Tübingen tensão produzida haplóides viáveis ​​para triagem (como mostrado na Figura 3 e 4), embora os pesquisadores historicamente zebrafish têm utilizado a AB ou ab * cepas para experim haplóidesentação 15. Em adição a estes desafios acima mencionados, nem todas as fêmeas de peixe-zebra adultos com primário irá produzir uma embraiagem mediante realização da técnica de compressão. Por exemplo, no trabalho com ENU-mutadas fêmeas tensão Tübingen, cerca de metade de todas as fêmeas produziu uma embreagem após apertar, e uma fração deles (tipicamente 10-30%) eram de má qualidade ou embrião não poderia ser fertilizado. Assim, para executar uma tela haplóides deve-se planejar para levantar pelo menos duas vezes como muitos peixes como necessário para a tela o número desejado de genomas (cada fêmea representa um genoma filtrada). Independentemente desta análise, os benefícios do método haplóide de triagem para cobrir um grande número de genomas sem uma instalação para animais maciço são bastante significativa se o ensaio é favorável para o estado haplóide. No entanto, também deve notar-se que o estudo mais aprofundado da mutação (ões) identificada na embraiagem haplóide é totalmente dependente de um levantamento com sucesson outcross do fundador feminino. Como acontece com qualquer tela, &#39;bate&#39; inicialmente identificados durante o processo de seleção deve ser re-identificado no estado diplóide. Apesar das armadilhas de usar a tela haplóides, tem mostrado ser muito bem sucedido em identificar mutantes, que foram analisadas em profundidade com ganhos perspicazes para o campo científico 15. Telas haplóides podem ser implementadas para investigar outros processos mal compreendidos do desenvolvimento dos vertebrados. Usando haplóides para telas Enhancer e supressores é uma maneira de ganhar mais conhecimento sobre as atividades e rede de regulação de um gene de interesse. A técnica de rastreio haplóide, também pode ser utilizado para identificar potenciadores e eliminadores de mutantes que já tenham sido isolados por meio de métodos tais como mutagénese química ou por inserção ou genética reversa abordagens como Tilling ou TALENS. Em suma, o mutante previamente isolado pode ser mutado com ENU e rastreados para potenciadores ou suppressors do fenótipo mutante inicial. O mutante deve ser capaz de alcançar as fases adultas, por isso, é necessário ter um animal heterozigótica ou uma fraco de peixe mutante homozigótica para executar este ecrã, no entanto os recentes avanços na transgénicos permitiram aos investigadores saia este problema. Aprender a manipular os caminhos do desenvolvimento pode levar a muitas possibilidades emocionantes, incluindo a perspectiva de caminhos perturbadores para tratar estados de doença.

Os processos fundamentais que orquestram o desenvolvimento dos vertebrados são amplamente conservadas 1. Uma forma poderosa para identificar genes com papel essencial no desenvolvimento é isolar mutações hereditárias que levam a defeitos fenotípicos no processo de interesse. O peixe-zebra, Danio rerio, é uma pequena espécie de teleósteos de água doce pertencente à família Cyprinidae peixe que se tornou um organismo modelo amplamente utilizado para a genética do desenvolvimento de vertebrados ao longo das últimas décadas 2. Ovos de peixe-zebra são fertilizados externamente, permitindo o acesso ao zigoto do início da fertilização 3. Além disso, o embrião é opticamente transparente, permitindo a visualização do desenvolvimento com uma lupa simples 3. Ontogenia do peixe-zebra é rápida, com os processos de clivagem, a gastrulação, e a organogénese das muitas estruturas, tais como o coração e os rins, praticamente concluída ao longo do primeiro dia de desenvolvimento 3. Tele tempo de estágios larvais de maturidade sexual leva 2-3 meses, e os adultos são pequenos vertebrados cerca de 3-4 cm de comprimento, tantos peixes podem ser mantidos em espaço mínimo 2. Além disso, os adultos zebrafish têm alta fecundidade, com cada peixe capaz de produzir várias centenas de embriões por semana 2. Estes atributos tornaram a rastreabilidade do peixe-zebra para frente e para trás telas genéticos. Zebrafish possuem um alto grau de conservação em sua anatomia, biologia celular e fisiologia, com mais espécies de vertebrados avançados, como os mamíferos 2,4. De facto, a análise da sequência recente demonstrou que o genoma do peixe-zebra contém homólogos a cerca de 70% dos genes humanos 5. Esta conservação tem possibilitado aos pesquisadores usar zebrafish como um modelo para inúmeras doenças humanas, incluindo tanto embrionárias e as condições de adultos 2,4. Tomados em conjunto, esses fatores fizeram zebrafish um excelente sistema para as telas o objetivo de identificar genes que sãoessencial para a ontogenia dos vertebrados normal. Um certo número de telas de grande escala foram efectuadas no peixe-zebra e foram identificados vários milhares de mutações em genes de desenvolvimento 6-8. O macho adulto zebrafish é passível de mutagênese e alterações cromossômicas podem ser gerados com freqüência relativamente alta usando o etilnitrosoureia mutagênico químico (ENU) 6,7 ou retroviral mutagênese insercional 9. Até o momento, mais de 9.000 mutações hereditárias foram criadas, e incluem genes que afetam praticamente todos os aspectos da embriogênese. A comunidade zebrafish estabeleceu um banco centralizado desses mutantes no Centro Internacional de Recursos Zebrafish (ou Zirc) 10, que reuniu cerca de 5.000 alelos mutantes e transgênicas de todo o mundo. Muitas destas mutações foram analisadas e clonado, dando a pesquisadores em todas as disciplinas biológicas informações valiosas que tem sido usado para provocar uma separação numeronos caminhos celulares e fisiológicos através dos conhecimentos provenientes de experimentos de peixe-zebra. Apesar de telas para a frente têm identificado um número impressionante de genes importantes, ainda tem muito a ser apreciado sobre as redes de regulação genética que medeiam uma infinidade de processos. Muitas telas realizadas até o momento não atingiu a saturação e, assim, para a frente, bem como telas genéticos reversa mantiveram uma pedra angular para identificar e analisar mecanismos de embriogênese. Embora existam perspectivas enormes que pode ser adquirida a partir de uma única linhagem mutante peixe-zebra, um importante fator de limitação no campo tem sido historicamente o esforço demorado envolvidos na clonagem posicional. Por esta razão, a identidade de várias mutações induzidas quimicamente tem permanecido um mistério. Contudo, com o advento recente de abordagens de sequenciamento do genoma inteiro que facilitam a clonagem rápida 11-14, identificação extremamente eficiente de mutações genéticas é agora feasible. O ecrã para a frente prototípico no peixe-zebra é uma tela diplóide que pode identificar mutações recessivas dentro de três gerações 6,7 (Figura 1, coluna da esquerda). Esta técnica envolve a geração de mutações nas células germinativas dos pais (P) do sexo masculino e, em seguida, este macho acasalar com uma fêmea tipo selvagem. Cada um dos descendentes da primeira geração (F1) a partir deste acasalamento irá abrigar uma ou mais mutações únicas devido às contribuições cromossômicos do genoma paterno mutado. A progênie F1 são levantadas e outcrossed com tipos selvagens para criar famílias F2. Na família F2, irmãos vai ser do tipo selvagem ou portadores heterozigóticos, e são incrossed aleatoriamente para gerar garras F3 que são analisadas quanto ao fenótipo (s) de interesse. As embreagens F3 de portadores heterozigotos irá conter 25% do tipo selvagem, 50% de heterozigotos e 25% peixe mutante homozigoto. Esse esquema de triagem multi-geracional é eficaz, no entanto, uma grande desvantagem para isso umstratégia inclui o tempo necessário para se preparar para a tela: pelo menos 1 ano de criação de peixe sozinho está envolvido, uma vez que cada geração requer cerca de 3 meses para atingir a maturidade sexual. Outras limitações deste tipo de tela diplóide são obra, espaço e custo da habitação essas gerações. A tela haplóide é uma alternativa que pode ser utilizada para identificar e subsequentemente isolar mutações recessivas utilizando estratégias de mutagénese semelhante 15 (Figura 1, coluna da direita). A produção de embriões de peixes-zebra haplóides foi descrita pela primeira vez há mais de 30 anos 16, e a capacidade de o peixe-zebra normalmente diplóide desenvolver durante vários dias com uma ploidia cromossómico haplóide foi utilizado para numerosos estudos genéticos uma vez que este tempo. A principal vantagem da tela haplóides é que este método não envolve cuidando das famílias F2, a fim de rastrear alelos mutantes recessivos. Em vez disso, as fêmeas geração F1 são avaliadas paraheterozigosidade de mutações recessivas no processo de interesse por análise da sua descendência F2 em estado haplóide (Figura 1, coluna da direita). Em geral, os passos para adquirir embriões haplóides são relativamente simples (Figura 2). Após a preparação das soluções necessárias para a manipulação de espermatozóides, os ovos são obtidos a partir de fêmeas de geração F1 por manipulação manual a fim de fazer a extrusão (ou &quot;apertar&quot;) os ovos da barriga. Uma vez que os ovos são obtidos, eles são fertilizados in vitro por exposição à luz ultravioleta (UV) do esperma inactivado. O esperma inactivado UV são incapazes de contribuir DNA viável para o ovo, devido ao facto de o comprimento de onda UV curto reticula o DNA paterno. No entanto, o esperma ainda são capazes de desencadear a actividade de ovo e os eventos associados com o desenvolvimento zigótica. Após a ativação metabólica, o ovo vai completar a meiose II, e prosseguir para desenvolver apenas com a uma cópia de cada maternalmente depositado chromosome. Devido a esta ploidia 1N, o embrião está sujeita às consequências para o desenvolvimento de um alelo mutante recessivo, se ele estiver presente num cromossoma materno. Assim, cada embreagem haplóides F2 irá conter 50% do tipo selvagem e 50% de embriões mutantes se a mãe é portadora heterozigótica de um alelo recessivo totalmente penetrante. Esta distribuição de genótipos embrionárias permite relativa facilidade em termos de avaliação da embraiagem para a presença do fenótipo mutante (s) de interesse. Se um tal fenótipo é detectado, o fundador fêmea geração F1 é subsequentemente outcrossed de tipo selvagem de peixe-zebra macho para criar e levantar mais portadores heterozigóticos. Porque não é necessário levantar várias gerações para executar a tela, o pesquisador pode economizar tempo considerável, trabalho e espaço de aquário, mas ainda tem o poder de examinar um número significativo de genomas com base no número de fêmeas F1 examinado. Assim, as telas haplóides são especialmente viável para pequenos laboratórios ou projetos iniciados no absence de um financiamento substancial. No entanto, existem várias limitações e desvantagens ao uso de haplóides. Primeiro, os embriões de peixe-zebra haplóides viver por apenas alguns dias, e, normalmente, morrem entre 3 e 5 dias após a fertilização (dpf) 15. Zebrafish embriões haplóides podem ser distinguidas de diplóides com base em várias características, acima de tudo entre eles, sendo um corpo curto e atarracado que, no entanto, tem o número normal de segmentos somito 15,17. Com o desenvolvimento, as exposições do cérebro aumentou a morte celular ea circulação é pobre, geralmente associado com o acúmulo de sangue por 2-3 dpf e edema 15,17. Além disso, haplóides não inflar uma bexiga natatória 15,17. Independentemente destas diferenças morfológicas, a maior parte dos principais órgãos e tecidos são formados, incluindo o coração, os olhos, e o notocórdio de 15,17. Uma característica notável sobre garras haplóides é que eles contêm uma variedade de fenótipos em termos de variedades de embriões defeituosos &amp; #8212; uma característica observada em todo cepas peixe-zebra. Assim, deve-se verificar se o tecido (s) e no ponto de tempo de interesse apresentam desenvolvimento razoavelmente normal na estirpe haplóide tipo selvagem e, por conseguinte, tem o potencial para ser avaliada quanto a defeitos genéticos em uma tela ou outro projecto de investigação. Apesar destes desafios, telas haplóides têm sido implementadas com sucesso para identificar genes necessários para os processos de desenvolvimento iniciais do peixe-zebra, e os protocolos de haplóides foram recursos bem estabelecido na comunidade por muitos anos 15-19. Mais recentemente, o processo de geração de embriões de peixes haplóides tem sido utilizado pelos investigadores para criar haplóide estaminais embrionárias (ES) a partir de culturas de células do peixe medaka 20,21. Após a produção de embriões haplóides medaka in vitro, foram utilizados os embriões para obter culturas de células primárias que foram passadas durante cerca de 15 semanas, seguidas por mais de 5-8 semanas, para gerar clones puros de células haplóides comPropriedades das células ES 15-19. A geração de linhagens de células haplóides peixes ES detém ampla promessa futura para analisar fenótipos recessivos em linhagens de células de vertebrados, e representa uma nova abordagem para a análise genética nos próximos anos. Assim, a geração de embriões de peixes haplóides tem aplicações crescente na comunidade de pesquisa biomédica. Este artigo de vídeo fornece uma demonstração visual dos passos envolvidos com a produção de embriões de peixes-zebra haplóides in vitro utilizando esperma inactivado por UV baseado em protocolos estabelecidos 15-19,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="797">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:364px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #1</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">Hank&#39;s Stock Solution #2</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #4</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Hank&#39;s Stock Solution #5</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Hank&#39;s Stock Solution #6</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hank&#39;s Final working solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Combine 9.9 ml of Hank&#39;s Premix with 0.1 ml HS Stock #6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XX-Series UV Bench lamp</td>
			<td style="width:99px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">95-0042-05</td>
			<td style="width:364px;">Model XX-15S Bench Lamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XX Bench Stand (Adjustable)</td>
			<td style="width:99px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">18-0062-01</td>
			<td style="width:364px;">Model XX-15 Stand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Embryo incubation dish</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:364px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">50 X E3</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 X E3</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:364px;">Dilute 50 X E3 in distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000</td>
			<td style="width:364px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization

O peixe-zebra tornou-se um modelo de vertebrados dominante que é relevante para muitas disciplinas de estudo científico. Zebrafish são especialmente adequadas para a análise genética para a frente dos processos de desenvolvimento, devido à sua fecundação externa, tamanho embrionário, ontogenia rápida e claridade óptica - uma constelação de traços que permitem a observação direta de eventos que vão desde a gastrulação a organogênese com uma lupa básico. Além disso, os embriões de peixe-zebra pode sobreviver durante vários dias no estado haplóide. A produção de embriões haplóides in vitro é uma ferramenta poderosa para a análise mutacional, pois permite a identificação de alelos mutantes recessivos presente na primeira geração (F1) portadoras seguintes mutagênese no pais (P) geração. Esta abordagem elimina a necessidade de elevar várias gerações (F2, F3, etc), que envolve a criação de famílias de mutantes, assim poupando o tempo de pesquisa juntamente com a reduçãoas necessidades de espaço para zebrafish colônia, o trabalho e os custos de criação. Apesar de peixe-zebra foram usados ​​para conduzir para a frente telas para as últimas décadas, tem havido uma expansão constante de transgênicos e genoma ferramentas de edição. Essas ferramentas oferecem agora uma infinidade de maneiras de criar ensaios nuances para as telas de próxima geração que podem ser usados ​​para dissecar ainda mais as redes de regulação gênicas que impulsionam vertebrados ontogenia. Aqui, descrevemos como preparar embriões de peixe-zebra haplóides. Este protocolo pode ser implementado para novas futuras telas haplóides, tais como em telas intensificadoras e supressoras, para abordar os mecanismos de desenvolvimento de um largo número de processos e de tecidos que se formam durante estágios embrionários iniciais.

A produção de embriões haplóides podem ser implementados para identificar mutações recessivas na geração F2 quando os haplóides são obtidos a partir de fêmeas de peixe-zebra maduros que são a descendência de pais mutadas (Figura 1). Isso economiza tempo e espaço em comparação com a tela diplóide tradicional, em que os pesquisadores precisam criar famílias F2 cuja descendência diplóide são então avaliados para fenótipos de interesse (Figura 1). As principais etapas do protocolo descrito nos Passos 1-5 acima para a obtenção de embriões de peixes-zebra haplóides por fertilização in vitro está esquematizado como um fluxograma (Figura 2). Essas etapas envolvem a preparação de soluções e priming de fêmeas pela exposição aos hormônios masculinos em tanques de acasalamento (dia 1), seguidos de esperma e obtenção de óvulos e fertilização in vitro (dia 2), e, finalmente, a criação dos haplóides (Dias 3-5) (Figura 2). Quando comcombinada com uma tela de genética, um procedimento comum mutagênese no peixe-zebra inclui exposição prévia dos zebrafish adultos tipo selvagem do sexo masculino para um agente mutagênico (por exemplo, a um agente mutagênico químico como ENU, embora outros procedimentos, tais como mutagênese retroviral baseado podem ser implementadas, que também facilitar a clonagem do defeito cromossómico), seguido por cruzamento com fêmeas do tipo selvagem para criar uma geração F1 mutagenizado. Tais preparações requerem vários meses de trabalho (cerca de 6 meses) com base nos tempos de geração necessários para tipos selvagens traseiros, execute mutagênese e traseira subsequente mutado F1 15,17,22. Outro ponto importante a considerar na contratação haplóides para uma tela é a escolha de tensão peixe-zebra. A AB * (AB estrela) a tensão tornou-se conhecida pela produção de embriões haplóides com melhores características gerais e de saúde do que outras linhagens 15. No entanto, na estirpe Tubingen derivado produzido no nosso laborahistória, temos observado recentemente características embriológicas que permitiram telas de sucesso para anomalias de desenvolvimento do sistema renal (G. Gerlach e R. Wingert, não publicado). Mediana de peixe-zebra machos da estirpe Tuebingen foram mutagenizados através de uma série de três tratamentos ENU, e depois cruzados com o tipo selvagem fêmeas Tuebingen para gerar uma geração F1 para o rastreio. As fêmeas F1 foram espremidas para obter ovos e esses ovos F2 foram fertilizados com o esperma UV inativado. Comparado com garras diplóides obtidos por acasalamento natural de tipo selvagem Tuebingen pais (Figura 3A), os embriões nestes garras estirpe haplóide Tuebingen exibido um mais curto, encorpado característica tronco do estado haplóide (Figuras 3B e C). Além disso, embraiagens haplóides consistem tipicamente de irmãos de embriões que apresentam uma série de defeitos, o qual observou-se assim (Figuras 3B e C), que é conhecida por variar dentro de estirpes, como será discutido mais abaixo de 15,17. </p&gt; Estudos anteriores já haviam estabelecido uma série de classificação canônica, correspondendo aos graus de A a D, para categorizar o leque de haplóides defeitos fenótipo 15,17, e, adicionalmente, haplóides também têm sido referidos em termos dos adjetivos bom, intermediária e baixa qualidade 22. Haplóides Grau A, correspondendo a haplóides de alta qualidade, são os mais normais na aparência, com um corpo curto e atarracado, mas mostram em geral um aspecto morfológico semelhante ao diplóides 15,17,22 (compare irmãos diplóides (D) para haplóide grau A (rotulado A) irmãos, Figura 3B). Embriões haplóides classe A também desenvolvem edema pericárdico modesto, o que é uma característica típica do desenvolvimento do peixe-zebra haplóides 15,17,22 (Figura 3B). Em comparação com haplóides grau A, intermediário ou o chamado grau B embriões haplóides (rotulada B, Figuras 3B, C) ​​são distinguidos pelo desenvolvimento de um / twis ainda mais reduzido ou torcidated tronco, apesar de características de uma cabeça e cauda são claramente distinguíveis 15,17,22. Finalmente, o grau de C ou de má qualidade haplóides (também referidos em algumas referências como C / D) 15,17,22 são extremamente deficiente e exibir uma massa desordenada de células em associação com uma bola de gema (marcado C, Figura 3C). Mesmo entre a mesma estirpe, embraiagens haplóides variar a distribuição de A, B, e C fenótipos que se irá observar. Por exemplo, a embraiagem haplóide de uma fêmea Tubingen exibida melhor desenvolvimento geral, principalmente com A e B de grau prole haplóides (Figura 3B) em comparação com haplóides obtidos a partir de uma segunda fêmea Tubingen, cuja embraiagem consistia de numerosos grau C prole haplóides, bem como um e fenótipos haplóides B (Figura 3C). Tensão variabilidade semelhante de notas de embriões haplóides foram previamente observadas em AB e AB * peixe tensão, bem 15. Apesar destes mordiferenças morfológicas, organogênese de muitas estruturas procede relativamente normal no embrião haplóide. Apesar de terem um corpo mais curto tronco, desenvolvimento de órgãos como o coração e os olhos é relativamente semelhante à de tipo selvagem embriões diplóides, e tipos de células, tais como células de pigmento (melanóforos e xantóforos) também pode ser avaliado 15. Além disso, já documentada recentemente que os pronefros, ou de rim embrionário, é desenvolvido por 1 dia após a fertilização no haplóide tipo selvagem, de modo semelhante ao do tipo selvagem diplóides. Como prova disso, o tipo de célula pronefros padronização apresenta o padrão de protótipo de segmentos (Figura 4). Além disso, o fenótipo de mutações recessivas que alteram o desenvolvimento pronefros, tais como a mutação lib que reduz a produção de ácido retinóico, apresentam um padrão semelhante no estado haplóide em comparação com o estado diplóide (Figura 4) 23,24. Esta observação está de acordo com a de outros recessãosive mutações que levam a fenótipos semelhantes, tanto na condição haplóide e diplóide, embora isso nem sempre é o caso com todas as mutações e deve ser mantido em mente se avaliar esse tipo de estratégia de tela de 15. Um certo número de tecidos e órgãos são geralmente anormal em haplóides. Por exemplo, haplóides apresentar defeitos em circulação, geralmente exibem o acúmulo de sangue, o que pode fazer a sua capacidade de estudar alguns aspectos da vasculogênese limitado 15. Além disso, constatou-se que pode ter haplóides irregularidades no desenvolvimento da orelha, de tal forma que eles podem ser avaliadas quanto a mutações que impedem totalmente a formação de vesícula ótica, mas não por mutações que afectam processos penetrantes envolvidos com morfogénese desta estrutura 15. Como outro exemplo disso, a morfogênese do cérebro é anormal em haplóides, e, portanto, telas haplóides para identificar as vias de desenvolvimento do cérebro necessárias são limitados 15. Apesar destas limitações, o nosso análise do desenvolvimento renal no estado haplóide (Figura 4) adiciona este órgão para a lista de estruturas embrionárias &#39;rastreï&#39;. Esta descoberta destaca que uma metodologia tela haplóides pode ser usada para dissecar os componentes genéticos de padronização renal progenitor e adiciona ênfase ao sentimento que as abordagens de tela engenhoso pode contornar as limitações da ontogenia embrião haplóide de descobrir valiosos novos modelos mutantes para estudar o desenvolvimento dos vertebrados 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Esquemático de estratégias de tela diplóides e haplóides no modelo de peixe-zebra. Seguir à mutagénese de geração parental, a geração F1 pode ser levantada e usada ou para gerar famílias mutante F2, que são utilizadas para pesquisar a geração F3 num estado diplóide (esquerda ) ou diretamente da telaed em uma estratégia de haplóides (direita). Em uma tela de haplóides, as fêmeas sexualmente maduros geração F1 são usados ​​para coletar garras F2 haplóides para análise genética. Portadores heterozigotos do sexo feminino são identificadas se cerca de metade dos haplóides F2 apresentam um fenótipo mutante (embriões vermelhas) em comparação com os irmãos haplóides tipo selvagem (embriões amarelo). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. Haplóide embrião produção fluxograma. As principais etapas de fertilização in vitro para a produção de embriões haplóides são esquematizadas como tarefas realizadas no dia 1 (caixas-de-rosa) para preparar soluções de esperma e adultos principais zebrafish fêmeas, tarefas realizadas no dia 2 (caixas de laranja ) para coletar e inativar UV esperma, para coletar ovos, para fertilizar os ovos com o esperma UV inativado para gerar haplóides, e, em seguida, para reviver a mãe do sexo feminino, e finally tarefas realizadas em dias subseqüentes 3-5 (caixa amarela), quando as garras são incubados até o ponto de tempo desejado (s) de observação e análise. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig3highres.jpg" width="300" /> Figura 3. Comparação de Tübingen embriões de peixe-zebra tensão diplóides e haplóides. A) de tipo selvagem embriões diplóides foram produzidos por desova natural e, em seguida, incubadas, até cerca de 30 hpf. B, C) ​​haplóides embriões de tipo selvagem foram produzidos por fertilização in vitro de garras obtidos a partir de fêmeas de geração F1 mutagenizadas com esperma inactivado por UV, e incubadas até aproximadamente 30 hpf. Haplóides exibiu uma gama de anormalidades no desenvolvimento em comparação com embriões diplóides tipo selvagem (setas pretas, d para indicar diplóide). Haplóides relativamente normal teve uma encurtada, mais corpo estoque análogo ao sistema de classificação deum A haplóide 15 (setas vermelha, um marcado), enquanto haplóides com anomalias exibiu um eixo do corpo severamente truncadas (setas roxas, B marcado) que corresponde a um grau de B, e por fim o grau C (setas azuis, C etiquetado) baseado descrições publicadas 15. Todos os embriões foram fotografados ao vivo com uma ampliação 2.5X. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Padronização do desenvolvimento de tipos de células que compõem o pronefros embrionário órgão renal em haplóides zebrafish tensão Tübingen. Tipos selvagens haplóides exibido um padrão normal de tipos de células na estrutura renal embrionário (top de linha). O rim embrionário consiste de um par de unidades funcionais segmentados conhecidos como nefrónios. O padrão segmentado de tipos de células distintas presentes em néfrons podem ser visualizados com base em todo o monte <em&gt; hibridização in situ padrão de transcritos do gene que são exclusivas para os tipos de células diferenciadas de néfrons, que incluem os podócitos (P) marcados por wt1b e nephrin expressão, o túbulo contornado proximal (PCT) marcado por slc20a1a, o túbulo proximal reta (PST ) marcado por TRPM7, o distal precoce (DE) marcado por slc12a1 e túbulo distal tarde (DL) marcado por slc12a3. embriões haplóides lib mutantes (podocytes linha inferior) exibição reduzidos, PCT e um PST ausente, juntamente com uma DE expandida e segmento DL, semelhante a embriões diplóides lib 18. Os embriões foram fotografados numa vista dorsal, com a anterior, para a esquerda, com uma ampliação de 10X.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization at JoVE.com

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

24.4K visualizações.  University of Notre Dame. The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Vídeo: Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...