Os autores gostariam de agradecer aos membros do pessoal da Facilidade Deakin University Zebrafish para a prestação de cuidados de criação excelente curso. YG é apoiado por uma Bolsa de Investigação Alfred Deakin pós-doutorado e um Grant Central de Pesquisa da Universidade Deakin. SLM é apoiado por uma Bolsa NHMRC Desenvolvimento de Carreira. ACW é apoiado por um Grant NHMRC de habilitação. Todos os autores são suportados pelo Molecular e Centro Médico de Pesquisa de Pesquisa Estratégica da Universidade Deakin.

Parte 1: Tratamento Químico de Embriões Zebrafish <ol><li> Coletar embriões zebrafish após a fertilização. Incubar a 28,5 ° C em meio de Nota E3 em 100 x 15 milímetros pratos de Petri:. Para a hibridização in situ ou óleo-Red-O coloração, 1-fenil-2-tioureia (PTU) a uma concentração final de 0,2 mM é adicionado a inibir a formação de pigmentos, 1, mas não é necessário para a análise Seahorse. </li><li> Para os estudos farmacológicos, adicione a química requerida para uma concentração final adequada para o desenvolvimento de embriões de peixes-zebra a cerca de 26 hr pós-fertilização (hpf), com uma nota de veículo somente para o controlo adequado:. Sensíveis à luz, para inibidores farmacológicos, os embriões podem ser autorizados a desenvolver em o prévio escuro para análise. </li></ol> Parte 2: Perfil Metabólico ao vivo usando o cavalo marinho XF 24 Analyser <ol><li> Antes de cada corrida, o cavalo marinho XF cartucho Analyser 24 que abriga o 2 O e H <saté&gt; + fluoróforos é calibrado por meio de um processo automatizado realizada pelo analisador. </li><li> Preparação da placa de 24 poços de ilhotas XF 24. A seguinte seqüência experimental é empregado: <ol><li> Uma vez que o consumo de oxigénio é sensível a variações de temperatura, quatro poços são usadas para controlar as flutuações de temperatura possíveis através da placa. Estes poços não contêm embriões, mas são preenchidos com 700 ul de meio E3 (Figura 2A). </li><li> Os restantes 20 poços (ver parte 2.2) são preenchidos com 700 ul de meio E3 e um embrião cada (Figura 2B). </li><li> Para cada experiência, 10 embriões foram tratados com o veículo apenas (controlo) e 10 tratados com o inibidor químico (tratado). Embriões de controlo e tratado são alternados (por exemplo, bem A2: embrião de controlo; bem A3: embriões tratados com: A4 bem: embrião de controlo; embrião A5 assim tratado, etc.) </li><li> Uma captura de tela ilhota é adicionado no topo da. cada poço para assegurar que a amostra se mantenha na câmara de medição em todo o ensaio (Figura 2B) Nota: tratados quimicamente embriões permanecem com a solução química original durante todo o processo, sem a necessidade de lavar o produto químico, antes de executar o analisador Seahorse programa. </li><li> Uma vez terminado, a placa é carregada no Analyser Seahorse e o ensaio é iniciado. </li></ol></li><li> A análise de amostras. Dois ensaios diferentes são rotineiramente realizados. <ol><li> Programa de respiração basal respiração / Máximo (duração de aprox. 90 min). Alterações na respiração basal subjacente disfunção metabólica, enquanto que a respiração máxima é uma medida da capacidade total de produção de energia e as alterações neste parâmetro associado com um número de estados patológicos e fisiológicos tanto. A capacidade respiratória de reserva, ou a capacidade para o sistema para aumentar a produção de ATP, é também calculadaa partir deste teste pela subtração dos basal de respiração máxima. Três repetições de cada mistura (2 min) / espera (1 min) / medição (2 min) ciclo é realizado para estabelecer primeiro respiração basal. No final do terceiro ciclo, a uma concentração final de 2,5 uM de FCCP (mitocondrial protonophore / desacoplador) é adicionado a cada poço permitindo a medição da respiração máxima. O ciclo de medição é então repetido 5-8 vezes (Figura 3). </li><li> ATP programa vazamento de volume de negócios / Proton (duração aprox. Min 60). Respiração devido ao volume de negócios ATP representa a principal função da mitocôndria na forma de produção de ATP, enquanto a respiração devido a vazamento de prótons, ou respiração desacoplado, está intimamente ligado com outros parâmetros da função mitocondrial, incluindo respiração basal e formação de espécies reativas de oxigênio. Respiração devido à rotação de ATP é representada pela diferença de respiração após a adição de 25 uM oligomicina (um inibidor do ATP-sintase), em comparação com a respiração basal. Respiração desacoplado, ou respiração devido a fugas de protões, é determinada através do cálculo da diferença entre a oligomicina mediada respiração e respiração após a adição de 25 uM rotenona (um inibidor do complexo I). Ciclos de medição são repetido 8 vezes, após a adição de cada um inibidor mitocondrial. </li></ol></li></ol> No final dos ensaios, os valores médios de controlo 10 e 10 embriões tratadas quimicamente são calculados. Parte 3: Oil-Red-O Coloração <ol><li> Os embriões a 50 hpf são dechorionated utilizando uma pinça fina e fixadas em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C. </li><li> Oil Red-O-coloração é realizada, tal como anteriormente descrito 2 (ver Figura 4). </li></ol>

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	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Zebrafish é um modelo bem estabelecido genético para a frente (ENU mutagénese) e reverso (Tilling, dedo de zinco nuclease específica de knock-out, knockdown morfolino) abordagens genéticas 3,4, enquanto que a função do gene em embriões de peixe-zebra também podem ser facilmente bloqueados ou activados selectivas compostos farmacológicos específicos para os produtos codificados. Devido ao seu desenvolvimento e externo pequeno tamanho, de embriões zebrafish são particularmente adequadas para análise metabólica. No entanto, a medição do perfil metabólico robusto e função mitocondrial in vivo em embriões de peixe-zebra não tenha sido alcançado, com apenas uma descrição preliminar relatada 5. Análise Seahorse foi originalmente concebido para os estudos baseados em células metabólicas e tem sido demonstrado para dar resultados precisos e fiáveis ​​6. A aplicação desta nova metodologia de embriões zebrafish é significativo, e provavelmente para aumentar o uso mais amplo deste modelo para estudos metabólicos. Neste estudo, demonstramos a medição de uma série de parâmetros da respiração em embriões de peixes-zebra usando o Analisador Seahorse, incluindo respiração basal, respiração máxima, a capacidade respiratória de reposição, o volume de ATP e vazamento de prótons. Também fornecemos um exemplo de como tais medições podem ser correlacionados com outros parâmetros fisiológicos, neste caso, acumulação de lípidos e da utilização de inibidores farmacológicos neste sistema de ensaio. Combinado com o uso de embriões geneticamente alterados, isso proporciona uma poderosa plataforma experimental para a compreensão de fatores que impactam sobre o metabolismo. Há uma variedade de aplicações para esta nova metodologia, com a disfunção mitocondrial está implicada em muitas doenças humanas, tais como Diabetes mellitus 7, obesidade 8, esclerose múltipla 9, doenças de Parkinson 10, a doença de Alzheimer 11 e algum tipo de cancros 12. É importante ressaltar que our trabalho é realizado in vivo, em que todas as influências ambientais - tais como as citoquinas, o desenvolvimento relacionado com o crescimento, etc - são activas, proporcionando assim uma vista fisiologicamente relevante na respiração vivo e metabólico. Como telas químicas também são rotineiramente realizados em tipo selvagem e mutantes de peixe-zebra embriões de fundo (Figura 1), produtos farmacêuticos novos que influenciaram a respiração, função mitocondrial ou metabolismo possam ser facilmente identificados utilizando o analisador Seahorse. Os resultados obtidos utilizando o analisador Seahorse poderia ser usado em conjunto com outros ensaios para fornecer informações adicionais. Isto pode incluir a análise fisiológico, tais como óleo de coloração vermelho-, ou a análise molecular, tais como hibridação in situ por adipócitos marcadores específicos tais como cebpα, PPARa, PPARy, etc FAS Restam algumas limitações para esta metodologia. Embora nós e outros foram capazes de usar a medição oligomicinaure produção de ATP e de vazamento de protões em embriões jovens 5 (ver Figura 3), em embriões com mais de 60 tratamento oligomicina hpf é ineficiente. Acreditamos que em embriões mais antigos oligomicina não pode difundir tão facilmente do que em embriões jovens que fazem os resultados impossíveis de interpretar. Como os resultados oligomicina são obrigatórios para a determinação da respiração devido à ATP volume de negócios e respiração desacoplado, estamos investigando maiores concentrações de oligomicina de embriões mais velhos. No entanto, antimicina A tratamentos eficazes permanecem por mais tempo, com outras medidas, tais como a respiração basal, respiração e da capacidade respiratória máxima de reposição, podem ser realizados em embriões mais velhos zebrafish, até 68 hpf (não mostrado). Outra limitação na utilização da configuração corrente Analyser Seahorse é o espaço físico no interior de cada uma das placas de captura de ilhota bem, de tal forma que eles só são adequados para os embriões zebrafish e larvas jovens. Portanto, a realização MetabolEstudos sobre ic obesidade induzida por dieta, em peixes adultos, por exemplo, ainda não é tecnicamente viável. No entanto, este estudo pode propiciar o desenvolvimento de placas projetadas especificamente para juvenis e adultos, ampliando assim o escopo de análises possíveis.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> XF 24 analisador de fluxo extracelular </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> 24 formato bem </td></tr><tr><td> Islet microplaca de Captura </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> 24 formato bem </td></tr><tr><td> XF solução de calibração </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF Médio Ensaio </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Oil-Red-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-fenil-2-tioureia (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (médio embrionário) </td><td> Self made </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100X15 milímetros placas de Petri </td><td> Falcão </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomicina </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

A meta de crescimento no campo do metabolismo é determinar o impacto da genética em diferentes aspectos da função mitocondrial. Compreender essas relações vão ajudar a entender a etiologia subjacente para uma série de doenças relacionadas à disfunção mitocondrial, como diabetes e obesidade. Os recentes avanços na instrumentação, tem permitido o monitoramento de parâmetros distintos de função mitocondrial em linhas de células ou explantes de tecido. Aqui apresentamos um método para uma análise rápida e sensível de parâmetros da função mitocondrial in vivo durante o desenvolvimento embrionário zebrafish utilizando o cavalo marinho de biociências XF 24 analisador de fluxo extracelular. Este protocolo utiliza o Captura Islet microplacas onde um único embrião é colocado em cada cavidade, o que permite a medição da bioenergética, incluindo: (i) a respiração basal, (ii) da respiração mitocondrial respiração basal (iii) mitocondrial devido à rotação de ATP, (iv) mitocondrial respiração desacoplado ou prOton vazamento e (iv) a respiração máxima. Utilizando esta abordagem parâmetros da respiração zebrafish embrionárias podem ser comparadas entre o tipo selvagem e os embriões geneticamente alteradas (mutante, a sobre-expressão do gene ou gene knockdown) ou aqueles manipulado farmacologicamente. Prevê-se que a disseminação de este protocolo irá proporcionar aos investigadores novas ferramentas para analisar a base genética de doenças metabólicas in vivo neste modelo relevante vertebrado animal.

<html> Estamos interessados ​​em compreender o papel de genes específicos no metabolismo, especialmente a taxa de respiração e metabolismo lipídico. Portanto, tratamos os embriões zebrafish tipo selvagem a partir de 26 em diante HPF com um inibidor específico farmacológico da enzima codificada por um destes genes. Aos 50 hpf, metade do veículo e tratados com inibidor embriões foram analisados ​​utilizando o Seahorse para a função mitocondrial, enquanto a outra metade foi fixada em 4% de PFA durante a noite a 4 ° C e subsequentemente coradas durante a deposição de lípidos com Oil Red-O-. O tratamento com o inibidor da enzima específica conduziu a ~ um aumento de 2 vezes na respiração basal (Figura 4A), a qual estava associada a um aumento da deposição de lípidos, especialmente no telencéfalo e debaixo da vesícula ótica (Figura 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Representação esquemática do tratamento químico de embriões de zebrafish. Selvagem, geneticamente manipuladas, ou farmacologicamente tratada embriões zebrafish são de fundo. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Figura 2. XF24 placa ilhota configurado. (A) contêm quatro poços médio embrionário apenas como controlo de temperatura (marcado por um X) e os outros contêm um embrião / cavidade. (B) Close-up de um bem (C6) mostrando um 50 hpf embrião tipo selvagem tratados com o veículo (DMSO) coberto por uma tela de captura ilhota (seta). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Figura 3. Respiratparâmetros de iões de tipo selvagem 50 embriões zebrafish HPF. (A) Para cada medição, a média dos 20 embriões individuais são apresentadas. Respiração basal (média: 299,7; DP: 75,7; SEM: 16,9), respiração máxima (média: 387,4; DP: 93,3; SEM: 20,9), Capacidade respiratória Spare (média: 87,7; DP: 72,0; SEM: 16,1). (B) Para cada medição, a média dos resultados individuais 20 é apresentado. Respiração mitocondrial basal; respiração mitocondrial devido a ATP volume de negócios; respiração mitocondrial desacoplada e não-mitocondrial respiração. MT: mitocondrial; SRC: a capacidade respiratória Spare, DP: Desvio Padrão, SEM: erro padrão da média. Os resultados são apresentados em pmol de O 2 consumido / min / embrião. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Repreresultados representativos da exposição a substâncias químicas sobre a respiração basal e deposição de lípidos. (A, B) de embrião de hpf 50 coradas com Oil Red O, em vista lateral. O embrião incubado com o inibidor selectivo (B) mostra a coloração mais Oil Red-O-, no telencéfalo (ponta de seta) e por baixo da vesícula ótica (seta) em comparação com um embrião de controlo tratado com veículo. (C) mostra uma respiração Basal ~ 2 vezes de aumento em embriões quimicamente tratado (n = 10 embriões por grupo). Os resultados são apresentados em pmol de O 2 / min / embrião.

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Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Zebrafish representam um modelo de vertebrados poderosa que tem sido sub-utilizado para estudos metabólicos. Aqui descrevemos uma forma rápida para medir a<em&gt; In vivo</em&gt; Perfil metabólico de zebrafish desenvolvimento que permite a comparação dos diferentes parâmetros da função mitocondrial entre geneticamente ou farmacologicamente embriões manipulados, aumentando assim a aplicabilidade deste organismo.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.9K visualizações.  School of Medicine, Deakin University. Zebrafish representam um modelo de vertebrados poderosa que tem sido sub-utilizado para estudos metabólicos. Aqui descrevemos uma forma rápida para medir a In vivo Perfil metabólico de zebrafish desenvolvimento que permite a comparação dos diferentes parâmetros da função mitocondrial entre geneticamente ou farmacologicamente embriões manipulados, aumentando assim a aplicabilidade deste organismo.

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Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...