Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.

1. Preparação de instrumentos e soluções de trabalho <ol><li> Preparar a solução de água de peixe. Faça uma solução estoque, dissolvendo 2 g de &quot;Instant Ocean &#39;sais do mar em 50 ml de água destilada. Adicionar 1,5 ml de caldo de peixe de água para 1 L de água destilada para preparar pronto para usar água de peixe (sais do mar de 60 mcg / mL concentração final). Autoclave o pronto para usar água de peixe antes do uso. Esta solução é utilizada como meio de embriões de peixe-zebra. </li><li> Prepare metilcelulose para montagem embrião. Dissolve-se 1,5 g de metilcelulose em 50 ml de água estéril peixe. Facilitar a dissolução por meio de um ímã em uma placa de agitação. A dissolução completa do pó pode requerer várias horas. Verifique a solução para maior clareza e alíquota em pequenos tubos. Armazenar a -20 ° C durante meses e descongelar alíquotas a utilização. Centrifugar a metilcelulose a 950 xg por 5 min antes de usar. Evite ciclos de congelamento e descongelamento de alíquotas. </li><li> Preparar 50 ml de tricaina / acetato de 3-aminobenzoato msal etanossulfonato (solução mãe) por dissolução de 200 mg de tricaina em 100 ml de água e ajustar o pH para 7,0 utilizando Tris-HCl 1 M (pH 9). Guarde este estoque a 4 ° C por não mais do que 30 dias. CUIDADO: tricaina é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas. </li><li> Indução de estresse oxidativo em embriões de peixe-zebra <ol><li> Prepare uma solução oxidante para a indução do estresse oxidativo genérico: Faça 50 ml de solução oxidante adicionando H 2 O 2 solução estoque (peróxido de hidrogénio; 100 mM) de água de peixe. Use H 2 O 2 de uma concentração final entre 2 mM e 100 mM. Preparar esta solução pouco antes do uso. A solução oxidante pode ser aplicada a de detecção de ROS tanto todo monte e unicelulares métodos de detecção de ROS. Não guarde esta solução. CUIDADO: H 2 O 2 é perigoso e nocivo por inalação e ingestão. O contato com material combustível pode provocar incêndio. Manipular sob um exaustor e desgaste pers apropriadasequipamentos de proteção onal. </li><li> Prepara-se uma solução oxidante para a indução de stress oxidativo derivado de mitocôndrias: Preparar uma solução de estoque de oxidante (5 mM), por dissolução de 3,9 mg de rotenona em 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Manter esta solução à temperatura ambiente no escuro. <ol><li> Dissolva solução estoque rotenone a 10 ml de água de peixe para fazer uma solução pronta a usar. Use rotenona a uma concentração entre 5-50 uM. Não utilizar rotenona em concentrações superiores a 100 uM. Com concentrações adequadas, esta solução oxidante pode ser aplicado para a detecção de ROS tanto conjunto de montagem e de uma única célula de métodos de detecção de ROS. ATENÇÃO: A rotenona é tóxico e perigoso. Manuseie de acordo com declarações de precaução apropriadas. </li></ol></li><li> Induzir o estresse oxidativo por gene knock-down: Knock-down expressão do gene em embriões de peixe-zebra nrf2a por morfolino microinjeção como previamente relatado por Timme-Laragy A. et al, 2012 38.. </li><li> Induzir o óxidoative o estresse após dano tecidual: gerar uma margem ferida na barbatana caudal de embriões de peixes-zebra em 72 hpf como previamente descrito por Niethammer et al, 2009 39.. </li></ol></li><li> Prepare 5 ml de solução de detecção de ROS para uma única célula método de detecção de ROS: <ol><li> Solução para a detecção de ROS geral: Dissolve-se a sonda molecular ROS-sensível genérico em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hanks) a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-10 uM). Esta solução deve ser preparada logo antes do uso. </li><li> Solução para a detecção específica ROS induzida pela mitocôndria: Pouco antes de usar, dissolver uma sonda ROS-sensível mitocondrial com DMSO fazer uma solução estoque 5 mM. Dissolve-se uma solução estoque em HBSS a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-10 uM). NOTA: Evite a luz e oxigênio exposição de soluções de trabalho de detecção de ROS e suas respectivas soluções estoque. Proteger o tubo de luz usandouma folha de alumínio. Não guarde ou reutilização sondas dissolvidos em HBSS. Armazenar as soluções de reserva, a -20 ° C durante um mês. CUIDADO: Manuseie sondas moleculares e DMSO sob um exaustor de acordo com as orientações adequadas. </li></ol></li><li> Prepare 5 ml de solução de detecção de ROS para todo o método de detecção de ROS montagem: Dissolve-se a solução estoque sonda ROS-sensível genérico (estabilizado em DMSO) em HBSS a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-5 uM). Evite luz e exposição ao oxigênio. Proteger o tubo da luz. Preparar esta solução antes da utilização. Não guarde ou re-utilizar esta solução. CUIDADO: Manuseie sondas moleculares sob um exaustor de acordo com as orientações adequadas. </li><li> Adicione 25 mL de solução de paragem através da adição de 10 ml de soro fetal de bovino a 15 ml de PBS 1x. Mantenha solução estéril. Conserva-se a solução a 4 ° C. Esta solução é necessária apenas para única célula - método de detecção de ROS. </li><li> Defina a incubadora de ar zebrafish a 28 e# 176; C. </li><li> Definir a centrífuga a 4 ° C durante a célula único método de detecção de ROS. </li></ol> 2. Acasalamento de peixes adultos e Seleção de embriões Zebrafish <ol><li> Defina-se peixes-zebra adultos par atravessa de acordo com protocolos padrão 40. Selecione a linha transgênica adequado, de acordo com as necessidades específicas experimental. </li><li> Recolher os ovos e coloque-os em um prato de 90 mm, com média de água de peixe / embrião. Mantenha os ovos a 28 ° C até que os embriões irão desenvolver e crescer até o estágio desejado de desenvolvimento (por exemplo, 48 hpf, 72 hpf; hpf: horas após a fecundação). </li><li> Tela para o desenvolvimento de embriões. Excluir todos os ovos não fertilizados ou embriões subdesenvolvidos. </li><li> Anestesiar embriões, adicionando 1 ml de tricaina (solução estoque) em 50 ml de água de peixe. </li><li> Selecione embriões fluorescentes Tg sob microscópio estereoscópico. </li></ol> 3. Tratamento de embriões com agente oxidante <ol><li> Use pelo menos 30 embriões entre 48 hPF e 72 HPF por condição diferente. Lave embriões duas vezes com água de peixe fresco, a fim de remover tricaina. </li><li> Dividir embriões fluorescentes em três pratos. Coloque no máximo 30 embriões / prato. </li><li> Remover a solução de lavagem e adicionar 10 ml da solução de oxidante ou 10 ml de água de peixe como solução de controlo. </li><li> Incubar os embriões durante 10 min para 1 hora a 28 ° C. O período de incubação depende do nível do stress oxidativo para ser induzida em tecidos específicos. Períodos curtos são a melhor como as células afetadas pelo estresse oxidativo submeter progressivamente a morte celular. </li><li> Transferência de embriões em um novo prato contendo HBSS e embriões de lavagem por agitação. HBSS pré-quente a 28 ° C. </li></ol> 4. Whole Método de Detecção Monte ROS <ol><li> Coletar embriões após o tratamento oxidante e colocar não mais de 10 embriões em um pequeno tubo. Lavar com HBSS, tanto quanto possível. Proteger o tubo de luz usando papel alumínio. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de detecção de ROScada tubo. </li><li> Incubar os embriões no escuro durante 15 min a 28 ° C para evitar a exposição à luz. </li><li> Durante o tempo de incubação preparar uma lâmina de vidro para análise embrião todo. Coloque 300 ml de metilcelulose em uma &quot;depressão&quot; lâmina de vidro e espalhe-o sobre a superfície de vidro com uma ponteira. Evite bolhas ao liberar a metilcelulose. </li><li> No final do tempo de incubação, retirar imediatamente a solução de detecção de ROS e lavagem por duas vezes com 2 ml de HBSS. Lavar embriões invertendo o tubo várias vezes. Não pipeta ou vortex. </li><li> Embriões Aspirar para cima em uma pipeta de Pasteur de vidro. Embriões posição perto da abertura da pipeta e suavemente ejetamos em metilcelulose. Orientar os embriões de forma adequada com uma linha de nylon fina. </li><li> Comparar a fluorescência de embriões de controlo, com os embriões tratados. Alternativamente, fixar parâmetros do microscópio estereoscópico fluorescência ou microscópio confocal para que todos os embriões são fotografadas usando o mesmoconfigurações de imagem. </li></ol> 5. Single Cell Método de detecção de ROS <ol><li> Comece a partir do passo: 3.5. Certifique-se de ter pelo menos 35 embriões para cada condição. </li><li> Transferência de embriões em um novo prato. Retire a água de peixe, tanto quanto possível. Adicionar 10 ml de PBS gelado 1x e 400 l de Inibidores da Protease Cocktail. Dechorionate manualmente embriões com uma pinça e retire o saco vitelino com uma agulha fina. Nota: A remoção saco vitelino garante amostras limpas para a seguinte análise FACS. Esta etapa pode ser evitada de acordo com instrumento FACS. </li><li> Transferência yolked-de embriões em uma placa de 24 poços com vários poços (15 embriões / poço) e retire toda a água dos peixes. </li><li> Adicionar 300 uL de HBSS, 30 ul de colagenase P, 50 ul de Tripsina-EDTA em cada poço. </li><li> Homogeneizar embriões cuidado pipetando para cima e para baixo com uma ponteira apertado (1.000 mL). </li><li> Incubar a 28 ° C durante 20 min e homogeneizar por pipetagem de amostras a cada 5 min. </li><li> Verifique DISR tecidouption, observando-se uma alíquota de homogeneizado no microscópio composto. Facilitar a suspensão única célula por pipetagem. Não incubar os embriões por mais de 30 min. </li><li> Parar a reacção adicionando 200 mL de solução de paragem. Misture com cuidado pipetando. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de pré-refrigerada com fundo apertado. Mantenha o tubo em gelo e evitar a exposição à luz. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 250 xg, a 4 ° C. </li><li> Retire a fase superior e re-suspender as células com gelo frio HBSS com cuidado pipetando. </li><li> Contagem de células e certifique-se de ter o mesmo número de células em todas as suas amostras. Não use menos de 2 x 10 6 células. </li><li> Centrifugar células durante 5 min a 250 xg a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e suspender a pelete com 1 ml de gelo gelou HBSS contendo a sonda ROS-sensível. </li><li> Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 3 min, no escuro. Tempo de incubação variam de acordo com o nível de stress oxidativo e à tele sensibilidade da sonda. </li><li> Transferir as células para um tubo de FACS. Manter tubos em gelo e evitar a exposição à luz antes da análise FACS. </li><li> Classificar células com um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS). Conjunto de comprimentos de onda, de acordo com a fluorescência da Tg do tecido (por exemplo, GFP) e os espectros de excitação / emissão de sonda molecular utilizado para a detecção de ROS (por exemplo, sondas de ROS mitocondrial sensíveis específicos, sondas ROS sensíveis genéricos). </li><li> Para cada condição, medir todas as amostras na mesma sessão experimental, aplicando as mesmas configurações de FACS. Calcula-se a percentagem de células fluorescentes como a média das diferentes réplicas biológicas. Analisar, pelo menos, duas réplicas para cada condição. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Etapas críticas O procedimento para a detecção de stress oxidativo em embriões de peixe-zebra aqui descritos compreende dois métodos diferentes. O método de detecção de ROS montagem inteira é principalmente um teste qualitativo para a detecção de ROS, enquanto a célula único método de detecção de ROS permite medições quantitativas mais específicas (Figura 1). Ambos os métodos oferecem uma maneira rápida e fácil de avaliar a detecção de ROS-in vivo</...

O estresse oxidativo é especificamente definida como uma condição que resulta de um estado redox celular desequilibrado. As reações redox complexas que rotineiramente ocorrem no interior das células determinar o estado redox celular. Reacções redox constituído por todas as reacções químicas que consistem na transferência de electrões entre os átomos das moléculas biológicas que produzem redução e oxidação de moléculas (por exemplo, reacções redox). Estas reacções são catalisadas por espécie activada electronicamente (por exemplo, espécies de pró-oxidantes), que são caracterizadas por uma instabilidade estrutural extrema e a activação espontânea de electrões desequilibradas que trocam com biomoléculas vizinhos. Estas reacções irregulares resultar em danos no DNA, carboxilação de proteínas e oxidação lipídica e, eventualmente, levar à morte celular 1. Aumento dos níveis de stress oxidativo têm sido associados com o envelhecimento e a progressão de diversos estados patológicos 2. O estresse oxidativo temfoi relatado para ser responsável por alterações vasculares em diabetes e doenças cardiovasculares 3,4. Também desempenha um papel crítico na degeneração neuronal na doença de Alzheimer e doença de Parkinson 5. Além disso, o estresse oxidativo tem sido demonstrada como um fator crítico para governar a progressão do câncer e eventos metastáticos 6,7. Além disso, as respostas imunes e inflamação pode provocar estresse e mais apoio oxidativo 8. Em células vivas, espécies pró-oxidantes são derivados de oxigênio (ROS, espécies reativas de oxigênio) ou de nitrogênio (RNS; espécies reativas de nitrogênio). ROS incluem o radical hidroxilo, anião de superóxido (OH.) (O 2 -), e o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2). O primário RNS é o óxido nitroso (NO.). Uma série de espécies reactivas secundárias podem ser gerados por interacções espontâneas between ROS e RNS ou metais livres íons 9. Por exemplo, o anião superóxido reage com o óxido nitroso para formar peroxinitrato (ONOO -), enquanto H 2 O 2 a reagir com Fe 2 + gera radicais hidroxilo. ROS e RNS, devido à sua capacidade de reagir com várias biomoléculas, são consideradas uma grave ameaça para a manutenção do estado redox fisiológica 10. Para manter as células do estado redox estão equipadas com uma série de desintoxicar moléculas anti-oxidantes e enzimas. A superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase e Peroxirredoxinas constituem o essencial do anti-oxidante enzimático-arsenal que fornece proteção celular de espécies pró-oxidantes, incluindo H 2 O 2, OH e OONO -. 11. Também moléculas anti-oxidantes como a vitamina C e E, polifenóis e CoenzymeQ10 (CoQ10) são de importância crítica para saciar ROS e sua perigosa deusa derivativos 12,13. No entanto, uma produção excessiva de ROS e RNS, ou uma disfunção no sistema anti-oxidante, muda o estado redox celular para o estresse oxidativo 14. Além de sua conotação negativa, ROS pode desempenhar várias funções fisiológicas em células de origem diferente. As células normalmente produzem ROS como moléculas sinalizadoras para mediar eventos biológicos normais, tais como a defesa do hospedeiro e reparação de feridas 15-17. Espécies reactivos são normalmente produzidas em células por enzimas intracelulares, tais como NOX (NADPH oxidase) e XO (xantina oxidase), em resposta a factores de sinalização, factores de crescimento, e as flutuações de níveis de cálcio intracelulares 18,19. Tem sido relatado que as ROS pode diferencialmente modular a actividade dos factores nucleares importantes, tais como p53 ou componentes celulares, tais como a ATM-quinase, um regulador do mestre de a resposta ao dano no DNA de 20. Analogamente ROS influenciar fortemente a sinalização celular através da mediação the oxidação e inactivação da proteína tirosina fosfatases (DPT), os quais são estabelecidos como reguladores críticos de transdução de sinal 21. Além disso, as metodologias proteômicas baseadas demonstrar que RNS também são responsáveis ​​por modificações e alterações de sinalização molecular de proteínas específicas. RNS reagem com os grupos tiol de cisteína modificados los em S-nitrothiols (SNO) e provocando vias moleculares concomitantes com os estados patológicos tais como doenças inflamatórias e auto-imunes 22,23. Desde experimentos de cultura de células se reproduzem apenas parcialmente a multiplicidade de factores que actuam in vivo, é de grande interesse para realizar estudos de redox em modelos animais 24,25. Para conseguir isso, o peixe-zebra foi considerada um modelo animal vertebrado adequado para estudar a dinâmica de estresse oxidativo 26. O peixe-zebra é um novo modelo de sistema que concede várias vantagens para estudar eventos celulares e genéticas durante vertebrados devolvimento e doenças. Grandes aglomerados de embriões pode ser gerada e está disponível semanal para as necessidades experimentais. Além disso, a claridade óptica extraordinária de embriões de peixes-zebra, bem como o seu tamanho pequeno, permite que imagens de células única e rastreio dinâmico em organismos inteiro 27. Na última década, um número considerável de mutantes peixe-zebra foram gerados para modelar condições patológicas humanas, como câncer e doenças genéticas 28-31. Mais importante ainda, uma infinidade de linhagens transgênicas foi produzido para permitir grandes oportunidades de manipulações genéticas e biológicas 32. Por exemplo, linhas de peixes-zebra transgénicos específicos de tecido são regularmente utilizados para estudos in vivo. Estas linhas de expressar uma proteína fluorescente, sob o controlo de um promotor seleccionado, oferecendo a possibilidade de identificar uma única célula in vivo, bem como com a estrutura anatómica eles compreendem. Vários estudos toxicológicos já usou tele peixe-zebra para avaliar o efeito in vivo de produtos químicos na homeostase redox, sugerindo a adequação deste vertebrado como um modelo animal para o campo da descoberta de drogas e de stress oxidativo 33-35. Mesmo que algumas sondas fluorescentes foram testados para monitorar o estresse oxidativo em larvas do peixe 36,37, não há ensaios estabelecidos para detectar e medir os níveis de estresse oxidativo nos tecidos de peixes-zebra e células vivas. Aqui nós descrevemos um procedimento para a quantificação in vivo do estresse oxidativo em células de embriões de peixes-zebra viva. Ferramentas de imagem, separação FACS, sondas fluorescentes e condições pró-oxidantes são combinados para gerar um ensaio simples para a detecção e quantificação de espécies oxidativas em embriões de peixe-zebra e tecidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1261">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:285px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:528px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">516813</td>
			<td>DO NOT STORE DILUITIONS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Methyl cellulose</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td>
			<td style="width:147px;">INSTANT OCEAN</td>
			<td style="width:285px;">SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Cgeneric ROS-sensitive probe:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CellROX Deep Red Reagent</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX&#160;</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">M36008</td>
			<td>dissolve one vial with 13&#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Hydroethidine</td>
			<td style="width:147px;">INVITROGEN</td>
			<td style="width:285px;">D23107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Rotenone</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">R8875</td>
			<td>Prepare 5mM stock solution in DMSO.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:147px;">SIGMA</td>
			<td style="width:285px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td>
			<td style="width:147px;">EnzoLifeScience</td>
			<td>BML-EI395</td>
			<td>dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">Propidium Iodide&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:301px;">7-aminoactinomycin D (7-AAD)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Molecular probes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (Life Technologies)&#160;</td>
			<td>A1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Nrf2a Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">GeneTools</td>
			<td style="width:285px;">5&#39;-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3&#39;</td>
			<td>Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td>11213857001</td>
			<td>Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:147px;">ROCHE</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td>Dissolve one tablet in 1ml of water</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red</td>
			<td style="width:147px;">GIBCO</td>
			<td style="width:285px;">15400-054</td>
			<td>Prepare 1X working solution before usage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Compound microscope&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereo microscope with fluorescent illumination</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:285px;">AZ100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">camera&#160;</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">AxioCamMRm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">software for fluorescence image acquisition</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td style="width:285px;">ZEN 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescence-activated cell sorter</td>
			<td style="width:147px;">BD FACSCalibur</td>
			<td style="width:285px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:285px;">5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">BD</td>
			<td>342065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Sterilized, non treated Petri dishes 90mm</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:285px;">391-1915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:301px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:285px;">Leica SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of oxidative stress in zebrafish embryos

Altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode causar uma mudança de estado redox celular para condição de estresse oxidativo. Esta situação faz com que a oxidação de moléculas de lípidos (, ADN, proteína), e leva à morte das células. O estresse oxidativo também afeta a progressão de várias condições patológicas como diabetes, retinopatias, neurodegeneração e câncer. Assim, é importante definir ferramentas para investigar condições de stress oxidativo, não só ao nível das células individuais, mas também no contexto de todo o organismo. Aqui, consideramos o embrião zebrafish como um útil no sistema vivo para realizar estudos e apresentar um protocolo para medir in vivo do estresse oxidativo. Aproveitando fluorescentes sondas ROS e linhas fluorescentes transgênicos zebrafish, desenvolvemos dois métodos diferentes para medir o estresse oxidativo in vivo: i) um &quot;método de detecção de ROS todo embrião&quot; para a medida qualitativa do estresse oxidativo e ii) um &quot;unicelular método de detecção de ROS &quot;para medições quantitativas de estresse oxidativo. Aqui, nós demonstramos a eficácia desses procedimentos, aumentando o estresse oxidativo nos tecidos por agentes oxidantes e métodos fisiológicos ou genéticos. Este protocolo é favorável para telas genéticos para a frente e vai ajudar as relações de causa-efeito endereço de ROS em modelos animais de patologias relacionadas ao estresse oxidativo, tais como doenças neurológicas e câncer.

Ao aplicar o método aqui descrito, podemos facilmente medir e detectar o estresse oxidativo (e níveis de ROS) em tecidos embrionários peixe-zebra. Depois de atravessar adulto zebrafish, os ovos são coletados e autorizados a desenvolver a 28 ° C a 72 horas pós-fecundação (hpf). Para induzir o estresse oxidativo, propomos duas abordagens diferentes: 1) o tratamento de embriões com fortes reagentes pró-oxidantes ou 2) promover a formação de ROS após a lesão de tecidos. Na primeira...

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Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.9K visualizações.  University of Torino. Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses. 

Vídeo: Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em placas de 96 poços de microtitulação

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...