Este trabalho foi financiado pelo NIH e fundação PKD a ZS. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com Yale Recursos Animais Center (YARC) e Animal Care Institucional e Use Committee (IACUC) orientações.

Parte 1: Preparação de micropipetas, e placas de câmara de microinjeção <ol><li> Fabricar micropipetas por aquecimento e puxar os tubos de vidro de borosilicato capilar (Precision Mundial Instruments, Inc., 1B100-4) em um dispositivo extrator micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Armazenar em uma placa de Petri em cima de pequena quantidade de barro ou fita adesiva. </li><li> Despeje de agarose 1,5% (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) em placas 1x médio E3 moldado com depressões em forma de cunha que servirá como um método fácil para segurar os embriões durante a injeção (conforme descrito em &quot;O Livro dos Zebrafish&quot;) 1. Deixe placas câmara de ágar solidificar antes de usar e armazenar a 4 º C. </li></ol> Parte 2: Preparação do RNA Uma abordagem poderosa para estudos de função do gene é transcrito microinject in vitro RNA tampado em embriões de peixe-zebra. RNA tampado se comporta de forma semelhante ao mRNAs eucarióticos encontrados in vivo devido à presença da analógica CAP. Pesquisadores zebrafish rotineiramente utilizam este método para superexpressão ou misexpress seu gene de interesse. Nesta demonstração, iremos microinject uma transcrição EGFP-marcados e uso ao vivo todo embrião-GFP-expressão como uma leitura visível para uma injeção de sucesso. <ol><li> Realizar uma reação de transcrição in vitro CAP RNA em sua transcrição de interesse. Em nosso laboratório, nós rotineiramente inserir um cDNA de interesse em um vetor + pCS2 e executar uma reação de síntese in vitro de grandes quantidades de RNA capped usando o mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340). </li><li> Purificar a amostra de RNA, executando-o através do kit Mini RNeasy (Qiagen, Inc., 74104) ou pelo fenol: clorofórmio e precipitação extração de isopropanol. </li><li> Cuidadosamente determinar a concentração de RNA a preparação e armazenar a -80 º C até que esteja pronto para uso. </li><li> No dia da injeção, descongelar a amostra de RNA vórtice, de ânimo leve e spin down brevemente. </li><li> Prepare uma solução de trabalho com água estéril e uma concentração final de 0,025 - 0,050% de vermelho de fenol (Sigma-Aldrich Co., P0290). Vermelho de fenol serve como um marcador visível para a injeção da solução para o embrião. Neste artigo, vamos preparar uma solução de trabalho de 100 mRNA EGFP ng / uL com 0,050% de vermelho de fenol. </li><li> Manter amostra de trabalho sobre o gelo e ações retorno RNA a -80 ° C. </li><li> Prosseguir para a Parte 4, quando prontos para injetar essa amostra. </li></ol> Parte 3: Preparação de morfolino Oligonucleotídeos antisense morfolino são amplamente utilizados para modificar a expressão gênica, bloqueando tradução de uma proteína-alvo ou modificando pré-mRNA splicing 2,3. Morpholinos no zebrafish servir como uma ferramenta poderosa de genética reversa por derrubar a função do gene. Neste artigo, vamos microinject um oligo morfolino voltado para o sítio de iniciação de translação de PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Baseado no trabalho previamente estabelecido, esperamos que os embriões injetados para fenotipicamente imitar PKD2 4 peixes mutantes. <ol><li> Rotineiramente ordem 300 nmol de um oligo morfolino projetado especificamente para um gene de interesse a partir de Ferramentas Gene, LLC (Philomath, OR). </li><li> Adicione 100 uL de água estéril para fazer uma solução estoque 3 mM. Solução de alíquotas e armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> No dia da injeção, aquecer a solução morfolino a 65 ° C por 5 minutos. Pressão legal sobre o gelo imediatamente e girar rapidamente. Esta etapa desnatura qualquer estruturas secundárias na oligo e garante que a solução é completamente solubilizado. </li><li> Prepare uma solução de trabalho, diluindo a solução morfolino em água estéril e uma concentração final de 0,025 - 0,050% de vermelho de fenol. Nesta demonstração, iremos preparar uma solução de trabalho de 0,50 mM PKD2 morfolino com 0,050% de vermelho de fenol. </li><li> Continuar trabalhando solução à temperatura ambiente. </li><li> Prosseguir para a Parte 4, quando prontos para injetar essa amostra .---- </li></ol> Parte 4: Preencher o micropipeta com sua solução de trabalho <ol><li> Corte a extremidade distal de uma micropipeta com uma pinça ou uma lâmina de barbear cirúrgico para criar uma abertura que é apenas visível sob um microscópio de dissecação (Nikon Instruments, Inc., SM2645) com ampliação de 50X. </li><li> Coloque 2 uL de sua solução de trabalho como uma gota em uma lamela. </li><li> Anexar a parte traseira de uma micropipeta para uma seringa de 5 mL equipado com tubos em uma agulha hipodérmica e ligeiramente submergir a ponta distal da micropipeta em sua gota de solução de trabalho. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta. </li><li> Sifão da solução de trabalho através da extremidade distal do micropipeta puxando o êmbolo da seringa. </li></ol> Parte 5: Calibrando o volume de injeção micropipeta <ol><li> Coloque uma gota de óleo mineral (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) em um micrómetro (Fisher, 12-561-SM1). </li><li> Ligue a alimentação e suprimento de ar para a pressão de pulso micro injector aparelho (World Precision Instruments Inc., PV830). </li><li> Anexar a micropipeta ao titular micropipeta do aparelho injector micro. O injetor de micro é pressão regulada e descargas são ativados pressionando o pedal. </li><li> Sob o microscópio de dissecção, teste o volume de injeção usando o injector micro para colocar uma gota de sua solução de trabalho para o óleo micrômetro. Medir o diâmetro da gota, enquanto flutua como uma esfera em cima do petróleo. </li><li> Ajustar a duração ea pressão de injeção de calibrar cuidadosamente o seu volume de injeção. Este passo ajuda na reprodutibilidade do experimento microinjeção. Nesta demonstração, todas as microinjeções será feito com um diâmetro queda de 0,15 mm (cerca de 1,76 nL em volume). </li><li> Uma vez que seu volume de injeção foi calibrado, utilize o &quot;Hold&quot; botão no injector micro para evitar vazamento e enchimento da micropipeta. </li></ol> Parte 6: Preparando embriões fertilizados zebrafish para microinjeção <ol><li> Zebrafish aleatoriamente mate em primeiras horas de cada manhã. Coletar embriões no estágio 1-célula e colocá-los em 1x médio E3. </li><li> Usando uma pipeta de transferência de 3 mL (Becton Dickinson para laboratórios, 357.524), organizar os embriões ao longo das calhas em forma de cunha na câmara de placas de microinjeção. </li><li> Remova a mídia de modo que os embriões são superficialmente submersos e não inundadas. Este passo ajuda na resolução dos embriões para o fundo dos vales, bem como na penetração do córion pela micropipeta. </li></ol> Parte 7: microinjeção através do córion <ol><li> Manipular os embriões com a micropipeta, para que o citoplasma do embrião estágio 1-célula é visível ao microscópio de dissecação. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta. </li><li> Penetrar no córion e depois a gema com a micropipeta, a fim de injetar o embrião. Nesta demonstração, que será o primeiro microinjecting na gema diretamente abaixo da célula, e permitir o fluxo citoplasmático e difusão para trazer a solução de trabalho na célula. Este fluxo é visível devido ao vermelho de fenol adicionado à solução de trabalho. </li><li> Vamos também demonstrar injecção directa no citoplasma da célula. Microinjeção direta na célula é mais robusto, mas demorada como a orientação adequada do embrião e da técnica de microinjeção é necessária. Como a membrana celular é mais rigoroso que a membrana da gema, muitas vezes é mais rápido para entrar na micropipeta através da gema para alcançar o citoplasma da célula. Orientar o pólo animal para o fundo do poço e trabalhar com as mãos firmes podem ajudar a este método de injeção. </li><li> Após a microinjeção, os embriões lugar em uma placa de Petri com meio de E3 e incube-os em 28,5 ° C para o desenvolvimento normal. </li><li> Mais próximas horas e dias de desenvolvimento embrionário, observe os embriões para o seu fenótipos de interesse. </li></ol> Parte 8: Resultados Representante EGFP superexpressão mRNA: Para verificar o sucesso da microinjeção, vamos monitorar a expressão da GFP em embriões em desenvolvimento no início escudo estágio (~ 6 hpf) por microscopia de fluorescência em todo embrião vivo (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expressão da construção é mais forte durante os eventos iniciais do desenvolvimento embrionário e, muitas vezes, diminui durante o desenvolvimento como o RNA injetado capped é gradualmente degradada e depende da estabilidade da proteína expressa. PKD2 translacional-blocking morfolino: Com base nos resultados publicados anteriormente, esperamos que a PKD2 morphants para imitar a curvatura do eixo dorsal do corpo como os encontrados no peixe-zebra PKD2 mutante e cistos renais presentes em cerca de 2-3 dpf 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: resultados Representante da microinjeção de EGFP mRNA e agosto PKD2 morfolino. (A) embriões TAB receberam microinjeções na fase 1-célula com 0,17 ng de mRNA EGFP e visualizados em um dpf para in vivo expressão GFP. (B, c) embriões TAB receberam microinjeções na fase 1-célula com ~ 1,7 nl de um PKD2 translacional morfolino bloqueio de 0,50 mM e marcou para a curvatura do corpo dorsal, 4 dpf.

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	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos:+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown.">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney.">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li><li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li><li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li><li>Culp, P., N&#252;sslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs.">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li><li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo.">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li><li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula.">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li><li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos.">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li><li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene.">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li><li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+the+zebrafish.">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li></ol>

Microinjeção em embriões de peixe-zebra é uma técnica bem estabelecida e robusta para explorar o papel de um gene em particular no desenvolvimento. As aplicações incluem superexpressão, misexpression e ensaios knockdown do seu gene de interesse, bem como análise epistáticas entre genes múltiplos. Microinjeção em peixes-zebra tem sido amplamente utilizada para a geração de animais transgênicos, células e mapeamento de destino no início de embriões blástula 5,6,7,8,9. Além disso, a aplicaç...

Todos os outros materiais são listados no protocolo.

microinjection of mrna and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.

Uma ferramenta essencial para investigar o papel de um gene durante o desenvolvimento é a capacidade de executar knockdown do gene, superexpressão e estudos misexpression. Em peixes-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Microinjeção de RNA, DNA, proteínas, oligonucleotídeos antisense e outras moléculas pequenas para o desenvolvimento do embrião fornece aos pesquisadores um ensaio rápido e robusto para explorar a função do gene<em&gt; In vivo</em&gt;. Neste vídeo-artigo, vamos demonstrar como preparar e microinject<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA sintetizado EGFP e uma translação de bloqueio de morfolino oligo contra<em&gt; PKD2</em&gt;, Um gene associado à doença renal policística autossômica dominante (ADPKD), em 1 de células de embriões zebrafish palco. Vamos então analisar o sucesso do mRNA e microinjeções morfolino verificando expressão GFP e análise de fenótipo. Amplas aplicações desta técnica incluem a geração de animais transgênicos e células germinativas quimeras, célula-destino de mapeamento e seleção genética. Aqui nós descrevemos um protocolo para a superexpressão de EGFP e knockdown de<em&gt; PKD2</em&gt; Por mRNA e injeção de oligonucleotídeos morfolino.

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Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

36.6K visualizações.  Yale University School of Medicine. Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Vídeo: Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

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