Reconhecemos os membros do laboratório de Mably e Storer Narie por sua assistência técnica, e da American Heart Association (NCRP Scientist Desenvolvimento Grant 0635363N) e do National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) para financiamento.

Parte 1: A produção de ovos e cobrança <ol><li> A noite antes da injeção, os peixes criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Para aumentar a produção total de ovos, peixes pode ser configurado em uma proporção de duas fêmeas para um macho, se desejar. </li><li> Na manhã seguinte, depois de as luzes da sala ligar, puxe os divisores de vários tanques e permitir a cerca de 20 minutos de tempo de acasalamento imperturbável. </li><li> Usando um filtro, recolher os ovos das gaiolas de criação e enxaguar com água de ovo. Despeje os ovos em uma placa de Petri com água do ovo e remova ovos não fertilizados e detritos com uma pipeta. Os peixes podem ser reagrupados em tanques maiores para produzir rodadas adicionais de ovos para injeção. Ajustar o tempo de coleta de ovos para permitir número máximo de ovos a ser produzida sem deixá-los passar o estágio unicelular. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio invertido na tampa de uma placa de Petri de 100mm. Use uma pipeta para alinhar os ovos contra a lateral da lâmina formando uma única coluna. Retirar a água em excesso do ovo a partir do slide pressionando uma Kimwipe contra o lado oposto os ovos. (Figura 1A) </li></ol> Parte 2: Agulha puxando, carregamento e preparação <ol><li> Com um puxador de micropipeta, puxe um copo OD 1,0 milímetros capilar em duas agulhas e armazenar em uma placa de Petri 150 milímetros colocando sobre rampas bolinha de borracha. Agulhas pode ser puxado com antecedência. </li><li> Agulha de protelar o com 3 mL de material de injecção utilizando uma pipeta microloader. Agitar o bolo em direção à ponta da agulha até que haja poucas ou nenhuma bolha restantes. </li><li> Ligue a fonte de ar e microinjetor. Inserir a agulha no microinjetor e garantir uma perfeita vedação dentro da caixa. Verifique se o micromanipulador está em uma posição adequada para permitir uma ampla gama de movimentos e de ajuste. Traga a ponta da agulha no plano de visão do microscópio de alta fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Use uma pinça afiada para beliscar fora a agulha em um ponto que deixa a agulha fina o suficiente para furar o córion e gema, mas ainda capaz de fornecer um tamanho consistente talão. Uma gota de óleo mineral em um micrômetro pode ser usado para calcular o volume de cada injeção. Quando injetado no petróleo, um cordão com um diâmetro de 0,1 mm contém 500 pL de material de injeção (figura 1B); volumes de injeção de 500 pL ou 1nL são normalmente utilizados. Pressione o pedal e monitorar o tamanho do grânulo ao aparar a agulha e ajustando a pressão de injeção, conforme necessário. Volumes de injeção ideal vai preencher cerca de 10% do volume de ovos. A qualidade da ponta da agulha é crucial para ambos, a facilidade da injeção ea qualidade e consistência dos resultados. </li></ol> Parte 3: Injeção <ol><li> Garantir os embriões não se desenvolveram após o estágio de quatro células. Idealmente, os embriões devem estar no estágio de uma célula. </li><li> Abaixe a agulha em direção à coluna de ovos, segurando o prato no lugar com a mão oposta. </li><li> Pierce superfície do córion e introduzir a gema de um só golpe suave enquanto assiste a qualquer esmagamento ou rompimento do saco vitelino. Injetar o material de injecção a gema (figura 1C). Evite injetar bolhas de ar ou esticar a gema ou como pode ser letal para o embrião. Trabalhando para baixo da linha, ajustar a pressão conforme necessário para manter um tamanho consistente talão e, usando uma ponteira, remover os ovos não fertilizados que parecem ou são destruídas durante o processo de injeção. </li><li> Depois de completar uma coluna de ovos, use um jato suave de água do ovo para mover os ovos injetado em uma placa de Petri limpa. Repita conforme necessário. Manter vários embriões uninjected como controle. No final do dia, remova embriões mortos e gravar o número de embriões injetados. Substitua a água dos ovos no prato periodicamente para reduzir a chance de infecção. </li></ol> Parte 4: Os resultados representativos Dependendo do que está sendo injetado, os embriões podem sobreviver a uma taxa inferior do que seus irmãos uninjected. Felizmente, é fácil para injetar um grande número deles, então isso raramente é um problema. É normal que morphants para expor o desenvolvimento ligeiramente atrasado. Para ilustrar os resultados da microinjeção, utilizamos esse protocolo para manipular os níveis da proteína Coração de Vidro (Heg). Heg é uma proteína transmembrana necessário para o desenvolvimento normal do coração. Na sua ausência, os embriões se desenvolvem corações com extensões entrada gigante e câmaras 1. Injetamos dois morpholinos anteriormente não descritas contra HEG, heg_e3i3_egfr1 e heg_e4i4_egfr2, em uma concentração de 500 mM. Menos 2 dias após a fertilização, os controles irmão uninjected aparecem normal, como esperado (Figura 2A e B). Embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral (figura 2C). Embora os corações da maioria destes morphants ter alterado a morfologia, suas câmaras são normalmente de tamanho (figura 2D). Embriões injetadoscom heg_e4i4_egfr2 apresentam defeitos cardíacos variável. Alguns parecem normais, enquanto outros têm folhetos grande influxo e átrios moderadamente aumentado (Figura 2E e F). O mutante HEG, conforme relatado anteriormente 1, tem uma via de entrada extremamente alargada e do átrio (Figura 2G e H). Também injetou embriões tipo selvagem com 400 mRNA ng / mL transcrito de full-length HEG cDNA. Enquanto os controles uninjected desenvolver normalmente (figura 3A e B), embriões injetados com HEG mRNA exibem um espectro de fenótipos que vão desde a aparência do tipo selvagem para ciclopia grave, encurtamento do eixo do corpo principal, necrose da cabeça e do corpo, e defeitos da linha média (figura 3C e D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Figura 1. Embriões a ser injetado estão alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri (A). Volume de injeção é determinada pela injeção em óleo mineral colocado em um micrômetro. Um volume de injeção de 500 pL, que é comumente usado, tem um diâmetro de 0,1 mm (B). Imediatamente após a injeção, o morfolino ou mRNA é visível como uma mancha pontuam na gema (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figura 2. Em 2 dias após a fertilização, os embriões não têm defeitos uninjected bruto (A) ou fenótipo coração (B). Embriões injetados com a heg_e3i3_egfr1 morfolino têm edema cerebral (C, seta), mas as câmaras cardíacas de tamanho normal (D). Alguns embriões injetados com a heg_e4i4_egfr2 morfolino têm extensões entrada alargada e átrios (E, F). HEG mutantes têm extensões entrada severamente alargada e átrios (G, H). (A), (C), (E) e (G) são 4x imagens DIC; (B), (D), (F) e (H) são 20x imagens DIC. um átrio = it = via de entrada. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figura 3. Às 24 horas após a fertilização, os embriões uninjected ter um corpo longo e reto, sem necrose ou defeitos da linha média (A) e dois olhos bem definidos com um tubo neural entre eles (B). Alguns embriões injetados com mRNA HEG, em contrapartida, exibem um eixo do corpo encurtado, necrose, somitos deformado (C), e ciclopia (D). (A) e (C) são 4x imagens DIC; (B) e (D) são 20x imagens DIC.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

Um dos pontos fortes do sistema de modelo peixe-zebra é a facilidade com que produtos de genes específicos podem ser adicionados ou eliminados do embrião por microinjeção. Para ubiquitously superexpressam uma proteína particular, a codificação de mRNA é injetado na gema na fase 1-célula. Durante o desenvolvimento posterior do embrião, o RNA é distribuído por todo o organismo e traduzido. Por outro lado, para eliminar uma determinada proteína, morpholinos são usados. Morpholinos são oligonucleotídeos sintéticos projetados com a complementaridade de RNAs antisense específico. Como mRNAs, morpholinos são injetados na gema na fase 1-célula. Dentro do embrião que se ligam RNAs seu alvo, prevenindo tradução. A principal modificação que precisa ser feita para cada morfolino ou mRNA é a concentração de material injetado. Uma concentração demasiado elevada de qualquer morfolino ou mRNA pode causar toxicidade não-específica, enquanto cada morfolino deve ser testado empiricamente para determinar a concentração ideal, normalmente morfolino concentrações entre 200 e 500 mM mM derrubar a atividade do gene de forma eficaz, sem causar defeitos não-específica. O tamanho exato da abertura da agulha não é crucial. Dentro de uma gama de tamanhos de agulha, pressão de injeção e tempo de injeção pode ser ajustado para produzir um bolo de o volume correto. Morpholinos têm muitas aplicações, incluindo a dissecção funcional de domínios dentro de uma proteína. Quando se destinar a meta específica exon-intron cruzamentos, morpholinos impedirá splicing ocorra lá. Nós examinamos os efeitos de duas morpholinos que se ligam exon-intron junções na pré-mRNA de HEG. O heg_e3i3_egfr1 morfolino liga a junção entre exon 3 e intron 3, impedindo a maquinaria de splicing do exon 3 incorporando em transcrições maduro. O heg_e4i4_egfr2 morfolino semelhante remove exon 4. Ambos os exons 3 e 4 codificam domínios contendo EGF-like repete. Alguns embriões injetados com heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocópia o mutante; novos experimentos serão necessários para entender o papel do exon 4 Heg no desenvolvimento do coração. Surpreendentemente, os embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral, uma característica não observada em mutantes HEG. Isto pode ser devido à capacidade de morpholinos para ligar transcrições materna que não seria afetada em mutantes zigóticos.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PLI 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P 97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100 F6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader Pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH310</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

Uma das vantagens de estudar zebrafish é a facilidade e velocidade de manipular os níveis de proteínas no embrião. Morpholinos, que são oligonucleotídeos sintéticos com complementaridade antisense para RNAs alvo, podem ser adicionados para o embrião para reduzir a expressão de um produto gene particular. Por outro lado, mRNA processados ​​podem ser adicionados para o embrião para aumentar os níveis de um produto gene. O veículo para a adição ou mRNA ou morfolino a um embrião é microinjeção. Microinjeção é eficiente e rápida, permitindo a injeção de centenas de embriões por hora. Este vídeo mostra todos os passos envolvidos na microinjeção. Resumidamente, os ovos são recolhidos imediatamente após terem sido definidos e alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri. Em seguida, uma agulha de ponta fina carregado com material de injecção é conectado a um microinjetor e uma fonte de ar, e os controles microinjetor são ajustados para produzir um volume de injeção desejável. Finalmente, a agulha é mergulhado em gema do embrião e do morfolino ou mRNA é expulso.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

77.1K visualizações.  Harvard Medical School. Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Vídeo: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene Trapping Usando Gal4 em Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Methods Article

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene