A bondade ea generosidade do Dr. Kent McDonald da UC Berkeley são muito apreciados. Agradecemos a um revisor anônimo para sugestões muito úteis. O laboratório de Burch-Smith é apoiado por fundos de arranque da Universidade de Tennessee.

NOTA: O procedimento QFS requer extremo cuidado e cautela por parte do utilizador e destacamos estas precauções de segurança aqui como Precauções e Notas, onde aplicáveis. 1.Preparation para HPF Run <ol><li> Antes de iniciar a preparação da amostra, ligar o congelador de alta pressão, seguindo as instruções do fabricante. NOTA: A unidade HPF utilizado neste protocolo é um Wohlwend Compact 02 unidade (Figura 1A), e leva cerca de uma a uma hora e meia de procedimento de inicialização antes HPF funciona pode começar. <ol><li> Ligar o Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer. <ol><li> Ligue o instrumento, girando a chave principal de &quot;0&quot; para &quot;1&quot;. </li><li> Solte o ar comprimido para a máquina. </li><li> Libertar azoto líquido para a máquina. </li><li> Pressione o botão &quot;SYSTEM secar&quot;. </li><li> Após 30 minutos, pressione o botão &quot;SYSTEM botão novamente secar &quot;. </li><li> Pressione o botão &quot;ON / OFF&quot; para ligar o instrumento. </li><li> Pressione o botão &quot;NITROGENADA&quot;. </li><li> Deixe a máquina esfriar por 20 minutos, mesmo que o &quot;drive in&quot; botão já se iluminou. </li><li> O &quot;drive in&quot; botão acende-se. </li><li> Pressione o &quot;drive in&quot; botão. </li><li> Pressione o botão &quot;AUTO&quot;. </li><li> O &quot;sistema de READY&quot; botão acende-se. </li><li> Colocar a sonda de temperatura e pressão na câmara de pressão e bloqueá-lo com o pino. </li><li> Pressione o botão &quot;JATO AUTO&quot;. Este passo verifica se o aumento de pressão e diminuição da temperatura são como desejado; essencialmente um ensaio. Quedas acentuadas de temperatura e fortes aumentos na pressão são esperados (Figura 1B). </li><li> Realizar mais dois ciclos do JET. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 Preparação para ReceiviAmostras congeladas ng <ol><li> Encha uma caixa térmica contendo titulares cryovial com nitrogênio líquido (ver Advertências de segurança), de modo que os titulares estão completamente cobertos (Figura 1C). NOTA: Use EPI incluindo cryogloves e óculos de proteção ao manusear nitrogênio líquido. </li><li> Inserir o número apropriado de frascos contendo o meio de FS dentro dos suportes de tubos de alumínio em azoto líquido (Figura 1C). Com este protocolo de até quatro discos, contendo cada um uma única amostra pode ser colocada num frasco de congelação. NOTA: Os frascos devem ser rotulados com um instrumento afiado como um escriba com ponta de diamante e lápis muito macio. <ol><li> Para fixador durante QFS usar 1% OsO 4 e 0,1% acetato de uranila em acetona 9. Preparar a solução em grande volume, dispensar alíquotas de 1,5 ml em criotubos e armazenamento congeladas em azoto líquido. NOTA: Siga Avisos de segurança para lidar com OsO 4 e acetato de uranila. NOTA: OSO4 </sub&gt; e acetato de uranila são produtos químicos perigosos e devem ser manuseados na capa fume enquanto estiver usando equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo sapatos-toed fechado, jaleco e luvas. NOTA: As criotubos utilizados para conter amostras para QFS deve ter um anel de vedação de disco para assegurar que os tubos de permanecer selada durante QFS para evitar fugas de OsO4. </li></ol></li><li> Prepare levedura pasta misturando fermento de padeiro com um volume aproximadamente igual de 10% de metanol com um palito ou outro instrumento até que a massa esteja lisa. A pasta de levedura actua como um agente crioprotector extracelular e é utilizado para preencher o espaço em torno da amostra no suporte de amostras. A quantidade de pasta depende do número de amostras; para 10 amostras ou menos o colar (1 ml) pode ser misturado em um tubo de microcentrífuga. </li></ol> Congelamento 3 de alta pressão de Amostras <ol><li> Remover uma folha (ou outro tecido) de interesse a partir da planta e gentilmente colocá-lo em um pedaço de dental cera ou outra superfície de corte. Usar um perfurador de 2,0 mm ou tamanho desejado para cortar uma amostra para fora da folha. Pega da amostra suavemente com um par de pinças e trabalhar tão rapidamente quanto possível. </li><li> Trabalhando sob um microscópio de dissecação, coloque o disco de folha no lado de 0.2 mm de Tipo A transportadora amostra e cobrir completamente em levedura colar. Certifique-se de que o disco está completamente cheia e a pasta está nivelada com o bordo do suporte, por meio de alisamento para a pasta com um pincel fino (Figura 2). </li><li> Inserir o suporte, por o suporte da amostra. Cobrir a amostra com o porta-espécime do tipo B, a superfície plana voltada para baixo. NOTA: O suporte de amostra deve ser seco e em temperatura ambiente. </li><li> Tome amostra no porta amostra, insira-o em máquina e iniciar um ciclo de congelamento, pressionando o botão &quot;JATO AUTO&quot;, que deve ser concluída em um ou dois segundos. </li><li> Trabalhando tão rapidamente quanto possível, remover o suporte da máquina e coloca o bico prende o SAMPle em azoto líquido na caixa térmica na parte superior da máquina HPF. Mergulhe as pontas dos dois pares de fórceps no nitrogênio líquido para refrigerar-los. NOTA: Após o congelamento, as operadoras só devem ser manipulados com pinças refrigerado a nitrogênio líquido. Quentes (temperatura ambiente) fórceps são muitas vezes a causa da falha em técnicas de criofixação. </li><li> Abrir um criotubo contendo os meios FS, e colocar a tampa no lado da caixa. Com o auxílio de uma pinça refrigerados a nitrogênio líquido, retire delicadamente o disco do suporte da amostra, garantindo que o disco está sempre em nitrogênio líquido ou vapor. Trabalhando no vapor de nitrogênio líquido, mantenha o tubo FS com um fórceps pré-resfriado e use a outra para colocar o suporte do frasco FS. Feche a tampa do frasco FS novamente. Não qualquer armadilha de azoto líquido no recipiente. NOTA: Ao transferir as amostras para criotubos para QFS, garantir que nenhum nitrogênio líquido é preso nos frascos. O nitrogênio líquido se expande 700 vezes durante o aquecimento e qualquer Trapped nitrogênio líquido pode causar explosões durante este tempo. </li><li> Repita os passos 3.1 a 3.7 até que todas as amostras desejados estão congeladas. Vários discos foliares contendo o mesmo tipo de amostra pode ser colocada no mesmo frasco. Note-se que o suporte da amostra deve ser seca e levada até à temperatura ambiente entre os funcionamentos de congelamento. Para fazer isso rapidamente, aquecê-lo com um secador de cabelo, e monitorar sua temperatura pelo toque. </li></ol> 4 Preparação para Freeze Substituição <ol><li> Imergir completamente o bloco aquecedor de alumínio em azoto líquido durante 10 minutos ou até cessar ebulição nucleada. Enquanto isto acontece, colocar uma camada de gelo seco (1-2 cm) no fundo do recipiente utilizado como câmara de FS (Figura 3). Um recipiente de isopor ou balde de gelo pode ser utilizado para o FS, juntamente com gelo seco ou grânulos esmagados. </li><li> Insira rapidamente os criotubos contendo as amostras, juntamente com a sonda de temperatura nas fileiras do meio do bloco aquecedor. Certifique-se de que as tampas dofrascos são firmemente aparafusado para que a mídia FS não vazar durante FS. Começar o registo da temperatura. <ol><li> Fazer a sonda de temperatura, colocando um termopar através da parte superior de um frasco de congelação de modo a que ele atinge o fundo do tubo. Selar a tampa do tubo com a resina de modo a que não há fugas de líquido para fora. Encher o tubo com 1,5 ml de acetona, no início de cada ciclo de QFS. </li></ol></li><li> Usando cryogloves isolados ou grandes pinças, derramar todo o nitrogênio líquido a partir do bloco de aquecimento. Tome cuidado para não derramar as criotubos. NOTA: Use EPI incluindo cryogloves e óculos de proteção ao manusear nitrogênio líquido. </li><li> Colocar o bloco contendo os frascos sobre a camada de gelo seco na câmara QFS. Certifique-se de que o bloco é colocado de modo que os tubos são deitado na horizontal, mas com uma ligeira inclinação para cima. Não deve haver nenhum vazamento se os criotubos corretos são utilizados. </li><li> Embalar a câmara QFS com gelo seco, para que os tubos são cobertos FS, embora não seja necessáriocobrir o topo do bloco. Coloque a tampa da câmara. </li></ol> 5. rápida FS NOTA: Execute o QFS corrida em um exaustor no caso de qualquer vazamento de OSO4 ocorre inadvertidamente apesar de outras precauções. <ol><li> Coloque câmara QFS num agitador rotativo plataforma em um exaustor e rodar a 125 rpm para 120 min. Durante este tempo a temperatura do bloco deve aumentar gradualmente até cerca de -80 ° C. A agitação assegura a mistura dos componentes para uma melhor FS. NOTA: O posicionamento do agitador no exaustor de fumos e a posição do porta hotte deve ser o mesmo em todo o processo e para cada QFS QFS executados para assegurar o aquecimento consistente de amostras. </li><li> Remover o gelo seco a partir da câmara e continuar agitando por mais uma hora. NOTA: a temperatura deve aumentar para cerca de -15 ° C a -20 ° C. </li><li> Retirar as amostras e sonda de temperatura da câmara de QFS e colocar noagitador à temperatura ambiente durante mais 10-15 minutos, até que eles atinjam a temperatura ambiente. Pare a gravação da temperatura. </li><li> Durante FS, desligue a máquina HPF. <ol><li> Feche a torneira do tanque de nitrogênio líquido, enquanto a máquina HPF está sendo preenchido com nitrogênio. </li><li> Pressione o botão &quot;NITROGENADA&quot;. </li><li> Espere até que os vermelhos &quot;pistão para baixo&quot; apaga luz. </li><li> Pressione o botão &quot;ON / OFF&quot;. </li><li> Pressione o botão &quot;SYSTEM secar&quot;. </li><li> Cortar o fornecimento de ar comprimido para a máquina. </li><li> Após um mínimo de 12 horas (para garantir a secagem de qualquer umidade), desligar a máquina rodando o interruptor principal de &quot;1&quot; para &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6 Pós FS Processing <ol><li> Retire cuidadosamente a mídia FS com pipetas de transferência de plástico e coloque no recipiente apropriado para lixo tóxico. NOTA: OsO 4 e acetato de uranila são produtos químicos perigosose deve ser tratado na hotte enquanto usava equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo sapatos-toed fechado, jaleco e luvas. </li><li> Lavar as amostras quatro vezes com 100% de acetona. Coletar as duas primeiras lavagens e coloque no recipiente de lixo tóxico. </li><li> Usando uma pinça fina, retire as amostras de tecido dos titulares. Manter as amostras molhado com acetona como isso é feito, e trabalhar com muito cuidado para evitar quebra de amostras. NOTA: Não é incomum e pode ser realmente útil para ter a pasta de levedura cair longe das amostras neste momento. A pasta de levedura é normalmente castanha muito escura, enquanto o tecido da folha ainda está verde. </li><li> Coletar as amostras em criotubos contendo acetona. Prosseguir com a preparação da amostra (infiltração e incorporação) para TEM acordo com os protocolos usuais. </li></ol>

<ol>
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A., Staehelin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography.">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li><li>McDonald, K. L., Webb, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O sucesso do protocolo aqui apresentado depende fortemente do utilizador. Em primeiro lugar, a preparação avançada é necessária para garantir que todos os materiais necessários estão prontamente disponíveis e em quantidade suficiente para completar uma corrida HPF-QFS. Em segundo lugar, o utilizador deve trabalhar rapidamente, passando de passo-a-passo de uma forma eficiente que minimiza o manuseamento das amostras, minimizando, assim, alterações no estado do tecido nativo. Uma vez que as amostras são congela...

Nosso conhecimento da ultra-estrutura celular vem principalmente de microscopia eletrônica, que pode resolver detalhes da ordem de alguns nanômetros 1. Apesar de ser tão poderosa na resolução TEM não é considerado user-friendly, como a preparação da amostra requer protocolos laboriosos demorado e, e exige algum conhecimento do praticante. Fixação tradicional das amostras foi combinado o uso de aldeídos e tetróxido de ósmio antes de processamento adicional, que inclui a desidratação, a incorporação em resina e, em seguida, o corte para produzir cortes ultra-finos que são depois coradas com metais pesados. No entanto, é sabido que a fixação química pode produzir artefactos, incluindo a agregação da proteína e a perda de lípidos 1, e muda-se para membranas que, em última instância afectam vários compartimentos celulares 2. Esses artefatos são em grande parte atribuída à baixa taxa de fixação e desidratação à temperatura ambiente 3, 4, 5. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; criofixação por alta pressão congelamento (HPF) evita a maioria dos artefatos causados ​​por fixação química. O princípio de criofixação é que baixa o ponto de congelação da água por 20 graus, retarda a nucleação e crescimento de cristais de gelo e aumenta a viscosidade da água, em uma amostra biológica de modo a que os constituintes celulares são essencialmente imobilizada 6, 7. HPF diminui um temperatura da amostra com a de azoto líquido, sob uma pressão muito elevada (210 MPa ou 2100 bar), em milissegundos. Quando feito corretamente HPF impede a formação de grandes cristais de gelo que podem causar grandes danos à ultra-estrutura celular. HPF pode ser utilizado para fixar as amostras de espessura de 100-200 uM para concentrações típicas de solutos biológicos 7. Existem inúmeros comentários sobre a física e os princípios subjacentes HPF, por exemplo, 1, 7, 8. Após HPF, as amostras são incubadas a uma temperatura baixa (-78,5 ° C a -90 &amp;# 176; C) na presença de solventes orgânicos líquidos contendo fixadores químicos como o tetróxido de ósmio, geralmente durante alguns dias. A esta temperatura baixa, a água na amostra é substituída pelo solvente orgânico, tipicamente acetona ou metanol a 1, 9. Assim, este processo é chamado de substituição congelamento (FS). A amostra é, em seguida, aqueceu-se gradualmente e, durante esse tempo é fixo, geralmente com tetróxido de ósmio e acetato de uranilo 9. A reticulação a baixas temperaturas tem a vantagem de fixar moléculas que são imobilizadas 1. FS, por conseguinte, produz amostras de qualidade superior em comparação com as fixadas por fixação química convencional à temperatura ambiente, em particular, que resulta em melhor preservação ultraestrutural, melhor preservação da antigenicidade e perda de componentes celulares não ligadas 10, 11 reduzida. A maioria dos FS é realizada durante períodos de tempo longos, tipicamente até vários dias. Isto é particularmente true para as plantas amostras 12, 13, 14. Um protocolo recente desenvolvido por McDonald e Webb reduz grandemente o tempo de FS de alguns dias a algumas horas e 15. Em seu procedimento rápido congelamento de substituição (QFS), FS é realizada ao longo de 3 horas, enquanto nos FS super-rápidas (SQFS) amostras são processadas em 90 minutos. A qualidade das amostras produzidas por estes métodos é comparável aos produzidos por protocolos tradicionais FS. Adotamos o protocolo QFS para processamento posterior de amostras de plantas depois de HPF. Isto tem provado para salvar não apenas tempo, mas também dinheiro, como QFS e SQFS usar equipamentos de laboratório comum, em vez das caras máquinas FS disponíveis no mercado. Tecidos vegetais são frequentemente muito difícil de se preparar para TEM. Em média, as células vegetais são maiores do que a utilização de células bacterianas ou animais. A presença da cutícula cerosa hidrofóbico, paredes celulares espessas, de grandes vacúolos cheios de água contendo ácidos orgânicos, hidrolases e fenólico compounds que podem ocupar cerca de 90% do volume total da célula 16, e a presença de espaços gaseificadas diminui severamente a condutividade de calor do sistema 17. Além disso, no caso de plantas, a espessura da amostra quase sempre superior a 20 um, o limite para a utilização da fixação química. A estas espessuras, a baixa condutividade térmica da água impede uma taxa de congelamento mais de -10.000 ° C / s no centro da amostra. Essa taxa é necessária para evitar a formação de gelo hexagonal prejudicial (cristais de gelo com uma menor densidade e maior do que 10 a 15 nm) 8. Juntos, estes apresentam desafios para ambos congelação adequada da amostra e FS subsequentes. No entanto, criofixação é o melhor método para a fixação de amostras de plantas. Aqui, um protocolo de HPF-QFS de amostras de tecido de plantas é apresentada. Centra-se na Arabidopsis thaliana espécies modelo, mas também tem sido usado com Nicotiana benthamiana. Os resultados demonstram que os típicos HPF-QFS produz samples de qualidade comparável às tradicionais HPF-FS em uma fração do tempo. Com ajustes apropriados, este protocolo pode também ser utilizado para outras amostras biológicas relativamente espessas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

Uma vez que a microscopia eletrônica de transmissão de 1940 (TEM) tem vindo a fornecer os biólogos com imagens ultra-alta resolução de materiais biológicos. No entanto, por causa de protocolos trabalhosas e demoradas, que também exigem experiência na preparação de amostras, sem efeitos artificiais, TEM não é considerado uma técnica de fácil utilização. Preparação de amostras para TEM tradicional usado fixadores químicos para preservar estruturas celulares. Congelamento de alta pressão é o criofixação de amostras biológicas sob pressões elevadas para produzir velocidades de arrefecimento muito rápido, restringindo, assim, a formação de gelo, o que é prejudicial para a integridade da ultra-estrutura celular. Congelamento de alta pressão e congelamento de substituição é o método de escolha para produzir a morfologia mais alta qualidade em seções de resina para TEM. Estes métodos minimizar os artefatos normalmente associadas com o processamento convencional para TEM de seções finas. Após criofixação a água congelada nas amostras é substituído por líquidosolvente orgânico a temperaturas baixas, de um processo chamado de substituição congelamento. Substituição por congelação é tipicamente levada a cabo ao longo de vários dias em dedicado, equipamento dispendioso. Uma inovação recente permite que o processo seja concluído em três horas, em vez dos habituais dois dias. Isso normalmente é seguida por vários dias de preparação da amostra, que inclui infiltração e inclusão em resinas epóxi antes do corte. Aqui apresentamos um protocolo que combina congelamento de alta pressão e rápida substituição de congelamento que permite fixação amostra da planta a ser realizado em poucas horas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para trabalhar com outros tecidos ou organismos. Tecidos de plantas são de interesse especial devido à presença de espaços gaseificadas e vacúolos cheios de água, que possam impedir o congelamento livre de gelo de água. Além disso, o processo de fixação química é especialmente longa em plantas devido às paredes celulares que impedem a penetração dos produtos químicos para dentro dos tecidos profundos. Tecidos de plantas são, por conseguinte, particcularmente difícil, mas este protocolo é confiável e produz amostras de alta qualidade.

Os resultados apresentados a seguir foram obtidas utilizando um Wohlwend Compact 02 para HPF (Figura 1A). Uma das principais vantagens deste instrumento é a facilidade de utilização dos portadores de amostra e os seus suportes. Ao usar outros instrumentos, McDonald recomenda que dois usuários devem realizar a preparação de amostras e HPF, uma preparação das amostras, enquanto o outro faz o congelamento ea transferência para o FS criotubos 9. No entanto, o espécime Wohlwend operadora...

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K visualizações.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Biologia

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Estudar a Organização supramolecular de fotossintéticas membranas dentro de tecidos foliares Freeze-fraturados por Cryo-Microscopia Eletrônica de Varredura

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.