This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

1 Preparação de amostras biológicas para Freeze-fratura / Freeze-etch <ol><li> Use uma formulação fixador EM convencional, tal como o glutaraldeído a 2% + 2% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora. para realizar a fixação primária de tecidos biológicos. Nota: Embora possa ser desejável para congelar alguns tipos de amostras sem fixação prévia, de agentes patogénicos transmissíveis pelo sangue precauções universais obrigar a fixação adequada em que a amostra consiste de tecido humano. </li><li> A seguir à fixação primária, enxaguar a amostra no mesmo tampão suplementado com sacarose a 0,2 M para não mais do que 1 hora. </li><li> Transfira a amostra a uma solução de agente crioprotector consiste em 25% de glicerol em tampão fosfato 0,1 M, para não mais do que 1 hora. </li></ol> 2. congelação e armazenamento de amostras de antecedência da Freeze-fratura <ol><li> Seleccionar os espécimes de ouro ou de cobre topos de tamanho e forma para a amostra adequada a ser processado (Figura 4 </strong&gt;). </li><li> Usando fórceps fino grau e / ou calibre pequeno posição agulhas de seringa pequenos fragmentos da amostra na parte superior de um topo da amostra de metal. <ol><li> Reduzir o teor de líquido da amostra para um pegajoso, ligeiramente cola como a consistência, a tiragem de líquidos a partir do bordo do topo com o papel de filtro. </li><li> Para réplicas individuais, use agulhas de pequeno calibre seringa para criar um monte de tecido no topo. Por duas vezes réplicas, inverter outro toco e posicioná-lo exatamente sobre o topo e coloque levemente na superfície da amostra a criação de um sanduíche (Figura 5A). Não pressione a amostra para fora entre os dois tocos. </li></ol></li><li> Encha dois vasos Dewar isolados com nitrogênio líquido. NOTA: O primeiro recipiente acomoda um poste de metal contendo um pequeno poço que é utilizado para liquefazer um pequeno volume de gás propano de um cilindro disponível comercialmente (Figura 5B). O segundo navio é um armazenamento particionado / navio segurando para brevely manter espécimes congelados com nitrogênio líquido. <ol><li> Utilizando o cilindro de bocal posicionada dentro do poço de propano, abrir a válvula do cilindro e permitem que o gás flua para o poço do primeiro vaso em que vai liquefazer. NOTA: CUIDADO !! PROPANE é explosivo, PODE CAUSAR LESÕES NO CONGELAMENTO contato e é um asfixiante. Use propano apenas em uma capa química certificada para tal uso cuidando também para evitar fontes de ignição estranhos, usando vestuário de protecção das temperaturas baixas, e manter a ventilação adequada. </li><li> Tão rapidamente quanto possível, pegar o modelo de montagem com uma pinça de grão fino e mergulhá-la no gás liquefeito no primeiro navio por alguns segundos, em seguida, transferir rapidamente para o segundo reservatório de retenção de nitrogênio líquido (Figura 5B). </li><li> Uma vez que as amostras são congeladas, loja sob nitrogênio líquido até o momento de transferir para a fábrica de gelo-fratura. Transfira os tocos para um nitrogênio líquido recipiente Dewar maior de armazenamento para prorrogadoarmazenamento, se desejar, no entanto o cuidado deve ser tomado para não permitir que os tocos para descongelar. </li></ol></li></ol> 3 Operação da fratura Congelar Instrumento e Specimen Processing <ol><li> Carregando espécimes no suporte de latão e para a câmara <ol><li> Coloque os topos de amostras de ouro em um suporte de amostra dupla réplica do tipo brochura ou dispositivo de fixação sob nitrogênio líquido e manter lá até a hora de colocar na câmara da amostra (Figura 6). </li><li> Quando a câmara tenha atingido alto vácuo (cerca de 2 x 10 -6 mbar) e a fase de ter sido arrefecido até à temperatura de azoto líquido, desligar a bomba, a câmara de ventilação, e posicionar os espécimes montados tocos para a mesa de amostra tão rapidamente quanto possível . </li><li> Ligar a bomba, restabelecer a alto vácuo, e usar fase e temperatura braço controlos electrónicos para ajustar a temperatura da amostra de tabela de -100 ° C e azoto líquido directamente para o braço micrótomo e bring que a temperatura do azoto líquido. </li></ol></li><li> O processo de fratura <ol><li> Ao atingir alto vácuo, uma temperatura de -100 ° C fase e braço microtome à temperatura do azoto líquido, abrir remotamente o titular duplo réplica espécime fraturando assim as amostras sobre as montagens de amostras (freeze-fracture_movie1.mov). </li><li> No caso de espécimes destinados a seguinte fractura gravura, utilizar uma lâmina mantida num grampo no braço micrótomo para raspar (isto é, fractura) a superfície das amostras, em vez do passo 3.2.1 (freeze-etch_movie2.mov). </li><li> Se o passo de gravura congelamento é adicionado para ser executada, posicionar o braço micrótomo arrefecida sobre as superfícies fracturadas por um a vários minutos. NOTA: Esta manobra sublima (ie, etch) água da superfície fraturada. O efeito desta manobra é o de revelar verdadeiras superfícies celulares, matriz extracelular, e / ou agrupamentos moleculares por sublimação de água, em adição a fracture caras que passa através da bicamada lipídica das membranas. </li></ol></li><li> Sombreamento de metal e suporte réplica evaporação usando canhões de elétrons <ol><li> Ative a arma platina / elétron de carbono ou de resistência e permitir que ele se evapore uma camada fina (cerca de 2 nm) de platina / carbono sobre a superfície de fratura de um ângulo de 30 ° - 45 °. Isso normalmente requer cerca de 15 - 20 seg. </li><li> Ative o elétron de carbono ou arma de resistência como no passo 3.3.1 e evaporar uma fina camada de carbono para a superfície da amostra fraturada directamente de cima (90 º) para dar suporte para a réplica. Isso normalmente requer cerca de 15 - 20 seg. </li></ol></li><li> Recuperação de réplicas <ol><li> Após a conclusão do sombreamento replicação e estabilização de carbono, desligar a bomba de vácuo, ventilação da câmara, e remover o modelo de montagem do instrumento. </li><li> Usando um par de fórceps grade fina remover cada stub espécime de ouro da duplaréplica folheto / braçadeira e permitir a descongelar durante vários segundos antes de baixar suavemente o topo sobre uma superfície de água, em uma placa de mancha (Figura 7). NOTA: A réplica de carbono / platina contendo material de amostra aderente irá flutuar sobre a superfície da água. </li><li> Manobra as réplicas usando um laço de arame fino ou uma grade microscópio eletrônico de cobre convencional realizada por uma pinça de grão fino e transferência para outra placa de ponto contendo dicromato de sódio a 5% em ácido sulfúrico a 50% para uma a várias horas. NOTA: Este banho digere o material de amostra biológica real da réplica. Intensidade total de lixívia doméstica pode ser substituído por uma solução de ácido dicromato / ácido sulfúrico. </li><li> Quando a digestão é completa, transferir a réplica de volta para a superfície da água limpa e recuperar dentro de uma grade de microscopia eletrônica de cobre padrão. (NOTA: Réplicas podem fragmentar em pedaços menores durante a digestão, mas mesmo muito pequenas réplicas podem conter informação substancial e deve ser retquistada e examinados.) réplica da loja apoiando grades em caixas de grade disponíveis comercialmente onde permanecerão estáveis ​​durante anos com manipulação suave. </li></ol></li></ol> 4 O exame ultra-de criofratura / Replicas de corrosão <ol><li> Ver réplicas em um microscópio eletrônico de transmissão a uma tensão de aceleração normalmente 50-80 kV. </li><li> Grave imagens relevantes em filme TEM padrão ou com uma câmera digital de alta resolução. </li></ol>

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The author has nothing to disclose.

Nos anos seguintes a sua introdução e disponibilidade comercial, congelar-fratura / procedimentos de corrosão foram amplamente utilizado em investigações da estrutura da membrana biológica. Na verdade, as melhores perspectivas de algumas das especializações estruturais das membranas foram obtidos em preparações criofratura / etch. Estes estudos não só contribuiu para a compreensão da organização estrutural das membranas mas também forneceu insights sobre como a estrutura ea função estão relacionados. ...

O conceito e aplicação prática do processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas foi introduzido por uma Steere mais de meio século atrás. O aparelho cedo apropriou componentes díspares em uma unidade auto-suficiente trabalhar um. O aparelho inicial foi modificado e refinado em instrumentos comercialmente disponíveis, a fim de acomodar a necessidade crítica para a manipulação remota, manutenção de alto vácuo, e a evaporação do carbono e metais para produzir uma réplica apropriada para exame por microscopia electrónica de transmissão (Figura 1 e Figura 2). O aparelho típico é constituído por uma câmara de alto vácuo e com o quadro de amostra braço micrótomo com débitos reguláveis ​​de azoto líquido (Figura 1). A câmara também abriga dois canhões de electrões, um estabilizante para a evaporação de carbono posicionados em um ângulo de 90 ° para a fase da amostra e o outro por platinum / carbono sombreamento num ângulo ajustável, tipicamente 15 ° - 45 ° (Figura 2). A alimentação da unidade é aplicada para operar a bomba de vácuo e painéis eletrônicos regular de ajuste de temperatura e eletrônica de controle de armas. Originalmente concebido como um meio para alcançar uma melhor imagem de vírus, congelar-fratura ganhou ainda mais popularidade como uma técnica para o exame e análise das membranas celulares e suas especializações 2, 3. Na verdade, este procedimento tem sido parte integrante da elucidação das relações de estrutura / função em células e tecidos e muitos desses estudos se apresentam como contribuições clássicas para biologia celular e molecular 4-9. O principal objetivo e justificativa para o desenvolvimento da técnica de congelamento e fratura era limitar artefatos observáveis ​​no elétron resolução microscópica decorrente da fixação química e processamento utilizado em microscopia eletrônica biológico convencional. Aqui o objectivo é limitar a químicaa fixação e para congelar as amostras com uma velocidade suficiente e muitas vezes na presença de um agente crioprotector de modo a limitar a formação de cristais de gelo e outros artefactos de congelamento. Mais recentemente, esta técnica tem encontrado um ressurgimento do interesse de biólogos moleculares e investigadores de ciência dos materiais para exame de nanopartículas e nanomateriais. Freeze-fratura e congelar-etch imagens apresentam um caráter tridimensional e, por vezes, são confundidos com microscopia eletrônica de varredura. No entanto, os preparativos criofratura são examinados por microscopia eletrônica de transmissão e sua grande contribuição para os estudos morfológicos de alta resolução é a sua representação única de elementos estrutura / função das membranas celulares. Processamento de fractura por congelação é iniciada por células e tecidos de congelação com uma velocidade suficiente para limitar a cristalização do gelo e / ou com o uso de agentes crioprotectores, tais como glicerol. As amostras são então fraturado sob vácuo e um representantelica é gerado pela evaporação de carbono e platina sobre a superfície fracturada. A amostra original foi digerido a partir de réplicas, que é recuperado dentro de uma grade de amostra padrão EM. Outra má interpretação comum de imagens criofratura é que eles retratam superfícies celulares. No entanto, a premissa básica da congelação-fractura é que as membranas biológicas são divididos através da bicamada lipídica do processo de fractura (Figura 3). Este processo em membranas biológicas produz duas faces, uma fractura que revela a organização da metade da membrana adjacente ao citoplasma, o PF-cara, e uma que revela a metade do folheto bimolecular da membrana que está adjacente ao extracelular meio, a EF-face. Superfície das células não são verdadeiras imagens representadas em freeze-fracture mas só aparecem quando o passo subsequente adicionado de gelo-água-forte, seguindo o procedimento fractura é usado. A fim de gravar efetivamente espécimes previamente fraturadas para revelar detai superfíciel, as amostras devem ser congeladas a uma taxa rápida e sem unetchablecryoprotectant. Etching de água a partir da superfície do espécime fracturadas que revelem características subjacentes é conseguido através do posicionamento do braço micrótomo arrefecimento durante a fase de amostra criando um diferencial de temperatura entre a fase, com o modelo e o braço micrótomo de arrefecimento que faz com que a água a sublimar a partir da superfície. Quando a água é sublimada a partir da superfície do espécime fracturados durante a manobra de gravura congelação, em seguida, os aspectos de superfícies celulares reais, matriz extracelular, as estruturas do citoesqueleto e montagens moleculares pode ser revelada em alta resolução. Assim congelar-fratura e congelá-etch não são termos intercambiáveis ​​mas refletem um processo passo a passo o último dos quais pode não ser necessário ou desejável, dependendo das necessidades do estudo particular. Após a fratura freeze / freeze-etch procedimentos, as superfícies fraturadas são submetidos a evapora dirigidostiva camadas de carbono e platina, a fim de fornecer suporte e imagem contraste com a réplica. A evaporação de imagem / carbono platina pode ser unidirecional ou rotativo, e é realizado por qualquer resistência ou canhões de elétrons. Sombreamento unidirecional de um ângulo conhecido, tipicamente 30 ° - 45 °, é útil na realização de certos cálculos morfométricos. As amostras que foram submetidas a deep-etching normalmente são rotativos sombreado e as imagens resultantes destes espécimes são fotograficamente revertida para avaliação. O histórico, bem como uma meta presente da criofratura / congelar-etch técnica é limitar a fixação química e processamento das amostras de artefatos que estão associados com mais procedimentos de microscopia eletrônica de transmissão convencional. No entanto, esta técnica proporciona uma vantagem substancial em sua capacidade de conferir detalhe tridimensional e, assim, facilitar a aquisição de dados morfométricos em biológicas, ciência dos materiais, e nespécimes anotechnology. Procedimentos criofratura e congelar-etch são complexas e multi-facetada e alguns aspectos de sua aplicação são personalizados. Esta apresentação oferece uma visão levantamento das principais características do processo e remete-se a protocolos publicados abrangentes 10, 11 a fim de resolver os detalhes e personalizar o processo para as necessidades específicas de pesquisa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

Freeze-fratura / congelar-etch descreve um processo pelo qual as amostras, normalmente biológica ou nanomaterial na natureza, são congelados, fraturado, e replicado para gerar um carbono / platina &quot;cast&quot; destina-se a exame de microscopia eletrônica de transmissão. As amostras são sujeitas a taxas de congelamento ultra-rápidos, muitas vezes na presença de agentes crioprotectores para limitar a formação de cristais de gelo, com subsequente fractura da amostra em azoto líquido temperaturas arrefeceu-se sob alto vácuo. A superfície de fractura resultante é replicado e estabilizado por meio de evaporação de carbono e platina a partir de um ângulo que confere a superfície pormenor tridimensional para o fundido. Esta técnica tem se mostrado particularmente esclarecedor para a investigação das membranas celulares e suas especializações e contribuiu consideravelmente para a compreensão da forma celular para a função das células relacionadas. Neste relatório, examinamos as exigências do instrumento e protocolo técnico para a realização decongelar-fratura, a nomenclatura e as características dos planos de fratura associada, variações sobre o procedimento convencional e os critérios de interpretação de imagens de congelamento e fratura. Esta técnica tem sido amplamente utilizada para a investigação ultra-estrutural em muitas áreas da biologia celular e promete ser uma técnica de imagem molecular para emergentes, nanotecnologia, e os estudos de ciência dos materiais.

A premissa fundamental de interpretação da imagem criofratura é que planos de fratura atravessar a bicamada lipídica das membranas que conferem duas faces da fratura, chamado por convenção a PF-face (plasma fratura-face) e EF-face (extracelular fratura-face) (Figura 3). O PF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao citoplasma da célula e o EF-face é a metade da bicamada lipídica da membrana adjacente ao meio extracelular. A técnica de congelação-fractura é particularm...

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

São descritas as técnicas básicas e refinamentos de processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas e nanomateriais para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é um método preferido para revelar características ultra-estruturais e especializações de membranas biológicas e para a obtenção de dados dimensionais e espaciais de nível ultra-estrutural em ciências dos materiais e produtos da nanotecnologia.

Fundamental Elements Técnica de Freeze-fratura / Freeze-etch em Biológica de Microscopia Eletrônica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K visualizações.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  São descritas as técnicas básicas e refinamentos de processamento de congelamento e fratura de amostras biológicas e nanomateriais para exame por microscopia eletrônica de transmissão. Esta técnica é um método preferido para revelar características ultra-estruturais e especializações de membranas biológicas e para a obtenção de dados dimensionais e espaciais de nível ultra-estrutural em ciências dos materiais e produtos da nanotecnologia. 

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Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caracterização de calcificação eventos usando o Live Óptica e Microscopia Eletrônica de técnicas em um tubeworm Marinha

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparação da grade microscópica crio-elétron para estudos resolvidos pelo tempo usando um novo sistema robótico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Estratégias de Otimização da Aquisição de Dados de Tomografia Eletrônica Criogênica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congelamento rápido usando dispositivo de congelamento de sanduíches para boa preservação ultraestrutural de espécimes biológicos em microscopia eletrônica