Nano-sondas de raios-X síncrotrons recém-projetadas permitem a visualização da distribuição elementar de uma amostra. O uso de abordagens criogênicas é obrigatório para diminuir os danos causados pela radiação de raios-X. Portanto, uma criofixação rápida é essencial para a obtenção de células hidratadas congeladas para otimizar a preservação da estrutura celular e sua integridade química.
A especificidade das preparações celulares para estudos síncrotrons leva à otimização deste protocolo para aquisição de monocamadas de células hidratadas congeladas. A demonstração visual é importante para entender como manipular as amostras de monocamadas celulares para alcançar células reproduzivelmente criofixadas embutidas dentro de uma fina camada de gelo. Para preparar um suporte à membrana de nitreto de silício, abra a cápsula contendo o suporte da membrana e aperte suavemente a cápsula para afrouxar levemente o suporte.
Use pinças finas para agarrar um canto da estrutura de silicone tomando cuidado para não tocar na membrana de nitreto de silício no centro da moldura e colocar o quadro em uma placa de Petri descoberta em um armário de fluxo laminar. Em seguida, UV esterilizar a membrana por 25 a 30 minutos. No final da esterilização, adicione 10 microliters de fator de fixação, como poli-L-lysina.
Incubar por 25 minutos a 37 graus Celsius e a 5% de dióxido de carbono com umidade. Em seguida, encha os poços de uma placa estéril de 48 poços com 200 a 250 microliters de 0,22 micrômetros filtrados de água ultra pura e ultra-traço por poço. Use pinças finas para submergir cuidadosamente a membrana verticalmente com três enxágues consecutivos de 10 segundos em um poço de água.
Após a lavagem, coloque a membrana verticalmente em um poço vazio de uma placa estéril de 96 poços sob o capô de fluxo laminar e deixe-a durante a noite até secar. Para a semeadura das células de interesse, coloque a membrana revestida com o lado plano voltado para cima em um poço de uma placa estéril de quatro poços. Adicione cinco vezes 10 às quatro células em 10 microliters de um meio de cultura apropriado à superfície da membrana de nitreto de silício sem tocar na membrana.
A gota deve cobrir toda a membrana. Em seguida, cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono com umidade. Quando as células começarem a se prender ao substrato, adicione lentamente um mililitro de cultura completa na parede de cada poço que cobre cada membrana.
Em seguida, cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono com umidade. Para a crioimmobilização da preparação celular, primeiro ligue um freezer automático de mergulho e encha o número apropriado de poços em uma placa de plástico de 12 poços com 37 graus Celsius tampão de acetato de amônio. Imediatamente antes de enxaguar e mergulhar congelando a membrana, remova a amostra da incubadora e use o anel de grampo preto de um par de pinças de liberação rápida para desbloquear a pinça.
Use a pinça desbloqueada para agarrar o suporte da membrana e imergir a membrana verticalmente dentro da solução tampão de acetato de amônio por cerca de cinco segundos. Para remover qualquer excesso de tampão, pressione a parte inferior do suporte da membrana sobre o papel do filtro e borre cada lado da moldura no papel do filtro sem permitir que a membrana toque no papel. Quando o buffer em excesso tiver sido removido, abra a porta da câmara ambiental, deslize rapidamente a pinça para dentro do bloqueio de fórceps e feche a porta da câmara.
Pressione a mancha Um mergulho. As pinças que seguram a membrana de nitreto de silício serão rapidamente mergulhadas no criogen. Após o congelamento do mergulho, remova a tampa do recipiente de transferência com fórceps pré-resfriados e pressione a transferência.
A membrana de nitreto de silício será movida ligeiramente acima do criogen. Em um movimento único rápido, deslize e incline ligeiramente as pinças para fora do bloqueio dos fórceps para trazer a pinça diretamente para um slot vazio da caixa de criobox no recipiente de transferência cheio de líquido nitrogênio. Em seguida, solte o anel de grampo preto para liberar a membrana.
Para a secagem congelante das células congeladas, use o interruptor de roqueiro localizado no painel traseiro do instrumento de secagem congelante para ligar o instrumento. O visor mostrará a entrada da prensa quando estiver pronto para carregar a amostra. Monte o suporte de latão de membrana de nitreto de silício em cima do suporte de transferência de amostra fornecido pelo fornecedor no recipiente de armazenamento de poliestireno mantendo o nível de nitrogênio líquido para cerca de um a dois milímetros abaixo da borda superior da primeira peça de latão.
Coloque a membrana com o lado da amostra celular voltada para cima na cavidade numerada do suporte de latão e pré-esfrie a haste de transferência em uma caixa de espuma de poliestireno cheia de nitrogênio líquido. Use a haste para travar em conjunto completo, pressione digitar para quebrar o vácuo para liberar a tampa da câmara de secador congelante, transfira imediatamente a amostra na câmara de secador congelante e feche a tampa da câmara de secador congelante. Em seguida, pressione imediatamente comece a continuar com o ciclo de secagem congelante.
No final do ciclo de secagem congelante, pressione parar para ventilar a câmara e remova o conjunto completo para acessar as amostras congeladas. Aqui, uma visão típica do microscópio óptico de vídeo de células de células cancerígenas de mama hidratadas congeladas subcultadas em um suporte de membrana de nitreto de silício revestida de poli-L-lysina, como demonstrado, é mostrado. O mapeamento elemental de fluorescência de raios-X das células hidratadas congeladas revela as distribuições de elementos fisiológicos como potássio, enxofre e zinco.
Neste exemplo representativo, o elemento enxofre firmemente ligado foi distribuído uniformemente dentro da célula em um padrão semelhante ao observado para potássio e representa uma boa estimativa do perfil de massa celular. A distribuição de zinco, no entanto, apresentou maior sinal dentro do núcleo do que no citosol com uma separação claramente definida do sinal entre o citosol e o núcleo. Nesta visão típica de microscopia brightfield de neurônios hipocampais de camundongos primários congelados diretamente cultivados em uma membrana de nitreto de silício, como demonstrado, as células exibem uma morfologia neural típica que não é afetada por sua cultura ou método de preservação.
Imagens de fluorescência de raios-X de células congeladas também revelam distribuições elementares típicas exibidas por essas células secas congelantes representativas a uma resolução espacial de 50 a 100 nanômetros. Traçar a janela de nitreto de silício é fundamental para obter a camada de gelo mais fina possível de células após o congelamento do mergulho. A preservação da integridade química das células no nível subcelular permite que o metallome das células seja explorado com nano-sondas síncrotrons, bem como com outras técnicas microanalíticas.
Como nem toda análise de nanodessíntrona pode ser realizada à temperatura criogênica, as células hidratadas congeladas podem ser ainda mais congeladas para facilitar sua análise à temperatura ambiente. Lembre-se de usar equipamentos de proteção individual adequados ao trabalhar com nitrogênio líquido e sempre usar gás etano em um capô de fumaça longe das chamas.
