Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1 Preparação das Câmaras de Migração <ol><li> Prepara-se uma geleia de parafina / petróleo (1: 1) mistura e aquecimento até que a mistura tenha derretido. Usando um pincel e desenhar 2-3 camadas da geleia de parafina / petróleo (1: 1) misturar no meio da placa de vidro, em conformidade com as Figuras 1B-1D. NOTA: Nós estamos usando lâminas de vidro comum (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (W / D / H)) </li><li> Aplicar a mistura de geléia de cera de parafina / petróleo derreteu rapidamente sobre a lâmina de vidro para evitar a solidificação enquanto desenha. Certifique-se a camada de geléia de cera de parafina / petróleo é de cerca de 2-2,5 cm de comprimento e 0,3-0,5 cm de largura. A espessura da camada de geleia de parafina / petróleo deve ser de cerca de 0,1-0,15 cm. </li><li> Adicionar uma lamela para a cera de parafina solidificada / petróleo mix geléia e selá-lo com duas a três camadas de parafina mix geléia de cera / petróleo (Figuras 1E, 1F). Use 4-8 câmaras de migração para uma experiência de migração celular comum. Câmaras lugar de migração iN posição vertical em um rack. </li></ol> 2 Preparação do Colágeno Suspensão Mix celular <ol><li> Colheita (por exemplo, com 0,25% de tripsina / EDTA) e contagem de células de interesse. Ressuspender as células em meio completo contendo soro fetal de vitelo (FCS), antibióticos e os suplementos recomendados. Prepare 4-8 1,5 ml tubos de reacção e 20 ul de suspensão de células contendo 4-6 x 10 4 células (o número total de células depende do tipo de célula a ser analisada), e encher até 50 ul com meio completo. NOTA: Outros compostos (por exemplo, factores de crescimento, quimiocinas, inibidores, etc) são adicionados à suspensão de células. Utilizar soluções de reserva apropriadas de tal modo que o volume final da suspensão de células não exceda 50 ul. </li><li> Prepare um montante total de 452 suspensão de colagénio último ul por quatro experimentos de migração celular. Adicionar 50 ul de 10x MEM (pH 5,1-5,5) e 27 ul de solução de bicarbonato de sódio a 7,5% (pH de 9,0-9,5) Para um tubo de ensaio 1,5 ml e misture bem. Observe a cor da solução passar de amarelo-laranja para roxo intenso (pH 9,0-9,5). Adicionar suspensão de colagénio 375 mL de líquido para o / solução de bicarbonato de sódio 10x MEM e misture bem. O pH da suspensão de colagénio final deverá ser de cerca de 7,5 (indicado por uma cor púrpura clara). Nota: Verifique o pH da solução de bicarbonato de sódio a 7,5%. Se o pH é cerca de 7,5 lugar a uma solução de bicarbonato de sódio, com uma tampa aberta de uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para ser saturada com CO 2 e aumentar o pH (cerca de 9,0-9,5). O pH da mistura de células em suspensão de colagénio é essencial para a estabilidade da rede de colagénio. Se ele for muito baixa, o colagénio reticulado entrará em colapso durante a experiência de migração de células. NOTA: Para este protocolo, utilize o colágeno líquido (pH 1,9-2,2) da traseira bovina (2,9-3,3 mg / ml de colágeno e 95% de colágeno tipo I, 5% de colágeno tipo IV). Exemplos de protocolos de preparação adicional de colagénio reticulado usandocolágeno tipo I a partir de outras fontes, tais como suínos ou rato, são dadas em 32,33. Não mude os volumes das soluções utilizadas como isso irá alterar a concentração final de colagénio de 1,67 mg / ml do látice. A concentração de colagénio mais elevado ou mais baixo tem um impacto sobre a densidade de fibras de colagénio e a distância média entre eles concomitante com as células de comportamento migratório 34. </li><li> Adicionar 100 ul da suspensão de colagénio final para 50 mL de suspensão de células e misturar thoroughly.The suspensão de colagénio final (1,67 mg / ml de colagénio) é ligeiramente viscoso. Para transferir o valor correcto (100 ul), pipetar a solução de colagénio final, uma vez para cima e para baixo, antes de transferi-lo para a suspensão de células. NOTA: Uma vez que a mistura de células em suspensão de colágeno é combinado com a solução de bicarbonato de sódio / 10x MEM eo valor de pH foi alterado para 7,5 fibras de colágeno começar imediatamente a polimerização. </li><li> Transferir a mistura de células em suspensão de colagénio final the tubos de reação para as câmaras de migração. Bater levemente na câmara de migração para distribuir igualmente a mistura de células em suspensão de colagénio na parte inferior da câmara de migração (Figura 1H). Colocar as câmaras de migração em posição vertical numa prateleira e incubar durante cerca de 30 min (37 ° C, 5% CO 2) para permitir que a polimerização das fibras de colagénio. </li><li> Observe que a estrutura de colágeno polimerizado é um pouco turva, mas continua a ser luz de cor roxa. Encha as câmaras de migração com meio completo ou médio completo com suplementos de interesse e selar a câmara de migração com a mistura de geléia de cera de parafina / petróleo (Figuras 1I, 1J). </li></ol> 3. registro e análise da migração celular Esta seção descreve a gravação da migração de células por microscopia de lapso de tempo vídeo e análise da migração celular por rastreamento de células manual. <ol><li> Ligue o microscópio eo hea estágio do microscópioter. Ajustar a temperatura para 37 ° C. Use uma objetiva de 10X. Coloque câmara de migração sob um microscópio e concentrar aproximadamente 50 ou mais células no campo de visão. </li><li> Migração celular Grave no modo de lapso de tempo usando um aplicativo de software de vigilância de vídeo multi-câmera. Salve filmes de migração celular em um formato apropriado, por exemplo, &quot;* avi&quot; ou &quot;* mov&quot;. Vincular os arquivos de filmes de migração celular para um banco de dados contendo informações de apoio, tais como tipo de célula e condições experimentais. NOTA: Estamos gravando linfócitos e hspCs por até 2 horas usando um fator de lapso de tempo de 1:80, o que significa que 0,75 s em time-lapse é igual a 1 min em tempo real. As células tumorais são células de movimento lento e são, assim, registada por pelo menos 16 horas usando um factor de lapso de tempo de 1: 1.800 (0,5 seg no lapso de tempo é igual a 15 minutos em tempo real). </li><li> Analisar filmes de migração celular, usando um aplicativo de software de rastreamento de células apropriado, como plugins de software ImageJ(Uma visão geral é dado em 18). Para uma análise imparcial, é de crucial importância que as células serão selecionados aleatoriamente, sem o conhecimento se as células são migratórias ativa ou não. NOTA: Nós estamos usando um aplicativo de software de auto-desenvolvimento para controlar manualmente os caminhos de pelo menos 30 células por experimento, seguindo as células de movimento com precisão com o cursor do mouse (que está posicionada para o núcleo). Durante a perseguição, os xy coordenadas das células controladas são automaticamente determinados de acordo com o modo de lapso de tempo utilizado. Para linfócitos / hspCs xy coordenadas são determinadas cada 0,75 segundos (igual a 1 min em tempo real), enquanto que para as células tumorais XY coordenadas são determinadas cada 0,5 segundos (igual a 15 min em tempo real). </li><li> Determine um total de 60 xy coordenadas por célula para uma experiência de migração celular comum. Este é igual a 1 hora em tempo real para os linfócitos / hspCs e 15 h de tempo real para as células tumorais. Um &quot;,&quot; uma célula indica que não se moveu entre two pontos de tempo, ao passo que um &quot;valor numérico&quot; indica a distância em &quot;pixels&quot; de uma célula se tenha mudado entre dois pontos de tempo (Figura 2A). NOTA: rastreamento de celular manual requer experiência. Células que migram rápido Particularmente são difíceis de detectar e de cada tipo de célula apresentam um comportamento migratório distinto que pode ser desencadeada por fatores suplementados. Em caso de divisão celular ao seguir, escolha aleatoriamente uma célula filha para o acompanhamento contínuo. As células que migram para fora do campo de visão ou morrem enquanto o rastreamento não são negligenciados, mas que foram considerados para a análise. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Analisar os dados de rastreamento de celular, usando um aplicativo de software adequado, por exemplo, um programa de planilha. <ol><li> Analisar os dados de rastreamento de celular, copiando o rastreamento de dados brutos (Figura 2A) celular, em um modelo de planilha auto-concebidos. Multiplique soma dos &quot;valores numéricos&quot;, representandoa distância total de uma célula migrou com um fator de correção para converter &quot;pixel&quot; em &quot;? M&quot;. </li><li> Determinar dois parâmetros de migração de células: A actividade locomotora (que é equivalente à taxa de migração) e tempo de movimento activo (Figuras 2C, 2D). </li><li> Identificar as células que migraram menor do que 25 um (nível limiar para reduzir o número de células de falsos-positivos) como células que não se mover. &quot;Substituir&quot; valores numéricos destas células com &quot;,&quot;. NOTA: O parâmetro (ou taxa de migração) &quot;atividade locomotora&quot; representa a porcentagem de células da população de células controladas que se mudaram entre dois pontos no tempo (Figura 2D). Um &quot;valor numérico&quot; é definida como uma célula em movimento, ao passo que &quot;,&quot; é definido como uma célula não-móveis. O parâmetro &quot;tempo de movimento ativo&quot; (ativa) representa a porcentagem do tempo total de uma célula migrou em relação ao período de tempo do período de observação (Figura 2C). Um &quot;valor numérico&quot; indica que uma célula se desloca, ao passo que &quot;,&quot; indica que a célula não se moveu. Este parâmetro é mais utilizado para determinar o número de células que não se tenha mudado. </li></ol></li><li> Calcule significância estatística e de visualização de dados de migração celular. <ol><li> Calcula significância estatística da actividade locomotora significativo da células (taxa de migração) usando o teste de Mann-Whitney. Considere p &lt;0,05 como significativo. </li><li> Mostrar a atividade locomotora médio de células como xy-diagrama, BoxPlot diagrama, ou como um diagrama de gráfico de barras. Mostrar os dados baseados em células individuais, tais como o tempo de movimento ou de velocidade ativo, como um diagrama de gráfico de barras ou como um histograma. NOTA: Se o aplicativo de planilha escolhido não contém uma tabela ou gráfico histograma ferramenta BoxPlot uma pesquisa on-line deve ser realizada para procurar tu adequadotorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

A capacidade de migrar é uma característica de células tumorais 4. Sem a capacidade de separar a partir do tumor primário e migração das células tumorais através de tecidos conjuntivos circundantes não irá ser capaz de propagar lesões secundárias, que são a principal causa de morte de quase todos os pacientes com cancro. Devido a esta relação muitos estudos estão se concentrando na migração de células cancerosas. O objectivo destes estudos é a identificação de novas moléculas de alvo e ...

Como a fusão celular (para uma síntese ver 1,2) migração de células de um outro fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e respostas imunes (para revisão ver 3). No entanto, a capacidade de migrar também é um pré-requisito para as células tumorais de metástases (para revisão ver 3,4). A migração celular é um complexo, não processo ainda totalmente compreendido que é dirigido pela interação de diversas vias de transdução de sinal iniciada por vários ligante (por exemplo, citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, hormônios, componentes da matriz extracelular) do receptor (por exemplo, receptores tirosina-quinase, receptores de quimiocinas, integrinas) interações cinco causando finalmente a reorganização do citoesqueleto de actina concomitante com mento e montagem de complexos de adesão focal e integrina mediada sinalização 6. in vitro e in vivo, os ensaios de migração de células foram desenvolvidas nas últimas décadas, incluindo o ensaio de câmara de Boyden / transwell 7, zero ensaio / ferida ensaio 8-10, tridimensional (cura 3D) ensaio de migração de 11 matriz de colagénio, bem como intravital imagiologia / microscopia (para revisão, ver 12). Cada um destes ensaios de migração celular tem prós e contras, por exemplo, em matéria de custos e necessidade de equipamentos, manipulação e confiabilidade dos dados obtidos. Tanto a câmara de ensaio Boyden / transwell e o ensaio de ensaio de risco / a cicatrização de feridas são fácil, baixo custo e ensaios bem desenvolvidos para medir a migração de células in vitro 7-10. Na câmara de Boyden / transpoï¿½ células de ensaio são semeadas em cima de um inserto contendo poros (cerca de 8 um de diâmetro) - o chamado compartimento superior 7. Opcional, a pastilha pode ser revestida com m extracelularAtrix componentes, por exemplo, fibronectina, colagénio, etc, para simular um ambiente mais fisiológico. Da mesma forma, as células endoteliais podem ser cultivadas no topo do inserto, imitando assim uma barreira de células endoteliais 13. Aquelas células que passaram através dos poros durante um intervalo de tempo definido para o compartimento inferior que alberga os meios e suplementos, tais como factores de crescimento e quimiocinas, são utilizados como um limite ler para quantificar a migração de células (ou extravasamento). No ensaio de risco / células de ensaio de cicatrização de feridas são semeadas em placas e são cultivadas até à confluência de 10. Em dependência das placas de ajuste experimentais poderia ser pré-revestido com componentes da matriz extracelular, como a fibronectina. Depois de criar um risco / ferida por raspagem das células em monocamada de células individuais a partir de cada lado da raiz / ferida pode migrar para dentro do fosso, enchendo desse modo / curando-10. A distância entre os dois lados do Scratch / feridas é determinadaem dependência do tempo e é utilizado como um limite para ler a actividade migratória das células 10. No entanto, para discriminar entre a proliferação de células (que também pode resultar em enchimento / cura do arranhão / ferida) e a migração das células, recomenda-se combinar o ensaio com videomicroscopia de lapso de tempo e de uma única célula de rastreamento 10. No entanto, tanto o ensaio Boyden câmara / transwell e zero ensaio / ferida teste de cura, são bastante imperfeito, relativo a um ambiente celular fisiológica semelhante. Na câmara de Boyden / células de ensaio Transwell ter para migrar através de um poro de plástico, enquanto que no ensaio de risco / ensaio de cicatrização da ferida células são semeadas num prato de plástico pré-revestidos bidimensional. Do mesmo modo, é bem reconhecido que o comportamento migratório difere marcadamente entre um ambiente bidimensional e 3D 3. Por exemplo, aderências tridimensional de matriz de fibroblastos diferem das adesões focais e fibrilares caracterizados em doissubstratos dimensionais no seu conteúdo de α5β1 e integrinas aVp3, paxilina, outros componentes do citoesqueleto, e fosforilação de tirosina-quinase de adesão focal 14. Da mesma forma, as células embutidas dentro de um ambiente 3D também exibido um comportamento migratório alterado 15. Assim, para analisar a migração de células de forma mais precisa de um ensaio de migração é recomendado que permite medir a migração de células individuais dentro de um ambiente fisiológico ou fisiológico semelhante a 3D. Imaging / microscopia intravital é o padrão-ouro para medir a migração de células dentro de um contexto fisiológico 3D. Isto não só pertencem a interacções célula-matriz extracelular, mas também às interacções entre os diferentes tipos de células, tais como células de tumor e células endoteliais durante o extravasamento 16 ou o tráfico de linfócitos no nódulo linfático 17, o qual, até à data, é possível devido à melhoria das técnicas de microscopia de fluorescência, tais como 2-fótonsA microscopia confocal de varrimento laser, o uso de corantes fluorescentes vitais e estirpes de ratos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes derivados 12,16,17. Além disso, a imagem / microscopia intravital poderia ser combinada com rastreamento de células manual e automatizado 18. No entanto, por causa da necessidade de um microscópio confocal de varrimento laser 2-fotão, bem como os animais (e em modelos animais transgénicos adequados) imagiologia / microscopia intravital é uma técnica bastante dispendioso. Para ultrapassar as limitações da câmara de ensaio Boyden / transwell e o ensaio de cicatrização zero ensaio / ferida e para analisar a migração de diferentes tipos de células dentro de um ambiente de 3D ​​do ensaio de migração de matriz de colagénio 3D foi desenvolvido 11,19. Desse modo, as células migram estão embutidos dentro de uma rede de fibras colágenas 3D, o que mais se assemelha à situação in vivo. Conjuntamente, devido ao lapso de tempo microscopia vídeo migração celular real é medido permitindo a determinação de vários parâmetros de migração, bem como suas alterações, em resposta a fatores ou inibidores de pro-migratórias. Vários tipos de células podem ser analisados ​​utilizando esta técnica, incluindo linfócitos e leucócitos 11,20, tronco hematopoiéticas / progenitoras 21-24 e células tumorais 5,25-29. Além de células individuais também célula ou agregados esferóides poderia ser incorporado no interior da matriz de colagénio com concomitante análise da emigração de células isoladas a partir do agrupamento de células / esférica para o colagénio treliça 30,31. Este protocolo apresenta uma visão geral sobre uma técnica simples, mas poderosa para analisar o comportamento migratório de diferentes tipos de células dentro de um ambiente 3D - um método in vitro resultando em resultados que estão perto a situação in vivo.

<table><tbody><tr><td>Leica DM IL inverted microscope</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope stage heater</td><td>Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JVC C1431 video camera</td><td>JVC, Bad Vilbel, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axis 241Q video server</td><td>Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mac G5 Computer</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FileMaker Pro</td><td>FileMaker GmbH, Unterschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td><td>Bensoftware, London, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runtime Revolution Media 2.9.0</td><td>RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>A4264</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>local drug store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol (liquid collagen)</td><td>Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td><td></td><td>contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate solution</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>U73122</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>662035</td><td>dissolve first in CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;; reconstitute in DMSO just prior to use</td></tr></tbody></table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

A capacidade de migrar é uma característica de vários tipos celulares e desempenha um papel crucial em diversos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas, e respostas imunes. Contudo, a migração celular é também um mecanismo de chave no cancro permitindo estas células cancerosas para separar a partir do tumor primário para iniciar a propagação metastática. Nos últimos anos vários ensaios de migração de células foram desenvolvidas para analisar o comportamento migratório das diferentes tipos de células. Porque o comportamento locomotor de células difere marcadamente entre uma a duas dimensões (2D) e do ambiente tridimensional (3D), pode presumir-se que a análise da migração de células que são incorporados dentro de um ambiente 3D produziria na migração de células mais significativa dados. A vantagem do ensaio de migração de matriz de colagénio 3D é descrito que as células estão embutidos dentro de uma rede 3D fisiológica de fibras de colagénio que representam a principal componente da matriz extracelular. Devidotime-lapse microscopia vídeo migração celular real é medido permitindo a determinação de vários parâmetros de migração, bem como suas alterações em resposta a fatores ou inibidores da pro-migratórias. Vários tipos de células podem ser analisadas usando esta técnica, incluindo linfócitos / leucócitos, as células estaminais e as células tumorais. Da mesma forma, também grupos de células ou esferóides poderia ser incorporado dentro da matriz de colágeno concomitante com a análise da emigração de células individuais do grupo de células / esferóide na malha de colágeno. Conclui-se que o ensaio de migração 3D matriz de colagénio é um método versátil para analisar a migração de células dentro de um ambiente fisiológico 3D-like.

O ensaio de migração matriz 3D-colagénio utilizado combinado com lapso de tempo de video-microscopia de rastreamento e de células assistida por computador permite a determinação de vários parâmetros, incluindo a migração de células, tanto do parâmetro de base populacional (por exemplo, a média de actividade locomotora) e parâmetros baseados em células individuais (por exemplo, tempo de movimento ativo, velocidade, distância migrados). Um exemplo dos conjuntos de dados de rastreio de cé...

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

A migração celular é um fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de parâmetros fisiológicos, tais como a cicatrização de feridas e de respostas imunes, e processos patofisiológicos, como o cancro. O ensaio de migração matriz 3D-colagénio é um instrumento versátil para analisar as propriedades migratórias de diferentes tipos de células dentro de um ambiente fisiológico semelhante a 3D.

Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.6K visualizações.  Witten/Herdecke University.  A migração celular é um fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de parâmetros fisiológicos, tais como a cicatrização de feridas e de respostas imunes, e processos patofisiológicos, como o cancro. O ensaio de migração matriz 3D-colagénio é um instrumento versátil para analisar as propriedades migratórias de diferentes tipos de células dentro de um ambiente fisiológico semelhante a 3D. 

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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Bioengenharia

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Em células vivas, imagens de células que expressam proteínas fluorescentes Migrando-marcado em uma matriz tridimensional

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Estudo da migração celular em Canais microfabricados

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medicina

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Sistema de Gel Concentric para estudar o papel Biofísica da Matrix Microenvironment sobre a migração celular 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantificando a migração celular tridimensional dentro e dentro de biomateriais de hidrogel granular

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...