O JDM foi apoiado por uma bolsa de doutorado do INSERM / Région Aquitaine e agora é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do ARC e o Tisch Cancer Institute na Mount Sinai School of Medicine. A EH é apoiada por um doutorado do Ministério da Educação Superior e da Investigação. A ZE é apoiada por uma bolsa pós-doutoral da Agência Nacional de Pesquisa (ANR). O CM é apoiado pelo Instituto de Câncer Tisch na Faculdade de Medicina Mount Sinai e JJBC é apoiado pela concessão do NIH / NCI K22CA196750, o Fundo JJR do Prêmio Científico Científico da TCI e pelo Instituto Tisch Cancer na Escola de Medicina Mount Sinai. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS é apoiado pela &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;. VM e FS são suportados pelo financiamento da &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; e Institut National du Cancer, INCA_8036 e PLBio2012.

NOTA: Antes da fixação, todas as etapas são completadas em uma capa de fluxo laminar estéril. 1. matriz 2D NOTA: as matrizes 2D são usadas para determinar a porcentagem de células que formam invadosomes e a área de degradação da matriz por célula. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Figura 1: Protocolo. Resumo do protocolo utilizado para preparar matrizes de gelatina e colágeno I. É possível fazer apenas a matriz de gelatina ou uma matriz mista de gelatina e colágeno I. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Matriz de gelatina NOTA: As matrizes de gelatina fluorescente são usadas para quantificar a degradação da matriz e a gelatina não fluorescente é usada para promover a adesão das fibras de colágeno I. Tapete de gelatina fluorescenteOs arroz são também utilizados para estudos de podosomas e invadopodias (ver Figura 1 ). <ol><li> Sob um capuz de fluxo laminar estéril, coloque um parafino (20 cm x 15 cm) na área de trabalho e desinfecte-o com etanol a 70%. </li><li> Alíquotas 20 μL de gotículas de 1 mg / mL de gelatina em uma linha, espaçadas aproximadamente a 1 cm de distância; Consulte a Figura 1 para organização de gotículas. </li><li> Cubra cada 20 μL de gotícula de gelatina com um lamínula de vidro autoclavado (12 mm de diâmetro). </li><li> Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Se a gelatina estiver fluorescente, proteja-a da luz. </li><li> Alíquotas de 40 μL de gotículas de 0,5% de glutaraldeído em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da linha de lamínulas do passo 1.1.3. CUIDADO: O glutaraldeído é um agente fixador tóxico. Use luvas e não inspire. </li><li> Usando fórceps jewelled, transfira cada lamela revestida de gelatina para uma gota de glutaraldeído. AnoteÉ normal que uma pequena gota de gelatina permaneça no parafilme. Não reutilize isso para outro experimento. </li><li> Incubar durante 40 min à temperatura ambiente. Para lamínulas fluorescentes, proteja-os da luz. </li><li> Pegue uma placa de cultura de células de 24 poços e preencha cada poço com 500 μL de 1x PBS estéril. Coloque os lamínulas, com a gelatina voltada para cima, em cada poço. </li><li> Lave duas vezes em 1x PBS por 5 minutos cada. NOTA: Nesta etapa, os lamínulas podem ser usadas para experimentação ou armazenadas em 1x PBS a 4 ° C. Os lamínulas não fluorescentes podem ser armazenados por uma semana, e lâminas fluorescentes podem ser armazenadas por 48 h. </li></ol></li><li> Matriz de tipo I do colágeno fibrilante NOTA: A matriz de colágeno tipo I de fibrilação é utilizada para estudar a formação de invadosoma linear e a degradação da matriz associada. Uma combinação de colágeno fluorescente I e lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para colocar os marcadores invadossais com fibras de colágeno ( por exemplo, F-actina iN o canal distante, o colágeno I no canal vermelho, o Tks5 no canal verde e o tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Por outro lado, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para maximizar o número de marcadores de invadosoma corados ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, cortactina no canal vermelho, Tks5 em O canal verde e tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Finalmente, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina fluorescentes é usada para quantificar a degradação associada à gelatina ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, Tks5 no canal vermelho, no canal verde e tintura Hoechst Para uma mancha nuclear) (ver Figura 1). O tinte Hoechst é usado para manchar o núcleo, e também verifica a contaminação por micoplasma, além de um teste de PCR feito regularmente nas linhas celulares utilizadas. <ol><li> Colágeno fluorescente I <ol><li> Use colágeno comercial que extrai do tendão do rato-cauda em 0,02 N de ácido acéticoD. Retirar a quantidade de colágeno necessário para preparar 500 μL de solução por lamínula a uma concentração final de 0,4 mg / mL de colágeno I. </li><li> Adicionar éster succinimidílico de 5-carboxi x rodamina a uma concentração final de 10 μg / mL, calculado para o volume final da solução de colagénio I (nx 500 μL). </li><li> Misturar a solução pipetando para cima e para baixo e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Diluir para o volume final com 1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contendo cálcio e magnésio, e usar diretamente. </li></ol></li><li> Cobertura do colágeno Fibrilar I <ol><li> Use os lâminas de gelatina não fluorescentes ou fluorescentes previamente preparadas no passo 1.1. </li><li> Prepare uma solução de colágeno fluorescente ou não fluorescente I em uma concentração final de 0,4 mg / mL em DPB 1X contendo cálcio e magnésio. </li><li> Adicionar 500 μL de solução de colágeno I fluorescente ou não fluorescente porLamínula em uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Incubar durante 4 h a 37 ° C para a polimerização de colágeno I. </li><li> Após a incubação, remova o excesso de colágeno I inclinando a placa e pipetando no lado do poço (não diretamente na lamínula) para evitar danificar a matriz. NOTA: Esta matriz não pode ser armazenada. Semeie as células imediatamente após remover o excesso de colágeno I. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Semeadura de células, tempo de cultura e fixação <ol><li> Dependendo do tipo de célula, prepare as células no meio de cultura apropriado e adicione células para um volume final de 500 μL por poço. </li><li> Para caracterizar a capacidade de uma linha celular para formar invadossomas lineares e para degradar a matriz, prenda as células por 4 h, 12 h e 24 h na matriz de colágeno I para determinar a cinética da formação de invadosoma linear e a atividade de degradação associada. NOTA: A Tabela 1 contém exemplos de linhas celularesTestado em laboratório. <table border="1"><tbody><tr><td> Linha celular </td><td> Número de células por capa </td><td> Tempo de contato com a matriz para quantificação de invadosoma linear </td><td> Tempo de contato com a matriz para quantificação da atividade de degradação do invadosoma linear </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> HUH7 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> NIH 3T3, src </td><td> 30.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50,000 </td><td> 6 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h &amp;# 160; </td></tr><tr><td> CRU </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Referência de semeadura celular e tempo de incubação. Esta tabela apresenta uma lista não exaustiva de linhas celulares usadas para estudar invadossomas lineares. Indica o número de células para semente na matriz, o tempo necessário para observar invadossomas lineares e o tempo necessário para observar a degradação da matriz associada. Os invadosomes lineares têm uma vida curta. Para poder observar invadossomas lineares no número máximo de células, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um curto período de tempo. Por outro lado, para poder visualizar a degradação de gelatina relatada, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um período de tempo maior que os listados acima. </li><li> Após a remoção do meio de cultura de células,Conserte os lamínulas durante 10 minutos em 500 μL de paraformaldeído a 4% em PBS 1X. </li><li> Lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Armazenar a 4 ° C, protegido da luz. </li></ol> 3. Imunofluorescência <ol><li> Permeabilize as células por 10 min com uma solução fresca. De Triton X-100 a 0,2% em 1x PBS. Não reutilize esta solução. </li><li> Lave os lamínulas duas vezes com 1x PBS. </li><li> Coloque um parafino (20 cm x 15 cm) no banco. </li><li> Diluir o anticorpo primário em 4% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS, conforme descrito na Tabela de Materiais . </li><li> Alíquotas de 50 μL de gotículas de solução de anticorpo primário em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente a 1 cm de distância. </li><li> Coloque cada lamínula sobre uma gota. </li><li> Incube durante 40 min à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Após o período de incubação, lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Diluir o anticorpo secundário, faloidina e tintura Hoechst em 4% BSA em 1xPBS. </li><li> Alíquotas de 50 μL de gotículas da mistura, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da primeira linha de lamínulas, conforme feito anteriormente. </li><li> Coloque cada lamínula sobre uma gota. </li><li> Incube durante 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Após a incubação, lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Lave uma vez com água destilada para remover os sais. </li><li> Monte os lamínulas em uma lâmina de vidro com meio de montagem de polimerização. </li><li> Deixe os cobertores secar durante a noite à temperatura ambiente, protegidos da luz, antes da microscopia. </li></ol> 4. Quantificações <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação do invadosoma linear. A macro requer imagens confocadas de F-actina e coloração Tks5 (formato: 1.024 x 1.024). ( A ) Primeiro, abra a imagem F-actina e faça uma máscara. ( B ) Então, abraA imagem Tks5 e limita-a. Aplique a macro. ( C ) Os resultados analisados ​​aparecerão em duas tabelas. O número de invadosomes lineares por célula e outras informações, como a área de porcentagem usada por invadoss linux na célula, estará na tabela Resumo. O tamanho de cada invadosoma linear será na tabela de resultados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Porcentagem de células que formam invadossomas lineares <ol><li> Contar as células que formam invadossomas lineares, aproximadamente 100 células por lamelas (use triplicados técnicos). Quantifique pelo menos 300 células por n, com n = 3. </li><li> Calcule a porcentagem de células que formam invadossomas lineares, tomando a média de três experiências independentes, resultando em 900 células quantificadas. </li></ol></li><li> Tamanho e número de invadosome linear de células <li> Use ImageJ com a macro suplementar. </li></ol></li><li> Degradação por célula <ol><li> Use três lamínulas por condição. </li><li> Pegue 30 imagens por lamínula de gelatina fluorescente e núcleos manchados com Hoechst. </li><li> Use o software ImageJ como descrito em Martin KH et al. 9 . </li></ol></li></ol> 5. Ensaio de invasão de colágeno 3D <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> Figura 3: esquema de ensaio de invasão. Resumo do protocolo de ensaio de invasão. O colágeno I é reticulado com corante de éster succinimidílico e polimerizado durante 1 h a 37 ° C. As células são adicionadas em meio isento de soro em cima do plugue de colágeno I. A inserção é colocada em média wi10% FBS. Os tampões de colágeno I são fixados 1 h após a semeadura celular no controle e 3 dias após a semeadura celular na condição experimental para determinar a capacidade de invasão das células. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Preparação de plugue de colágeno e eu <ol><li> Faça um curso de tempo de 4 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h para o primeiro experimento para determinar a cinética de invasão no gel de acordo com o tipo de célula. Para cada experiência, adicione um ponto de tempo de 1 h como um ponto de tempo de referência quando não ocorre uma invasão. </li><li> Prepare a solução de colágeno I no gelo sob uma capa de fluxo laminar estéril. Prepare 500 μL de solução para 3 inserções de câmara Boyden. </li><li> Aspirar 1 mg de colágeno comercial de rato-cauda I para preparar uma solução com uma concentração final de 2 mg / mL de colágeno I. </li><li> Adicionar 5-carboxi x éster succinimidílico de Rhodamine aUma concentração final de 1 μg / mL, calculada para o volume final da solução de colágeno I (neste caso, 500 μL). </li><li> Misture bem e incube durante 5 minutos no gelo sob o capô de fluxo laminar estéril, protegido da luz. </li><li> Adicionar 50 μL de PBS 10X arrefecido com gelo e 6,25 μL de hidróxido de sódio 1 M gelado (NaOH). </li><li> Adicione água estéril de acordo com a fórmula 443.75 - x μL de colágeno I. </li><li> Adicione 100 μL de solução por inserção da câmara de Boyden. </li><li> Incubar durante 1 h a 37 ° C para permitir a polimerização. </li><li> Adicionar meio de cultura celular enriquecido com soro fetal bovino (FBS) em novos poços; Coloque inserções nesses poços. </li><li> Semeiam 30 mil células em cima do colágeno que eu conto em meio sem FBS. </li><li> Após a cultura das células a 37 ° C, coloque o tampão de colagénio I durante 30 minutos em paraformaldeído a 4% em 1x PBS. </li><li> Imunofluorescência completa como no passo 3, com exceção das seguintes etapas: permeabilidadeZe com 0,2% de Triton X-100 em 1x PBS durante 30 min, não 10 min; Incubar com soluções de anticorpos primários e secundários por 1,5 h cada, em vez de 40 min e 30 min, respectivamente. Mancha para F-actina ou núcleos para localizar as células. </li><li> Após imunofluorescência, use um bisturi para cortar a membrana da inserção e transferir cuidadosamente o plugue de colágeno I para um prato de fundo de vidro. Certifique-se de que a parte superior do plugue de colágeno I esteja em contato com o vidro. Mantenha a membrana de inserção ligada ao fundo do plugue de colágeno I para manter a integridade do plugue. NOTA: O plugue de colágeno I permanece intacto no prato de fundo de vidro. A profundidade entre o fundo de vidro eo plástico que circunda o fundo de vidro é equivalente à espessura do bujão. </li><li> Coloque um lamínula no plugue de colágeno I e monte com o meio de montagem de polimerização para evitar que o plugue seque. </li><li> Use um microscópio confocal invertido para projetar o plugue de colágeno I; O topo deO plugue está em contato com o fundo de vidro do prato. <ol><li> Adquira uma pilha z da parte superior para a parte inferior do plugue de colágeno I para visualizar a invasão celular. Determine a espessura da pilha z ao examinar quão profundamente as células invadem o campo de imagem. Execute aquisições com um objetivo de óleo 40X em um formato de 512 x 512 com um tamanho de passo z de 0,25 μm. NOTA: Para referência, a pilha média de células MDA-MB-231 3 dias após a semeadura é de 30 μm. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li><li>Gilkes, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+prolyl+hydroxylases+are+essential+for+breast+cancer+metastasis.">Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis.</a> Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).</li><li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degrading+Devices:+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion.">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).</li><li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'ins'+and+'outs'+of+podosomes+and+invadopodia:+characteristics,+formation+and+function.">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li><li>Di Martino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Tks5:+a+minimal+and+universal+molecular+signature+for+functional+invadosomes.">Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes.</a> Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).</li><li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+invasion+by+tumour+cells:+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia.">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+type+I+collagen+organization+induces+the+formation+of+a+novel+class+of+linear+invadosomes.">Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway.">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li><li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts.">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. Exp. , e4119 (2012).</li><li>Diaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+detection+and+gelatin+degradation+assay.">Invadopodia detection and gelatin degradation assay.</a> Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).</li><li>Artym, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+fibrillar+collagen+is+a+potent+inducer+of+invadopodia+via+a+specific+signaling+network.">Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network.</a> J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane.">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li><li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+invasion+assays:+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay.">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li><li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance:+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases.">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li><li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li><li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia.">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Classicamente, os invadosomas são estudados in vitro , independentemente do microambiente e da matriz em que as células são banhadas. São atualmente utilizados vários tipos de matrizes, incluindo gelatina, fibronectina, vitronectina ou colágeno fibrilar de alta densidade (HDFC) 7 , 11 ; No entanto, muitas vezes não são representativas do microambiente em que as células residem e não são fisiologicamente relevantes. Aqui, foi utilizado um novo...

A remodelação da matriz extracelular (ECM) ocorre durante processos fisiológicos e patológicos, como angiogênese e invasão de células tumorais. Em condições fisiológicas, muitos tipos de células, principalmente da linhagem hematopoiética, são capazes de degradar elementos ECM. Por exemplo, os macrófagos são capazes de atravessar barreiras anatômicas para atingir os tecidos e osteoclastos degradam a matriz óssea para garantir a homeostase do cálcio. Mais globalmente, todas as matrizes do corpo se renovam para manter suas propriedades físicas e químicas. Nos tecidos do câncer, a composição do microambiente do tumor é alterada. Por exemplo, no câncer de mama e câncer de pulmão, o colágeno de tipo I é sobre-expressado e se acumula em torno do tumor. Além disso, essa acumulação está associada a um risco aumentado de desenvolver metástases 1 , 2 . A metástase do câncer depende da capacidade das células cancerosas para degradar o ECM e invadir os tecidos adjacentes. oA atividade invasiva das células é atribuída a estruturas especializadas em ricas em actinas conhecidas como invadosomes. Este termo inclui podossomas e invadopodia, que estão presentes, respectivamente, em células normais e cancerígenas ( por exemplo, macrófagos, células endoteliais e células cancerosas, como a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231). In vitro , os invadosomes podem se organizar em diferentes formas: pontos, agregados ou rosetas 3 . Classicamente, os invadosomes são compostos de um núcleo de F-actina contendo várias proteínas, como a proteína de andaimes Tks5 e cortactina, cercada por moléculas de placa de adesão, como integrinas e vinculina 4 . Recentemente, mostrou-se que a TK5 e a RhoGTPase Cdc42 podem ser usadas como uma assinatura molecular mínima para invadosomas funcionais 5 . Essas estruturas são capazes de degradar o ECM através do recrutamento e ativação de proteínas de metaloprotease específicas, como MT1-MMP e MMP-2 6. Em um estudo anterior, relatamos que a interação entre as fibrilas de colágeno tipo I e o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1), um receptor específico de fibrilas de colágeno tipo I, leva à formação de uma nova classe de invadossomas, denominados invadossomas lineares. Os invadosomas lineares são formados ao longo de fibrilas de colágeno tipo I 7 . Essas estruturas são capazes de degradar fibrilas de colágeno tipo I através do recrutamento e ativação de MT1-MMP / MMP2. Além disso, sua formação depende da Tks5 e Cdc42 5 . In vitro , demonstramos a existência de invadossomas lineares eo envolvimento de DDR1 na sua formação e atividade 8 usando diferentes estratégias consistindo em uma combinação de vários elementos da matriz, incluindo: i) lamínulas fluorescentes revestidas com gelatina, ii) fibrilação de colágeno tipo I fluorescente Lamelas revestidas e iii) tampas de colágeno 3D tipo I. Devido ao uso de diferentes matrizes, pudemos estudar e caracterizarFormação de invadosoma linear e sua atividade de degradação 7 , 8 . Finalmente, para compreender melhor a biologia das células invasivas, utilizou-se uma combinação de componentes de ECM nos sistemas de cultura 2D e 3D, imitando a complexidade da composição do microambiente do tumor. Abaixo estão protocolos para revestimento de lamínulas com colágeno de gelatina / tipo I em sistemas de cultura 2D e 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td>
			<td>Molecular probe life technologies</td>
			<td>G13186</td>
			<td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses</td>
			<td>Marlenfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>111520</td>
			<td>&#216;12mm No.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15960</td>
			<td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Use this PBS in all steps before fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-30122</td>
			<td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortactin 4F11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5180</td>
			<td>Invadosome markers Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DDR1 antibody</td>
			<td rowspan="2">Cell signaling</td>
			<td rowspan="2">5583</td>
			<td>Linear invadosome receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FT-AZ0330</td>
			<td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33258</td>
			<td>Nucleus marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G mounting medium</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP 483331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Public domain</td>
			<td></td>
			<td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353097</td>
			<td>8.0&#181;m pore size / 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

A adesão celular, a migração e a invasão estão envolvidas em muitos processos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, durante a formação de metástases, as células tumorais devem atravessar barreiras anatômicas para invadir e migrar através do tecido circundante, a fim de atingir o sangue ou vasos linfáticos. Isso requer a interação entre células e a matriz extracelular (ECM). No nível celular, muitas células, incluindo a maioria das células cancerosas, são capazes de formar invadosomes, que são estruturas baseadas em F-actina capazes de degradar ECM. Os invadosomos são estruturas de actina protrusivas que recrutam e ativam metaloproteinases de matriz (MMPs). A composição molecular, a densidade, a organização e a rigidez do ECM são cruciais na regulação da formação e ativação do invadosoma. In vitro , um ensaio de gelatina é o ensaio padrão usado para observar e quantificar a atividade de degradação do invadosoma. No entanto, a gelatina, que é o colágeno I desnaturado, não é uma matriz fisiológica eLement. Um novo ensaio utilizando fibrilas de colágeno de tipo I foi desenvolvido e utilizado para demonstrar que esta matriz fisiológica é um potente indutor de invadossomas. Os invadosomas que se formam ao longo das fibrilas de colágeno são conhecidos como invadosses lineares devido à sua organização linear nas fibras. Além disso, a análise molecular de invadossomas lineares mostrou que o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1) é o receptor envolvido em sua formação. Esses dados demonstram claramente a importância de usar uma matriz fisiologicamente relevante para entender as complexas interações entre células e ECM.

Usando uma combinação de dois tipos de matrizes, gelatina e colágeno tipo I ( Figuras 1 e 4 ), destacamos um novo tipo de invadosoma, conhecido como invadossomas lineares. A rotulagem dessas matrizes permite a observação da formação de invadosoma linear ao longo de fibras de colágeno I e de suas capacidades de degradação ( Figura 5 ). O número de estruturas invasivas pode então ser quantificado pela macro descrita anteriormen...

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K visualizações.  INSERM U1053.  Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer. 

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

Ensaio padronizado e escalável para estudar perfundido 3D Angiogênico Sprouting de células endotelias derivadas do iPSC in vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

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