Name: 2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity
Uploaded: 2017-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
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O JDM foi apoiado por uma bolsa de doutorado do INSERM / Région Aquitaine e agora é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do ARC e o Tisch Cancer Institute na Mount Sinai School of Medicine. A EH é apoiada por um doutorado do Ministério da Educação Superior e da Investigação. A ZE é apoiada por uma bolsa pós-doutoral da Agência Nacional de Pesquisa (ANR). O CM é apoiado pelo Instituto de Câncer Tisch na Faculdade de Medicina Mount Sinai e JJBC é apoiado pela concessão do NIH / NCI K22CA196750, o Fundo JJR do Prêmio Científico Científico da TCI e pelo Instituto Tisch Cancer na Escola de Medicina Mount Sinai. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS é apoiado pela &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;. VM e FS são suportados pelo financiamento da &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; e Institut National du Cancer, INCA_8036 e PLBio2012.

NOTA: Antes da fixação, todas as etapas são completadas em uma capa de fluxo laminar estéril. 1. matriz 2D NOTA: as matrizes 2D são usadas para determinar a porcentagem de células que formam invadosomes e a área de degradação da matriz por célula. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Figura 1: Protocolo. Resumo do protocolo utilizado para preparar matrizes de gelatina e colágeno I. É possível fazer apenas a matriz de gelatina ou uma matriz mista de gelatina e colágeno I. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Matriz de gelatina NOTA: As matrizes de gelatina fluorescente são usadas para quantificar a degradação da matriz e a gelatina não fluorescente é usada para promover a adesão das fibras de colágeno I. Tapete de gelatina fluorescenteOs arroz são também utilizados para estudos de podosomas e invadopodias (ver Figura 1 ). <ol><li> Sob um capuz de fluxo laminar estéril, coloque um parafino (20 cm x 15 cm) na área de trabalho e desinfecte-o com etanol a 70%. </li><li> Alíquotas 20 μL de gotículas de 1 mg / mL de gelatina em uma linha, espaçadas aproximadamente a 1 cm de distância; Consulte a Figura 1 para organização de gotículas. </li><li> Cubra cada 20 μL de gotícula de gelatina com um lamínula de vidro autoclavado (12 mm de diâmetro). </li><li> Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Se a gelatina estiver fluorescente, proteja-a da luz. </li><li> Alíquotas de 40 μL de gotículas de 0,5% de glutaraldeído em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da linha de lamínulas do passo 1.1.3. CUIDADO: O glutaraldeído é um agente fixador tóxico. Use luvas e não inspire. </li><li> Usando fórceps jewelled, transfira cada lamela revestida de gelatina para uma gota de glutaraldeído. AnoteÉ normal que uma pequena gota de gelatina permaneça no parafilme. Não reutilize isso para outro experimento. </li><li> Incubar durante 40 min à temperatura ambiente. Para lamínulas fluorescentes, proteja-os da luz. </li><li> Pegue uma placa de cultura de células de 24 poços e preencha cada poço com 500 μL de 1x PBS estéril. Coloque os lamínulas, com a gelatina voltada para cima, em cada poço. </li><li> Lave duas vezes em 1x PBS por 5 minutos cada. NOTA: Nesta etapa, os lamínulas podem ser usadas para experimentação ou armazenadas em 1x PBS a 4 ° C. Os lamínulas não fluorescentes podem ser armazenados por uma semana, e lâminas fluorescentes podem ser armazenadas por 48 h. </li></ol></li><li> Matriz de tipo I do colágeno fibrilante NOTA: A matriz de colágeno tipo I de fibrilação é utilizada para estudar a formação de invadosoma linear e a degradação da matriz associada. Uma combinação de colágeno fluorescente I e lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para colocar os marcadores invadossais com fibras de colágeno ( por exemplo, F-actina iN o canal distante, o colágeno I no canal vermelho, o Tks5 no canal verde e o tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Por outro lado, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para maximizar o número de marcadores de invadosoma corados ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, cortactina no canal vermelho, Tks5 em O canal verde e tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Finalmente, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina fluorescentes é usada para quantificar a degradação associada à gelatina ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, Tks5 no canal vermelho, no canal verde e tintura Hoechst Para uma mancha nuclear) (ver Figura 1). O tinte Hoechst é usado para manchar o núcleo, e também verifica a contaminação por micoplasma, além de um teste de PCR feito regularmente nas linhas celulares utilizadas. <ol><li> Colágeno fluorescente I <ol><li> Use colágeno comercial que extrai do tendão do rato-cauda em 0,02 N de ácido acéticoD. Retirar a quantidade de colágeno necessário para preparar 500 μL de solução por lamínula a uma concentração final de 0,4 mg / mL de colágeno I. </li><li> Adicionar éster succinimidílico de 5-carboxi x rodamina a uma concentração final de 10 μg / mL, calculado para o volume final da solução de colagénio I (nx 500 μL). </li><li> Misturar a solução pipetando para cima e para baixo e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Diluir para o volume final com 1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contendo cálcio e magnésio, e usar diretamente. </li></ol></li><li> Cobertura do colágeno Fibrilar I <ol><li> Use os lâminas de gelatina não fluorescentes ou fluorescentes previamente preparadas no passo 1.1. </li><li> Prepare uma solução de colágeno fluorescente ou não fluorescente I em uma concentração final de 0,4 mg / mL em DPB 1X contendo cálcio e magnésio. </li><li> Adicionar 500 μL de solução de colágeno I fluorescente ou não fluorescente porLamínula em uma placa de cultura celular de 24 poços. </li><li> Incubar durante 4 h a 37 ° C para a polimerização de colágeno I. </li><li> Após a incubação, remova o excesso de colágeno I inclinando a placa e pipetando no lado do poço (não diretamente na lamínula) para evitar danificar a matriz. NOTA: Esta matriz não pode ser armazenada. Semeie as células imediatamente após remover o excesso de colágeno I. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Semeadura de células, tempo de cultura e fixação <ol><li> Dependendo do tipo de célula, prepare as células no meio de cultura apropriado e adicione células para um volume final de 500 μL por poço. </li><li> Para caracterizar a capacidade de uma linha celular para formar invadossomas lineares e para degradar a matriz, prenda as células por 4 h, 12 h e 24 h na matriz de colágeno I para determinar a cinética da formação de invadosoma linear e a atividade de degradação associada. NOTA: A Tabela 1 contém exemplos de linhas celularesTestado em laboratório. <table border="1"><tbody><tr><td> Linha celular </td><td> Número de células por capa </td><td> Tempo de contato com a matriz para quantificação de invadosoma linear </td><td> Tempo de contato com a matriz para quantificação da atividade de degradação do invadosoma linear </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> HUH7 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> NIH 3T3, src </td><td> 30.000 </td><td> 4 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50,000 </td><td> 6 h </td><td> 24 h </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 24 h &amp;# 160; </td></tr><tr><td> CRU </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 h </td><td> 12 h </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Referência de semeadura celular e tempo de incubação. Esta tabela apresenta uma lista não exaustiva de linhas celulares usadas para estudar invadossomas lineares. Indica o número de células para semente na matriz, o tempo necessário para observar invadossomas lineares e o tempo necessário para observar a degradação da matriz associada. Os invadosomes lineares têm uma vida curta. Para poder observar invadossomas lineares no número máximo de células, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um curto período de tempo. Por outro lado, para poder visualizar a degradação de gelatina relatada, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um período de tempo maior que os listados acima. </li><li> Após a remoção do meio de cultura de células,Conserte os lamínulas durante 10 minutos em 500 μL de paraformaldeído a 4% em PBS 1X. </li><li> Lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Armazenar a 4 ° C, protegido da luz. </li></ol> 3. Imunofluorescência <ol><li> Permeabilize as células por 10 min com uma solução fresca. De Triton X-100 a 0,2% em 1x PBS. Não reutilize esta solução. </li><li> Lave os lamínulas duas vezes com 1x PBS. </li><li> Coloque um parafino (20 cm x 15 cm) no banco. </li><li> Diluir o anticorpo primário em 4% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS, conforme descrito na Tabela de Materiais . </li><li> Alíquotas de 50 μL de gotículas de solução de anticorpo primário em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente a 1 cm de distância. </li><li> Coloque cada lamínula sobre uma gota. </li><li> Incube durante 40 min à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Após o período de incubação, lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Diluir o anticorpo secundário, faloidina e tintura Hoechst em 4% BSA em 1xPBS. </li><li> Alíquotas de 50 μL de gotículas da mistura, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da primeira linha de lamínulas, conforme feito anteriormente. </li><li> Coloque cada lamínula sobre uma gota. </li><li> Incube durante 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz. </li><li> Após a incubação, lave duas vezes com 1x PBS. </li><li> Lave uma vez com água destilada para remover os sais. </li><li> Monte os lamínulas em uma lâmina de vidro com meio de montagem de polimerização. </li><li> Deixe os cobertores secar durante a noite à temperatura ambiente, protegidos da luz, antes da microscopia. </li></ol> 4. Quantificações <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação do invadosoma linear. A macro requer imagens confocadas de F-actina e coloração Tks5 (formato: 1.024 x 1.024). ( A ) Primeiro, abra a imagem F-actina e faça uma máscara. ( B ) Então, abraA imagem Tks5 e limita-a. Aplique a macro. ( C ) Os resultados analisados ​​aparecerão em duas tabelas. O número de invadosomes lineares por célula e outras informações, como a área de porcentagem usada por invadoss linux na célula, estará na tabela Resumo. O tamanho de cada invadosoma linear será na tabela de resultados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Porcentagem de células que formam invadossomas lineares <ol><li> Contar as células que formam invadossomas lineares, aproximadamente 100 células por lamelas (use triplicados técnicos). Quantifique pelo menos 300 células por n, com n = 3. </li><li> Calcule a porcentagem de células que formam invadossomas lineares, tomando a média de três experiências independentes, resultando em 900 células quantificadas. </li></ol></li><li> Tamanho e número de invadosome linear de células <li> Use ImageJ com a macro suplementar. </li></ol></li><li> Degradação por célula <ol><li> Use três lamínulas por condição. </li><li> Pegue 30 imagens por lamínula de gelatina fluorescente e núcleos manchados com Hoechst. </li><li> Use o software ImageJ como descrito em Martin KH et al. 9 . </li></ol></li></ol> 5. Ensaio de invasão de colágeno 3D <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> Figura 3: esquema de ensaio de invasão. Resumo do protocolo de ensaio de invasão. O colágeno I é reticulado com corante de éster succinimidílico e polimerizado durante 1 h a 37 ° C. As células são adicionadas em meio isento de soro em cima do plugue de colágeno I. A inserção é colocada em média wi10% FBS. Os tampões de colágeno I são fixados 1 h após a semeadura celular no controle e 3 dias após a semeadura celular na condição experimental para determinar a capacidade de invasão das células. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Preparação de plugue de colágeno e eu <ol><li> Faça um curso de tempo de 4 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h para o primeiro experimento para determinar a cinética de invasão no gel de acordo com o tipo de célula. Para cada experiência, adicione um ponto de tempo de 1 h como um ponto de tempo de referência quando não ocorre uma invasão. </li><li> Prepare a solução de colágeno I no gelo sob uma capa de fluxo laminar estéril. Prepare 500 μL de solução para 3 inserções de câmara Boyden. </li><li> Aspirar 1 mg de colágeno comercial de rato-cauda I para preparar uma solução com uma concentração final de 2 mg / mL de colágeno I. </li><li> Adicionar 5-carboxi x éster succinimidílico de Rhodamine aUma concentração final de 1 μg / mL, calculada para o volume final da solução de colágeno I (neste caso, 500 μL). </li><li> Misture bem e incube durante 5 minutos no gelo sob o capô de fluxo laminar estéril, protegido da luz. </li><li> Adicionar 50 μL de PBS 10X arrefecido com gelo e 6,25 μL de hidróxido de sódio 1 M gelado (NaOH). </li><li> Adicione água estéril de acordo com a fórmula 443.75 - x μL de colágeno I. </li><li> Adicione 100 μL de solução por inserção da câmara de Boyden. </li><li> Incubar durante 1 h a 37 ° C para permitir a polimerização. </li><li> Adicionar meio de cultura celular enriquecido com soro fetal bovino (FBS) em novos poços; Coloque inserções nesses poços. </li><li> Semeiam 30 mil células em cima do colágeno que eu conto em meio sem FBS. </li><li> Após a cultura das células a 37 ° C, coloque o tampão de colagénio I durante 30 minutos em paraformaldeído a 4% em 1x PBS. </li><li> Imunofluorescência completa como no passo 3, com exceção das seguintes etapas: permeabilidadeZe com 0,2% de Triton X-100 em 1x PBS durante 30 min, não 10 min; Incubar com soluções de anticorpos primários e secundários por 1,5 h cada, em vez de 40 min e 30 min, respectivamente. Mancha para F-actina ou núcleos para localizar as células. </li><li> Após imunofluorescência, use um bisturi para cortar a membrana da inserção e transferir cuidadosamente o plugue de colágeno I para um prato de fundo de vidro. Certifique-se de que a parte superior do plugue de colágeno I esteja em contato com o vidro. Mantenha a membrana de inserção ligada ao fundo do plugue de colágeno I para manter a integridade do plugue. NOTA: O plugue de colágeno I permanece intacto no prato de fundo de vidro. A profundidade entre o fundo de vidro eo plástico que circunda o fundo de vidro é equivalente à espessura do bujão. </li><li> Coloque um lamínula no plugue de colágeno I e monte com o meio de montagem de polimerização para evitar que o plugue seque. </li><li> Use um microscópio confocal invertido para projetar o plugue de colágeno I; O topo deO plugue está em contato com o fundo de vidro do prato. <ol><li> Adquira uma pilha z da parte superior para a parte inferior do plugue de colágeno I para visualizar a invasão celular. Determine a espessura da pilha z ao examinar quão profundamente as células invadem o campo de imagem. Execute aquisições com um objetivo de óleo 40X em um formato de 512 x 512 com um tamanho de passo z de 0,25 μm. NOTA: Para referência, a pilha média de células MDA-MB-231 3 dias após a semeadura é de 30 μm. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Classicamente, os invadosomas são estudados in vitro , independentemente do microambiente e da matriz em que as células são banhadas. São atualmente utilizados vários tipos de matrizes, incluindo gelatina, fibronectina, vitronectina ou colágeno fibrilar de alta densidade (HDFC) 7 , 11 ; No entanto, muitas vezes não são representativas do microambiente em que as células residem e não são fisiologicamente relevantes. Aqui, foi utilizado um novo...

A remodelação da matriz extracelular (ECM) ocorre durante processos fisiológicos e patológicos, como angiogênese e invasão de células tumorais. Em condições fisiológicas, muitos tipos de células, principalmente da linhagem hematopoiética, são capazes de degradar elementos ECM. Por exemplo, os macrófagos são capazes de atravessar barreiras anatômicas para atingir os tecidos e osteoclastos degradam a matriz óssea para garantir a homeostase do cálcio. Mais globalmente, todas as matrizes do corpo se renovam para manter suas propriedades físicas e químicas. Nos tecidos do câncer, a composição do microambiente do tumor é alterada. Por exemplo, no câncer de mama e câncer de pulmão, o colágeno de tipo I é sobre-expressado e se acumula em torno do tumor. Além disso, essa acumulação está associada a um risco aumentado de desenvolver metástases 1 , 2 . A metástase do câncer depende da capacidade das células cancerosas para degradar o ECM e invadir os tecidos adjacentes. oA atividade invasiva das células é atribuída a estruturas especializadas em ricas em actinas conhecidas como invadosomes. Este termo inclui podossomas e invadopodia, que estão presentes, respectivamente, em células normais e cancerígenas ( por exemplo, macrófagos, células endoteliais e células cancerosas, como a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231). In vitro , os invadosomes podem se organizar em diferentes formas: pontos, agregados ou rosetas 3 . Classicamente, os invadosomes são compostos de um núcleo de F-actina contendo várias proteínas, como a proteína de andaimes Tks5 e cortactina, cercada por moléculas de placa de adesão, como integrinas e vinculina 4 . Recentemente, mostrou-se que a TK5 e a RhoGTPase Cdc42 podem ser usadas como uma assinatura molecular mínima para invadosomas funcionais 5 . Essas estruturas são capazes de degradar o ECM através do recrutamento e ativação de proteínas de metaloprotease específicas, como MT1-MMP e MMP-2 6. Em um estudo anterior, relatamos que a interação entre as fibrilas de colágeno tipo I e o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1), um receptor específico de fibrilas de colágeno tipo I, leva à formação de uma nova classe de invadossomas, denominados invadossomas lineares. Os invadosomas lineares são formados ao longo de fibrilas de colágeno tipo I 7 . Essas estruturas são capazes de degradar fibrilas de colágeno tipo I através do recrutamento e ativação de MT1-MMP / MMP2. Além disso, sua formação depende da Tks5 e Cdc42 5 . In vitro , demonstramos a existência de invadossomas lineares eo envolvimento de DDR1 na sua formação e atividade 8 usando diferentes estratégias consistindo em uma combinação de vários elementos da matriz, incluindo: i) lamínulas fluorescentes revestidas com gelatina, ii) fibrilação de colágeno tipo I fluorescente Lamelas revestidas e iii) tampas de colágeno 3D tipo I. Devido ao uso de diferentes matrizes, pudemos estudar e caracterizarFormação de invadosoma linear e sua atividade de degradação 7 , 8 . Finalmente, para compreender melhor a biologia das células invasivas, utilizou-se uma combinação de componentes de ECM nos sistemas de cultura 2D e 3D, imitando a complexidade da composição do microambiente do tumor. Abaixo estão protocolos para revestimento de lamínulas com colágeno de gelatina / tipo I em sistemas de cultura 2D e 3D.

<table><tbody><tr><td>Gelatin solution</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td><td>Molecular probe life technologies</td><td>G13186</td><td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td></tr><tr><td>Microscope cover glasses</td><td>Marlenfeld GmbH &amp;amp; Co</td><td>111520</td><td>&amp;Oslash;12mm No.1</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td><td>Electron microscopy science</td><td>15960</td><td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td></tr><tr><td>1x PBS pH 7.4</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10010-015</td><td>Use this PBS in all steps before fixation</td></tr><tr><td>Collagen I Rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td><td>Life technologies</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x + calcium + magnesium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron microscopy science</td><td>15710</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS buffer pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td></tr><tr><td>Tks5 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td></tr><tr><td>Cortactin 4F11 antibody</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>Invadosome markers Dilution :1/100</td></tr><tr><td>DDR1 antibody</td><td>Cell signaling</td><td>5583</td><td>Linear invadosome receptor</td></tr><tr><td>Dilution :1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>Nucleus marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Secondary antibodies FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Fluoromount G mounting medium</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>Public domain</td><td></td><td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr><tr><td>Cell culture insert</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>8.0&amp;micro;m pore size / 24 wells</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

A adesão celular, a migração e a invasão estão envolvidas em muitos processos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, durante a formação de metástases, as células tumorais devem atravessar barreiras anatômicas para invadir e migrar através do tecido circundante, a fim de atingir o sangue ou vasos linfáticos. Isso requer a interação entre células e a matriz extracelular (ECM). No nível celular, muitas células, incluindo a maioria das células cancerosas, são capazes de formar invadosomes, que são estruturas baseadas em F-actina capazes de degradar ECM. Os invadosomos são estruturas de actina protrusivas que recrutam e ativam metaloproteinases de matriz (MMPs). A composição molecular, a densidade, a organização e a rigidez do ECM são cruciais na regulação da formação e ativação do invadosoma. In vitro , um ensaio de gelatina é o ensaio padrão usado para observar e quantificar a atividade de degradação do invadosoma. No entanto, a gelatina, que é o colágeno I desnaturado, não é uma matriz fisiológica eLement. Um novo ensaio utilizando fibrilas de colágeno de tipo I foi desenvolvido e utilizado para demonstrar que esta matriz fisiológica é um potente indutor de invadossomas. Os invadosomas que se formam ao longo das fibrilas de colágeno são conhecidos como invadosses lineares devido à sua organização linear nas fibras. Além disso, a análise molecular de invadossomas lineares mostrou que o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1) é o receptor envolvido em sua formação. Esses dados demonstram claramente a importância de usar uma matriz fisiologicamente relevante para entender as complexas interações entre células e ECM.

Usando uma combinação de dois tipos de matrizes, gelatina e colágeno tipo I ( Figuras 1 e 4 ), destacamos um novo tipo de invadosoma, conhecido como invadossomas lineares. A rotulagem dessas matrizes permite a observação da formação de invadosoma linear ao longo de fibras de colágeno I e de suas capacidades de degradação ( Figura 5 ). O número de estruturas invasivas pode então ser quantificado pela macro descrita anteriormen...

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K visualizações.  INSERM U1053.  Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer. 

Vídeo: 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Pesquisa do câncer

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Medicina

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Modelos 3D em Biologia do Câncer: Dinâmica de Invasão em Heterosferóides

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autor em destaque: decifrando a diafonia entre câncer e células imunológicas durante a progressão do câncer de cabeça e pescoço

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Bioengenharia

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Resumo

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Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Modelagem e imagem 3-Dimensional Invasion cela coletiva

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares