Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

마이그레이션 챔버의 1 준비 <ol><li> 혼합물까지 혼합하고 열이 녹아 : 파라핀 왁스 / 석유 젤리 (1 일)을 준비합니다. 페인트 브러시를 사용하고 파라핀 왁스 / 바셀린의 2-3 층 그릴 (1 : 1)도 1B-1D에 따라 유리 슬라이드의 중간에 섞는다. 참고 : 우리는 일반적으로 유리 슬라이드를 사용하는 (76 X 26 X 1.0 ~ 1.5 mm (W / D / H)) </li><li> 그리는 동안 응고를 방지하기 위해 유리 슬라이드에 급속히 용융 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스를 적용. 파라핀 왁스 / 바셀린 층은 길이가 약 2-2.5 cm, 폭 0.3 ~ 0.5 cm이다 확인. 파라핀 왁스 / 바셀린 층의 두께는 약 0.1-0.15 cm이어야한다. </li><li> 응고 된 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스에 커버 슬립을 추가하고 2-3 층 왁스 / 석유 젤리 믹스를 파라핀 (그림 1E, 1F)로 밀봉. 일반적인 세​​포의 이동 실험에 4-8 마이그레이션 챔버를 사용합니다. 장소 마이그레이션 챔버 전랙 위쪽 위치에 n. </li></ol> 콜라겐 서스펜션 셀 믹스의 2 준비 <ol><li> 수확 (예, 0.25 % 트립신 / EDTA)와 관심의 세포를 계산합니다. 완전한 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 미디어, 항생제의 세포를 재현 탁하고 보충제를 추천했다. 4-8 1.5 ml의 반응 관 4-6 × 104 세포 (세포의 총 수가 분석 될 세포 유형에 따라)를 함유하는 20 ㎕의 세포 현탁액을 준비하고 완전한 미디어 50 μL까지 채운다. NOTE : 추가의 화합물 (예, 성장 인자, 케모카인, 억제제 등)를 세포 현탁액에 첨가된다. 세포 현탁액의 최종 부피가 50 μl를 초과하지 않도록 적절한 스톡 용액을 사용한다. </li><li> 네 세포 이동의 실험을 위해 452 ㎕의 최종 콜라겐 현탁액의 총량을 준비합니다. 50 ㎕의 10 배 MEM (pH가 5.1-5.5) 및 7.5 % 탄산 수​​소 나트륨 용액 27 μL (pH가 9.0-9.5 추가) 1.5 ml의 반응 관과 완전히 혼합한다. 강렬한 보라색 (pH가 9.0-9.5)에 노란색 - 오렌지에서 솔루션 컬러 턴을 준수하십시오. 10 배 MEM / 탄산 수​​소 나트륨 용액에 375 ㎕의 액체 콜라겐 현탁액을 첨가하고 잘 섞는다. 최종 콜라겐 현탁액의 pH가 약 7.5이어야한다 (자주색 색상으로 표시). 주 : 7.5 % 중탄산 나트륨 용액의 pH를 확인한다. pH가 약 7.5 장소 인큐베이터에서 오픈 뚜껑 중탄산 나트륨 용액 인 경우 (37 ° C, 5 % CO 2) CO 2로 포화 및 산도 (약 9.0-9.5)으로 증가한다. 콜라겐 현탁 세포 믹스의 pH는 콜라겐 네트워크의 안정성을 위해 중요하다. 너무 낮 으면 콜라겐 격자는 세포 이동 실험 동안에 붕괴한다. 참고 :이 프로토콜의 경우, 소 뒷다리에서 액체 콜라겐 (pH가 1.9-2.2)를 사용 (2.9-3.3 ㎎ / ㎖ 콜라겐을, 95 % 콜라겐 타입 I, 5 %의 콜라겐 유형 IV). 추가하여 콜라겐 격자 제제 프로토콜의 예로이러한 돼지 나 쥐와 같은 다른 소스로부터 콜라겐 유형 I은 (32, 33)에 제시되어있다. 이 1.67 밀리그램 / 격자의 ML의 궁극적 인 콜라겐 농도를 변경하므로 사용 된 솔루션의 볼륨을 변경하지 마십시오. 더 높거나 낮은 콜라겐 농도 콜라겐 섬유의 밀도 및 세포 이동성 동작 34 병용 그들 사이의 평균 거리에 영향을 미친다. </li><li> 50 ㎕의 세포 현탁액의 최종 콜라겐 현탁액 100 μl를 추가하고 thoroughly.The 최종 콜라겐 서스펜션 (1.67 ㎎ / ㎖ 콜라겐)을 혼합하면 약간 점성이다. 정확한 양 (100 μL)를 전송하려면, 세포 현탁액에 전송하기 전에 한번 상하 최종 콜라겐 용액을 피펫. NOTE : 콜라겐 현탁 세포 믹스 pH 값을 7.5로 변경했다 배 MEM / 중탄산 나트륨 용액과 결합되면 콜라겐 섬유가 바로 중합 시작. </li><li> 일의 최종 콜라겐 서스펜션 세포 믹스로 이동마이그레이션 챔버에 전자 반응 튜브. 부드럽게 동일하게 마이그레이션 챔버 (그림 1H)의 하단에있는 콜라겐 서스펜션 세포 믹스를 배포 마이그레이션 실을 누릅니다. 랙에 수직으로 마이그레이션 챔버를 놓고 30 분 동안 품어 (37 ° C, 5 % CO 2) 콜라겐 섬유의 중합을 허용합니다. </li><li> 중합 된 콜라겐 격자 약간 혼탁하지만 여전히 밝은 자주색 색상되고 있음을 알 수 있습니다. 관심 보충제 완전 배지 또는 전체 매체와 마이그레이션 챔버를 입력하고 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스 (그림 1I, 1J)와 마이그레이션 챔버를 밀봉하십시오. </li></ol> 3 녹화 및 세포 이동의 분석 이 섹션에서는 수동 셀 추적하여 시간 경과 비디오 현미경과 세포 이동의 분석에 의해 세포 이동의 기록에 대해 설명합니다. <ol><li> 현미경 및 현미경 스테이지 난방에 전환터. 37 ° C까지 온도를 조정합니다. 10X 목표를 사용합니다. 현미경 이주 챔버를 배치하고 시야에 약 50 개 이상의 세포를 집중한다. </li><li> 멀티 카메라 비디오 감시 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 저속 모드에서 기록 세포 이동. 예를 들어, 적절한 형식으로 세포의 이동 영화를 저장, &quot;* .AVI&quot;또는 &quot;*의 .MOV&quot;. 이러한 세포 유형과 실험 조건으로서, 지원 정보가 데이터베이스에 포함 된 세포 이동 무비 파일을 링크. 참고 : 우리는 시간 경과에 0.75 초 실시간으로 1 분 같다는 것을 의미 1:80의 시간 경과 계수를 사용하여 최대 2 시간 동안 림프구와 HSPCs를 기록하고 있습니다. 종양 세포는 느리게 이동하는 세포이며, 따라서 하나의 시간 경과 계수를 이용하여, 적어도 16 시간 동안 기록된다 : 1,800 (시간 경과에 0.5 초 실시간으로 15 분 동일하다). </li><li> ImageJ에 소프트웨어 플러그인과 같은 적절한 세포 추적 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 세포의 이동 영화를 분석(개요 18에 제시되어있다). 편견 분석을 위해이 세포가 활성화 여부 철새인지 세포가 무작위로 지식없이 선택 될 것입니다 매우 중요하다. 참고 : 수동 (핵에 위치한다) 마우스 커서 정확하게 세포 이동에 따라 실험 당 적어도 30 세포의 경로를 추적하는 자체 개발하는 소프트웨어 애플리케이션을 사용하고있다. 추적하는 동안, 추적 셀 XY 좌표가 자동 중고 저속 모드에 따라 결정된다. 종양 세포에 대한 XY 좌표가 (15 분 실시간 같음) 각 0.5 초를 결정하는 반면 림프구 / HSPCs의 XY 좌표는, (1 분 실시간 같음) 각각 825 초 결정된다. </li><li> 일반적인 세​​포의 이동 실험을 위해 세포 당 60 XY 좌표의 총을 결정합니다. 이는 종양 세포 림프구 / HSPCs 15 시간 실시간으로 1 시간 실시간으로 동일하다. A &quot;는&quot;셀 TW 사이에서 이동되지 않았 음을 나타냅니다오 시점, &quot;수치&quot;반면 &quot;픽셀&quot;셀이이 시점 (그림 2A) 사이에 이동 한의 거리를 나타냅니다. 참고 : 수동 셀 추적 경험이 필요합니다. 특히 빠른 마이그레이션 세포 추적하기 어렵고 각 세포 유형 전시 보충 요인에 의해 유발 될 수있는 별개의 이동성 동작. 추적하는 동안 세포 분열 가지 경우에서 무작위로 추적을 계속하는 한 딸 셀을 선택합니다. 시력 필드에서 마이그레이션하거나 추적을 소홀히하지 않는 상태에서 사망하지만, 분석을 위해 고려 세포. </li></ol> (4) 데이터 분석 <ol><li> 예를 들어, 적절한 소프트웨어 어플리케이션, 스프레드 시트 프로그램을 이용하여 세포의 추적 데이터를 분석한다. <ol><li> 자기 설계 스프레드 템플릿으로 원시 데이터 (도 2a)을 트래킹 셀을 복사하여 셀 트래킹 데이터를 분석한다. 대표, &quot;수치&quot;의 합을 곱총 거리는 셀은 &quot;μM&quot;로 &quot;픽셀&quot;을 변환하는 보정 계수 이주로했다. </li><li> 이 세포 이동의 매개 변수를 결정하고 활동적인 운동 (그림 2C, 2D)의 시간 (이동 속도에 해당) locomotory 활동. </li><li> 비 세포와 같은 이동 (거짓 양성 세포의 수를 줄이기 위해 임계 레벨)보다 낮은 25 μm의 마이그레이션 한 셀을 식별한다. &quot;,&quot;이러한 세포의 &quot;수치&quot;를 교체합니다. 참고 : 매개 변수 &quot;locomotory 활동&quot;(또는 이동 속도가)이 시점 (그림 2D) 사이에서 이동 한 추적 세포 인구의 세포의 비율을 나타냅니다. A &quot;의 수치는&quot; &quot;,&quot;반면, 이동 셀로서 정의되어 움직이지 않는 세포로 정의된다. 파라미터 &quot;활성 이동 시간&quot;(활성화 시간)은 셀 재에 마이그레이션 총 시간의 비율을 나타내고관찰 기간 (도 2c)의 시간 프레임에 만큼은. &quot;수치&quot; &quot;,&quot;세포가 이동되지 않았 음을 나타냅니다 반면 셀, 이동 한 것을 나타냅니다. 이 매개 변수는 더 이상 이동하지 않은 세포의 수를 결정하기 위해 사용된다. </li></ol></li><li> 통계적 유의성 및 디스플레이 세포의 이동 데이터를 계산합니다. <ol><li> 맨 - 휘트니 U 시험을 사용하여 세포 (이동 속도)의 평균 locomotory 활성의 유의 한 차이를 계산한다. P-값 &lt;상당한 0.05를 생각해 보자. </li><li> XY-다이어그램, 상자 그림 다이어그램, 또는 막대 차트 다이어그램만큼 셀들의 평균 locomotory 활성을 보여준다. 막대 차트 다이어그램으로 또는 히스토그램과 같은 활성 이동이나 속도의 시간과 같은 단일 셀 기반의 데이터를, 표시합니다. 참고 : 선택한 스프레드 시트 소프트웨어 응용 프로그램이 상자 그림 차트 또는 히스토그램 차트 도구가 포함되지 않은 경우 온라인 검색은 적합 TU를 찾고 수행해야torials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

마이그레이션 할 수있는 능력은 종양 세포 4의 특징이다. 기본 종양에서 분리하고 거의 모든 암 환자의 사망의 주요 원인이되는 보조 병변을 배정 할 수 없습니다 주위의 결합 조직 종양 세포를 통해 마이그레이션 할 수있는 기능없이. 이 때문에 관계의 많은 연구는 암 세포의 이동에 초점을 맞추고있다. 이 연구의 목적은 효율적으로함으로써 손상 또는 전이 형성을 늦추고, 종양 세포의 ?...

세포 융합 (개요는 1, 2 참조) 세포의 이동이 배아 발달, 상처 치유 및 면역 반응 (검토를 위해 3 참조)을 포함하여 생리 학적 과정의 과다에 참여하는 다른 생물학적 현상처럼. 그러나, 마이그레이션 할 수있는 기능은 종양 세포가 (검토를 위해 3,4 참조) 전이하기위한 전제 조건이기도하다. 세포 이동은, 복잡하고 다양한 리간드 (예, 사이토 카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 세포 외 매트릭스 성분) 수용체 (예를 들면, 수용체 티로신 키나제에 의해 개시 여러 신호 전달 경로의 작용에 의해 지시된다 아직 완전히 이해 과정 궁극적 있도록 지연 및 초점 접착 단지의 재 조립과 함께 액틴 세포 골격의 수반의 재구성을 일으키는 케모카인 수용체, 인테그린)의 상호 작용 5 6 신호 인테그린은 매개. 시험 관내 여러 생체 세포 이동 분석에서 세포의 이동을 분석하는 분석 실험 8-10, 입체감을 (치유 보이든 챔버 / 트랜스 웰 어 세이 7, 내찰 분석 / 상처를 포함한 과거 수십 년 동안 개발되어왔다 3D) 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석 (11)뿐만 아니라의 intravital 영상 / 현미경 (검토를 위해 12 참조). 이러한 세포 이동 분석 각각의 장점과 단점, 예를 들어, 관련된 비용 및 장비의 필요성, 취급 또는 획득 한 데이터의 신뢰성을 가지고 있습니다. 보이든 챔버 / 트랜스 웰의 분석 및 스크래치 분석 / 상처 치유 분석 모두 체외 7-10에서 세포의 이동을 측정하기 쉽고, 저렴한 비용과 잘 발달 된 분석이다. 소위 상부 구획 7 - 보이든 챔버에서 / 트랜스 웰 분석 세포를 삽입 함유 기공 (약 8 μm의 직경)의 상단에 씨앗을 품고있다. 선택, 삽입은 세포 외 m로 코팅 될 수있다ATRIX 성분, 예를 들면, 피브로넥틴, 콜라겐 등이 더 생리적 환경을 모방한다. 마찬가지로, 내피 세포함으로써 내피 세포 장벽 (13)을 흉내 낸, 삽입물의 상단에 성장 될 수있다. 이러한 성장 인자 및 케모카인과 같은 미디어 보충제, 은닉 하부 구획으로 정의 된 시간 간격 동안 기공 통과 한 이들 세포는, 세포 이동 (또는 혈관 외 유출)을 정량화 판독로서 사용된다. 스크래치 분석에 / 상처 치유 분석 세포를 플레이트에 접종하고 배양이 10로 성장하고 있습니다. 실험 설정 판의 의존도에서 피브로넥틴 등의 세포 외 기질 구성 요소와 사전에 코팅 될 수있다. 스크래치의 각 측면에서 세포 단층 단일 세포를 긁어 상처 스크래치 / 생성 한 후 / 상처 이에 의해 10 치유 / 충전 격차로 마이그레이션 할 수 있습니다. 스크래치 / 상처의 양면 사이의 거리가 결정된다시간 의존성과 셀 (10)의 활동에 대한 이동성 판독로서 사용된다. 그러나, 시간이 경과 비디오 현미경 및 단일 셀 (10)를 추적과 분석을 결합하는 것이 좋습니다 및 세포 이동 (또한 스크래치 / 상처의 충전 / 치유 될 수있는) 세포의 증식을 구별합니다. 그러나, 보이든 챔버 / 트랜스 웰 분석 및 분석 치유 스크래치 분석 / 상처 모두, 생리 같은 셀룰러 환경에 관하여 다소 불완전하다. 보이든 챔버 / 트랜스 웰 어 세이 세포 어 세이에 스크래치 세포를 치유 분석 / 상처 이차원 프레 코트 플라스틱 접시에 시딩 반면, 플라스틱 기공을 통해 이전한다. 마찬가지로, 잘 이동성 동작은 2 차원 환경에서 3D (3) 사이에 현저하게 다르다는 것을 인식한다. 예를 들어, 섬유 아세포의 입체 매트릭스 유착이 특징에 초점 및 섬유 성 유착 다를αvβ3 인테그린 α5β1과, paxillin, 다른 세포 골격 성분, 국소 유착 키나제 (14)의 티로신 인산화의 콘텐츠 - 차원에서의 기판. 마찬가지로, 3 차원 환경 내에 포함 된 세포는 또한 변경된 이동성 동작 (15)을 표시. 따라서보다 정확하게 세포의 이동을 분석하기 위해 마이그레이션 분석은 3D 생리 학적 또는 생리 학적 같은 환경 내에서 단일 세포의 이동을 측정 할 수 있도록 권장한다. 의 intravital 영상 / 현미경 3D 생리 학적 맥락에서 세포의 이동을 측정하기위한 황금 표준입니다. 이것은 지금까지 인해 가능하다, 그러나 또한 림프절 17 내의 혈관 외 유출 16 또는 림프구 거래 동안 종양 세포 및 내피 세포와 같은 다른 세포 유형 간의 상호 작용, 세포 외 기질 세포의 상호 작용에 속하지 않는 예컨대 2 광자 같은 향상된 형광 현미경 기법공 초점 레이저 주사 현미경, 형광 ​​단백질을 발현 유도체 12,16,17 중요한 형광 염료 및 형질 전환 마우스의 변종의 사용. 또한,의 intravital 영상 / 현미경은 수동 및 자동 셀 (18) 추적과 결합 될 수있다. 그러나, 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경의 필요성뿐만 아니라 동물 (적절한 형질 전환 동물 모델)의 촬상의 intravital / 현미경 오히려 비용 집약적 기술이다. 보이든 챔버 / 트랜스 웰 분석 및 내찰 분석 / 상처 치유 분석의 한계를 극복하고 3D 콜라겐 매트릭스 이주 분석법 11,19 개발 된 3 차원 환경 내에서 다른 세포 유형의 마이그레이션을 분석하기. 이에 따라, 이주 세포 3D 콜라겐 섬유 네트워크, 생체에 더 비슷해이 상황에 포함된다. 공동으로, 시간 경과 비디오 현미경 실제 세포의 이동에 의한는 determi 수 있도록 측정여러 마이그레이션 매개 변수뿐만 아니라 프로 철새 요인 또는 억제제에 대한 응답에서의 변화의 나라. 다양한 세포 유형의 림프구 및 백혈구 11,20, 조혈 모 / 21-24 전구 세포 및 종양 세포를 포함 5,25-29이 기술을 사용하여 분석 할 수있다. 단셀 외에도 클러스터 셀 또는 타원체는 30,31 격자 콜라겐으로 셀 클러스터 / 타원체부터 단일 세포의 이주의 분석 콜라겐 매트릭스 수반 내에 내장 될 수있다. 생체 내 상황에 가까운 결과에 항복 시험 관내 방법 -이 프로토콜은 3 차원 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 동작을 분석 할 수있는 간단하지만 강력한 방법에 대한 개요를 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Leica DM IL inverted microscope</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope stage heater</td><td>Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JVC C1431 video camera</td><td>JVC, Bad Vilbel, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axis 241Q video server</td><td>Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mac G5 Computer</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FileMaker Pro</td><td>FileMaker GmbH, Unterschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td><td>Bensoftware, London, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runtime Revolution Media 2.9.0</td><td>RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>A4264</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>local drug store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol (liquid collagen)</td><td>Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td><td></td><td>contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate solution</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>U73122</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>662035</td><td>dissolve first in CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;; reconstitute in DMSO just prior to use</td></tr></tbody></table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

이주 할 수있는 능력은 다양한 세포 유형의 특징이며 배아 발생, 상처 치유, 및 면역 반응을 포함한 여러 생리 과정에서 중요한 역할을한다. 그러나, 세포 이동은 또한 확산 전이성을 시작하는 일차 종양으로부터 분리하는이 암세포를 활성화 암에서 중요한 메커니즘이다. 과거 내의 다양한 세포 이동 분석법은 다른 세포 유형의 이동성 동작을 분석하기 위해 개발되어왔다. 세포 locomotory 문제가 현저하게 이차원 (2D) 사이의 차이 및 3 차원 (3D) 환경 그것은 3D 환경 내에 포함 된 세포의 이동의 분석은 더 중요한 세포 이동을 수율 것이라고 가정 할 수 있으므로 데이터. 기재된 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석의 장점은 세포 외 매트릭스의 주요 구성 요소를 나타내는 콜라겐 섬유의 생리적 3D 네트워크 내에 내장된다는 점이다. 으로 인해시간 경과 비디오 현미경 리얼 셀 마이그레이션 프로 이동성 인자 또는 저해제에 응답하여 여러 이주 파라미터뿐만 아니라 변형의 결정을 허용 측정된다. 다양한 세포 유형의 세포 및 종양 세포를 림프구 / 백혈구를 포함한,이 기술을 이용하여 줄기를 분석 할 수있다. 마찬가지로, 또한, 셀의 클러스터 또는 타원체가 콜라겐으로 격자 셀 클러스터 / 타원체부터 단일 세포의 이주의 분석 콜라겐 매트릭스 수반 내에 내장 될 수있다. 우리는 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 생리와 같은 3D 환경에서 세포의 이동을 분석 할 수있는 다양한 방법이라고 결론 지었다.

시간 경과 비디오 - 현미경 및 컴퓨터 보조 셀 추적과 함께 사용되는 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 모두 인구 기반 파라미터 (예 locomotory 활성을 의미한다)을 포함하는 다양한 세포 이동 파라미터 및 단일 셀 기반 파라미터들의 결정을 허용 (예를 들어, 활성 이동, 속도, 거리의 시간은 마이그레이션). 얻어진 세포 트래킹 데이터 세트, 데이터 처리 및 데이터 프리젠 테이션?...

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.6K 조회수.  Witten/Herdecke University.  세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다. 

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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

연구

생체공학

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

의학

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...