Este trabalho foi apoiado por bolsas de investigação G0400268 e MR / K018396 / 1 do Conselho de Pesquisa Médica, e pela Acção Medical Research. Um apoio adicional foi fornecido pelo Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde da Universidade College London Hospitals Biomedical Research Centre.

Todos os experimentos com animais realizados neste estudo conformados com a legislação nacional e europeia e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia da UCL e do Reino Unido Home Office (HO). Todo o trabalho animal foi conduzido sob projeto HO licencia PPL 80/2243 e 70/7773 PPL. 1. Rat Preparação <ol><li> Realizar todos os experimentos in vivo utilizando ratos Wistar neonatais isentos de agentes patogénicos. </li><li> Guarde todas as ninhadas de ratos neonatos (12 por colônia) em gaiolas individuais com as mães que amamentam (9 - 11 semanas de idade) do sexo feminino, sob condições ideais (19-21 ° C, 45-55% de umidade, 15-20 trocas de ar / hora e 12 h ciclo claro / escuro). </li></ol> 2. Preparação celular bacteriana <ol><li> Loja E. existências coli K1 em 20% (v / v) de glicerol a -80 ° C. Para cada experiência, as bactérias placa pasta sobre Mueller-Hinton (MH) placas de agar, e incubar a 37 ° CO / N. </li><li> O dia antes da alimentação, inocufinal 10 ml de caldo MH, com um único E. coli K1 colónia e cultura O / N a 37 ° C, 200 rpm. Como um controlo para a contaminação forma, preparar 10 ml de caldo MH não inoculado e incubar a 37 ° C a 200 rpm. </li><li> Transferir 100 uL de suspensão bacteriana S / N em 9,9 ml de caldo MH (1: 100 v / v), e incubar a 37 ° C, 200 rpm, até o meio-exponencial de fase é atingida, o que corresponde a uma densidade óptica de 0,6 medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600). </li></ol> 3. A alimentação de ratos recém-nascidos com E. coli K1 <ol><li> Suavemente segurar o animal verticalmente em um lado da nuca do pescoço, permitindo que a boca se abra. Lentamente inserir a ponta de pipeta estéril para dentro da boca do animal, e pipeta de 20 uL do inoculo (~ 37 ° C) para dentro da boca do animal ao longo de um período de tempo de 30 seg. Retorne o animal para sua mãe imediatamente após a alimentação. </li><li> Verificar se 4-8 x 10 6 bactérias foram alimentados to cada filhote por diluição em série do inóculo em PBS e manchas em ágar MH. </li></ol> 4. Avaliação de colonização por E. coli K1 <ol><li> Suavemente segurar o animal em um lado da nuca do pescoço. Umedeça um cotonete estéril em PBS estéril, e, em seguida, esfregue suavemente a área perianal. Retorne o animal para sua mãe imediatamente após o esfregaço. </li><li> Colocar a ponta de mecha para um tubo contendo 300 ul de PBS estéril e armazenar em gelo. </li><li> Determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey. </li><li> Determine viável E. coli K1 por testes de susceptibilidade bacteriófago. Escolha uma colónia individual usando um loop microbiológica estéril, mergulhado em 200 mL de PBS estéril, então sujeitas a agitação no vórtex. </li><li> Usando um loop microbiológica estéril, sub-cultura em ágar MH em uma linha reta. Permitir que a placa secar durante 30 segundos, e, em seguida, pipeta 10 ul de bacK1E teriophage (10 9 unidades formadoras de placas / ml (PFU / ml)) para o centro da linha. Incubar a placa de O / N a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, examinar a placa para a lise mediada por bacteriófago. </li></ol> 5. Avaliação da Gravidade da doença <ol><li> Avaliar a gravidade da doença de cada animal 4 - 5 vezes por dia utilizando o sistema de pontuação de sete pontos descrito na Tabela 1. </li><li> Se uma pontuação animais ≥3 de 7, abater o animal imediatamente para minimizar o sofrimento. Grave o animal morto. </li></ol> 6. eutanásia de ratos recém-nascidos e coleta de sangue <ol><li> Suavemente segurar o animal em um lado, expondo a cabeça e pescoço. Desinfetar o pescoço do animal, limpando com uma compressa com álcool. Desinfetar um grande par de tesouras, usando etanol 70%, antes de enxaguar em PBS estéril para remover o etanol traço. </li><li> Gentilmente segurar o animal diretamente acima de uma placa de Petri. Decapitar o recém-nascido utilizando Surgi afiadatesoura cal, garantindo que o sangue escorre na placa de Petri. Evitar o contacto com a cabeça para evitar a contaminação do sangue com flora da pele. </li><li> Imediatamente recolher o sangue utilizando uma pipeta estéril e misturar com o sal de sódio de heparina a uma concentração de 20-50 unidades / ml num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. </li><li> Determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey. Determinar os números de viável E. coli K1, testando a susceptibilidade das bactérias viáveis ​​para K1E bacteriófago. </li></ol> 7. Dissecção <ol><li> Após a decapitação do rato neonatal, utilize condições assépticas para extirpar e coletar tecidos de interesse. Lave todos os instrumentos (mostrados na Figura 1) em etanol a 70% e PBS estéril. </li><li> Limpe o tabuleiro de dissecação e molhar as abdômen completamente com etanol 70%. Posicione o cadáver em suas costas e fixar a placa dissecção por (i) fixar a perna esquerda paraa mesa de operação com uma agulha estéril, (ii) que se estende do cadáver e fixando a pata dianteira direita para a mesa de operação, (iii) fixar a perna traseira direita e pata dianteira esquerda para a mesa de operação. </li><li> Retire a pele ao longo do lado esquerdo da parte inferior do abdome, usando uma pinça, em seguida, corte ao longo do lado esquerdo do cadáver do abdômen inferior ao esterno utilizando pequenas tesouras de dissecação. </li><li> Estender a excisão em todo o esterno, e depois para baixo do lado direito do corpo do esterno para o abdome inferior, utilizando uma pinça e uma tesoura pequena de dissecação, garantindo que nenhuma das estruturas subjacentes estão danificados. </li><li> Finalmente, puxe para baixo a aba de pele do esterno para parte inferior do abdome utilizando íris fórceps de dissecação curvas para expor o peritônio. </li><li> Suavemente elevar o peritoneu com uma pinça e cortado verticalmente para expor os órgãos internos, assegurando que nenhum dos órgãos subjacentes sejam danificados. </li></ol> 8. Coletao trato GI <ol><li> Identificar o estômago, intestino delgado, ceco, cólon e do sistema linfático mesentérico. </li><li> Retire o estômago delicadamente transecting em ambos os lados, em seguida, coloque em um bijou contendo 1,6 ml de PBS estéril usando uma pinça estéril. </li><li> Transecto do cólon no reto. Com cuidado, puxe toda a massa intestinal do cadáver usando uma pinça de dissecação e coloque em uma placa de Petri estéril. Certifique-se de que isso seja feito com cuidado para que a estrutura intestinal e estruturas linfáticas mesentérica não se separam. </li></ol> 9. Separação do trato GI e do sistema linfático mesentérica (Figura 2) <ol><li> Verter 30 ml de PBS estéril para a placa de Petri, assegurar o tracto GI está completamente submerso. </li><li> Identificar a massa central do sistema linfático mesentérica, e beliscar usando uma pinça de dissecação multa. Identifique a parte mais proximal do intestino delgado, e beliscar usando uma pinça de dissecação multa. </li><li> Puxe lentamente o Central massa do sistema linfático mesentérico e do intestino delgado distal em sentidos opostos até que os dois tecidos são completamente separadas umas das outras. Realizar esse processo com cuidado para garantir que o intestino delgado não estão esticados, pois isso impede a recolha de reprodutível proximal, médio e distal. Coloque o sistema linfático mesentérica em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 10. Seccionamento do trato GI <ol><li> Transect do tracto GI no ceco para separar o intestino delgado a partir do cólon. </li><li> Inserir o cólon em 300-500 ul de PBS estéril e colocar em gelo. </li><li> Recolha de tecidos representativas de regiões proximais, médio e distal do intestino delgado. Alinhe o intestino delgado a partir do ponto médio. </li><li> Então, (i) recolher os últimos 2 cm do tecido antes do ceco como o intestino delgado distal, (ii) recolher o tecido 5-7 cm acima do ponto médio como o intestino delgado proximal, e(Iii) recolher o tecido 3-5 cm abaixo do ponto médio do intestino delgado como do meio. </li></ol> 11. Coleta do Fígado <ol><li> Identificar os três lóbulos do fígado de rato após a remoção do estômago. </li><li> Puxe lobos longe da cavidade abdominal com a pinça de dissecação multa. </li><li> Retire o fígado, cortando qualquer ligamentos inerentes usando uma tesoura fina. Coloque fígado em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 12. Coleta o Baço <ol><li> Identificar o baço. </li><li> Puxar baço de distância a partir do estômago e utilize uma tesoura para cortar finas do ligamento gastroesplênico. </li><li> Coloque baço em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 13. Recolha os Rins <ol><li> Identificar os rins que se tornarão visíveis na parte de trás da cavidade abdominal após a remoção do tracto gastrointestinal e de outros órgãos. </li><li> Ureteres corte e quaisquer ligamentos associados ucantar tesouras de dissecação multa e retirar rins usando uma pinça fina. Remover glândulas supra-renais e qualquer material gorduroso (se ainda ligado), usando uma pinça fina e tesouras de dissecação. </li><li> Coloque os dois rins em 300-500 mL de PBS estéril e colocar no gelo. </li></ol> 14. Coleta o Cérebro <ol><li> Após a decapitação, manter a cabeça na posição vertical usando uma pinça curva. Aperte a pele em cima da cabeça longitudinalmente usando um outro conjunto de pinças curvas, e fazer uma incisão com uma tesoura de dissecção finas. Corte pele restante perto do pescoço, mais uma vez longitudinalmente com tesouras de dissecação multa. </li><li> Retire a pele em uma direção para fora usando uma pinça fina em ambos os lados para revelar o crânio e remover retalhos de pele usando tesouras de dissecação multa. Coloque tesouras de dissecação multa na abertura da coluna vertebral e fazer uma incisão ao longo do crânio em direção à tribuna. </li><li> Puxe as duas seções do crânio em uma direção para fora usando uma pinça fina. Corta para remover segmentos do crânio. </li><li&gt; Retirar cérebro usando uma pinça largos, usando um movimento para cima escavando a partir da abertura da coluna vertebral para a tribuna. Lavar o cérebro em PBS duas vezes para remover todo o sangue do procedimento de decapitação. </li></ol> 15. Processamento de Tecidos e homogeneização <ol><li> Para experiências que requerem a contagem de viabilidade ou de extração de DNA, tecidos lugar em tubos contendo PBS estéril. Imediatamente determinar o número de bactérias viáveis ​​por diluição em série em PBS e plaqueamento em placas de agar MacConkey, ou armazenar a -20 ° C com 20% de glicerol para a curto prazo. Para a extração de DNA, armazenar tecidos a -20 ° C. </li><li> Para as experiências que requerem a extracção de RNA, local tecidos em volumes apropriados da solução RNAlater (10 ul por cada 1 mg de tecido), em seguida, imediatamente armazenar a -20 ° C durante a curto prazo ou a -80 ° C armazenamento a longo prazo. </li><li> Para as experiências de imagiologia, os tecidos que requerem lugar em 10 ml Methacarn (60% de metanol, 30% de clorofórmio e de ácido acético a 10%), em seguida, armazenar umt RT (20 - 25 ° C) durante até 3 semanas. </li><li> Calcule o peso do tecido por comparação do peso dos tubos antes e depois da adição de tecidos. Homogeneizar tecidos utilizando um homogeneizador. Lavar o homogeneizador uma vez em etanol a 70% e duas vezes em PBS estéril entre a homogeneização de cada amostra. NOTA: Methacarn fixação é desejável para a fixação das amostras intestinais, a fim de preservar as estruturas de defesa da mucosa relacionada com mucina; fixação em formalina pode ser utilizado para tecidos sistémicos. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O modelo animal aqui descrito baseia-se em trabalho anterior que teve como objetivo reproduzir as principais características de infecções que ocorrem naturalmente no organismo humano. Ratos recém-nascidos foram inicialmente utilizados para estudar a meningite infantil por H. influenzae tipo b, como a espécie satisfeito os critérios-chave para um modelo robusto de infecção. Assim, o portal de entrada do agente patogénico deve reflectir a da infecção humana natural e de forma reprodutível dar origem a patologia semelhante a duração suficiente para permitir a intervenção terapêutica. As técnicas utilizadas não deve limitar a aplicabilidade do procedimento e não deve contribuir para a evolução da doença 20. O modelo de H. influenzae meningite em ratos infantis desenvolvidos por Moxon e seus colegas satisfaz estes critérios 20; a infecção natural ocorre após a colonização das membranas mucosas do tracto respiratório superior e esta característica importante foi replicado nas crias de rato por não-traumainstilação tic das bactérias sobre as membranas das passagens nasais. É importante ressaltar que a natureza dependente da idade da infecção foi replicada no modelo. O mesmo grupo também foram os primeiros a desenvolver um modelo não-invasivo de E. coli K1 NBM no rato neonatal 22. Isentos de agentes patogénicos filhotes Sprague-Dawley foram colonizados pela alimentação 10 agosto - 10 outubro bactérias através de um tubo gástrico oral; o inoculo era, portanto, consideravelmente maior do que a empregue por nós. Colonização com as três cepas K1 examinados, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) e LH (O75: K1: H3), ocorreu em uma proporção relativamente alta (48-74%) de animais K1-alimentados, mas a incidência de bacteremia, meningite e mortalidade foram variáveis ​​e significativamente menor do que as taxas de colonização. A natureza clonal da E. coli K1 infecção experimental foi estabelecido posteriormente 23 e é agora evidente que somente O18: K1 e, em menor grau, O7: K1 serotipos são capazespara causar consistentemente infecção sistémica. Por esta razão, estas investigações da patogênese da neuropatogénico E. coli K1 foram baseados na utilização do O18-enhanced virulência: K1 estirpe A192PP. Uma comparação dos E. coli K1 alimentação de ratos recém-nascidos por meio de uma sonda gástrica, usada por Glode e colegas 22, e um método de alimentação de gotículas como empregada pelo grupo de Achtman 23 reveladas número excessivo de mortes utilizando o método antigo, quase certamente devido aos danos a superfícies mucosas pelo tubo gástrico. Como as taxas de colonização são comparáveis ​​com estes dois métodos, recomenda-se usar o método menos invasivo de alimentar as bactérias usando uma pipeta esterilizada com uma ponta, tal como descrito na presente comunicação. E. coli A192PP utilizado em nossos estudos é O18: K1. É um derivado mais virulenta da estirpe de E. clínica coli A192 que foi originalmente recuperados a partir de um paciente com septicemia 27 </sup&gt;. O aumento da virulência da cepa foi obtida pela passagem de série através de ratos recém-nascidos 26. A tensão provoca uma severidade da doença idade-dependente, com 100% de bacteremia e mortalidade quando administrado a dois dias de idade os animais 28. Em contraste, 9 dias de idade os animais são completamente resistentes à doença. -K1 específica de bacteriófago lítico pode ser utilizado para diferenciar E. coli K1 de E. outra coli 29. Neste estudo, a sensibilidade das bactérias viáveis ​​para K1E bacteriófago deve ser utilizado para (i) verificar a pureza da E. As suspensões coli K1 preparado para ser alimentado para os animais, e (ii) para diferenciar E. coli K1 de outros coliformes, a fim de calcular a viabilidade em esfregaços perianais, sangue e amostras de tecidos. Se a colônia é E. coli K1, será susceptível a lise bacteriófago K1E, e crescimento bacteriano será inibida no local da inoculação bacteriófago. Se a colônia não é E. coli K1, que vai bresistentes à lise KIE bacteriófago e, e não deve haver uma área de crescimento de bactérias no local da inoculação bacteriófago. Deve-se ter em mente que os modelos animais não pode refletir todas as características da doença que ocorre naturalmente. O modelo actual pode ser modificado para examinar as características de virulência de outras bactérias do que E. neuropatogênicos coli A192PP e variações no tamanho do inoculo colonizar podem ser acomodados. Futuras aplicações da técnica poderia incluir a avaliação de medicamentos tão necessários para tratar a doença e para descobrir detalhes da resposta do hospedeiro à colonização e invasão dos tecidos. O método descrito aqui é simples, mas eficaz. Ninhadas individuais de 10 - 12 crias foram empregados como grupos de teste ou de controlo e esta abordagem dentro-maca garante um elevado grau de reprodutibilidade e validade estatística. É imperativo que os filhotes são devolvidos às suas mães naturais o mais rapidamente possível após qualquer procedure ninhadas e não deve, portanto, compreendem animais submetidos a diferentes intervenções. É importante que o inoculo alimentados ser aquecida de outro modo os filhotes irão rejeitar a cultura oferecido. Os filhotes rapidamente desenvolver uma microbiota complexa e dentro de dois dias após o nascimento do trato gastrointestinal é colonizado com uma vasta gama de bactérias do filo estabelecido como os micróbios mais abundantes no intestino infantil e adulto. Os filhotes que não foram alimentados com E. coli A192PP não carregam E. coli K1 no tracto GI 17 e assim a determinação das taxas de colonização é relativamente simples. No entanto, o método NEUS baseados qPCR para a detecção de colonizar E. coli K1 é muito mais sensível que os métodos tradicionais de cultivo e é fortemente recomendado 17.

Infecções bacterianas sistémicas são uma grande ameaça para o bem-estar ea sobrevivência do recém-nascido; prematuros são particularmente vulneráveis. Meningite bacteriana neonatal (NBM), freqüentemente associada a sepse bacteriana, continua a ser uma fonte significativa de mortalidade e morbidade durante as primeiras semanas de vida e que o problema é agravado pela contínua evolução da resistência a drogas antibacterianas linha de frente 1,2. Um caso de NBM é uma emergência médica que carrega um fardo médico, social e económico elevado 3; conseqüentemente, há uma necessidade urgente de novas terapêuticas e, sobretudo, novas estratégias profiláticas para reduzir a carga da infecção. Algumas características de NBM são incomuns: no mundo desenvolvido, Escherichia coli e estreptococos do Grupo B são responsáveis ​​pela grande maioria dos casos e a capacidade destas estirpes para provocar NBM está quase sempre associada com a presença de um polissacarídeo de protecção cApsule que permite que o agente patogénico para fugir reconhecimento imunológico processa 4. Uma proporção muito elevada (80-85%) de E. neuroinvasive coli expressar a cápsula K1 5,6, um polímero de ácido polissiálico α-2,8-ligadas que é estruturalmente idêntico ao acolher moduladores da plasticidade neuronal 7. A avaliação de novas terapêuticas e profiláticas para NBM e bacteremia e septicemia associada beneficiariam claramente de um modelo animal robusto de infecção que imita as principais características da doença no recém-nascido humano, em particular o forte de dependência da idade e da via natural de infecção . Uma vasta gama de modelos para a meningite bacteriana Gram-positivas e Gram-negativas estão disponíveis 8,9 e estes têm alargado consideravelmente o nosso conhecimento das opções de patogénese, a patofisiologia e tratamento dessas infecções. Assim, as infecções experimentais em ratos, ratinhos, coelhos e macacos foram usadas para estudar a meningite em ambos os neonate e do adulto. No entanto, muitos destes modelos empregam injecção directa intracisternal ou subcutânea de bactérias para a iniciação da infecção, criando uma patogénese artificial, ignorando os processos naturais de difusão a partir do local de colonização. Em alguns casos, estes métodos de inoculação conduziu a alterações significativas na patologia; por exemplo, a administração subcutânea de E. estirpes de E. coli K1 revogada a dependência da idade associada com a infecção natural, produzindo bacteremia e invasão do sistema nervoso central (SNC) em ambos os recém-nascidos e adultos 10. Predisposição a E. coli NBM é criticamente dependente da transmissão vertical do agente causador da mãe para o bebê no momento ou logo após o nascimento 11. Maternalmente-derivado E. bactérias coli K1 colonizar o gastrointestinal neonatal (GI) 13/11, que é estéril ao nascimento, mas rapidamente adquire uma microbiota complexa 14. Em recém-nascidos colonizados, E. coliK1 bactérias têm a capacidade de translocar a partir do lúmen intestinal para a circulação sistémica antes de entrar no SNC através do sangue ou cérebro-cefalorraquidiano de sangue barreiras de fluido 9,15. O design de modelos robustos de infecção experimental deve levar esses detalhes em conta. Embora os ratos têm sido amplamente utilizados para o estudo de algumas formas de meningite bacteriana 8, eles não são adequados para estudos de infecção neonatal: eles são esmagados por uma infecção sistémica e não mostram a forte dependência da característica idade de 16 bebés humanos. Além disso, α-defensinas, péptidos-chave do tracto GI, proporcionando protecção contra a invasão por E. sistémica coli K1 17, são altamente expresso em células de Paneth e neutrófilos nos seres humanos e de ratos, mas não em ratos 18. Há um notável grau de duplicação, redundância e heterogeneidade no rato defensin e genes relacionados cryptidin não encontrada em outro umanimais produtores 19. O rato neonatal foi inicialmente usado por Moxon e colegas de trabalho de 20 para investigar a patogênese da meningite por Haemophilus influenzae após inoculação intranasal, replicando o local natural da colonização deste patógeno neonatal no ser humano, e posteriormente adaptado para a idade-dependente E. coli K1 bacteremia e meningite. Bortolussi et al. 21 empregada injeção intraperitoneal do inóculo bacteriano para iniciar a infecção, mas o estudo fundamental de Glode e colaboradores 22 utilizaram alimentação gástrica por via oral para paralela a via natural de infecção após colonização GI. Como o tubo gástrico pode danificar superfícies mucosas, o procedimento foi aperfeiçoada para incluir a alimentação do inóculo para os recém-nascidos 23. Aqui, o método de colonização e procedimentos para a detecção da infecção em filhotes de ratos suscetíveis são descritos trato GI; adicionalmente, são discutidas aplicações terapêuticas e preventivas do modelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td>
			<td>Harlan, UK</td>
			<td>www.harlan.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K1 A192PP</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriophage K1E</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0337</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P4417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>E7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>84020 
			Prepare 20-50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Solution</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R0901 
			10&#181;l/mg tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>320099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>C2432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>322415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped swabs</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>11542483</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcotip Swabs</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>www.scientificlabs.co.uk</td>
			<td>SWA1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P5856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL Universal Tube</td>
			<td>AlphaLaboratories, UK</td>
			<td>www.alphalabs.co.uk</td>
			<td>CW3890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1405-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1415-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;l calibrated loops</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-0112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreaders</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-1005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>10594175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12780036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with blunt tips</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12391369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps watchmaker&#39;s curved with very fine points&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12740926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight with very fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12972055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Scissors</td>
			<td>VWR, UK</td>
			<td>www.vwr.com</td>
			<td>USBE4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Syringe Needles</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
			<td>N2525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>PerkinElmer, UK</td>
			<td>www.perkinelmer.co.uk</td>
			<td>L60000BB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unitemp Incubator</td>
			<td>B&#38;T, UK</td>
			<td></td>
			<td>OP958</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>INFORS HT, UK</td>
			<td>www.infors-ht.com</td>
			<td>AJ118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td>
			<td>IKA Werke</td>
			<td>www.ika.com</td>
			<td>0003737000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

A investigação das interações entre hospedeiro animal e patógeno bacteriano só faz sentido se o modelo de infecção empregada replica as principais características da infecção natural. Este protocolo descreve os procedimentos de elaboração e avaliação de infecção sistêmica devido a neuropatogénico K1 Escherichia coli no rato neonatal. A colonização do tracto gastrointestinal leva à difusão do agente patogénico ao longo do curso da linfa-intestino-sangue-cérebro de infecção e o modelo exibe forte dependência da idade. A cepa de E. coli O18: K1 com maior virulência para o rato neonatal produz excepcionalmente altas taxas de colonização, a translocação para o compartimento de sangue e invasão das meninges após o trânsito através do plexo coróide. Tal como no hospedeiro humano, a penetração do sistema nervoso central é acompanhada por uma inflamação local e um resultado invariavelmente letal. O modelo de utilidade é comprovada por estudos do mecanismoda patogênese, para a avaliação de intervenções terapêuticas e para avaliar a virulência bacteriana.

A E. coli K1 modelo de infecção sistémica descrito aqui replica muitas das características da infecção natural em seres humanos. As bactérias são ingeridos, colonizar o tracto GI, se translocam para o compartimento do sangue através dos nódulos linfáticos mesentéricos antes de estabelecer a doença específica do órgão associada à inflamação do cérebro 24. É importante ressaltar que o modelo apresenta forte dependência dos idosos; como mostrado na Figura 3, de dois dias de idade (P2) crias de ratos são altamente susceptíveis à doença invasiva, mas ao longo de um período de sete dias, os animais tornam-se progressivamente mais refractários à infecção, mas não para a colonização do tracto GI 17. Depois de trânsito a partir do local de colonização GI para o compartimento do sangue, as bactérias podem ser visualizados em amostras de sangue por microscopia de fluorescência (Figura 4) antes de entrar no SNC predominantemente no plexo coróide 25. Em alguns animais, existe extensa invasão de outros órgãos importantes, tais comopulmão, baço e rins 25. Os números bacterianos em tecidos pode variar entre substancialmente 25 crias individuais, mas quando a carga microbiana é pontuado como presente ou ausente existe um elevado grau de reprodutibilidade em relação à invasão de órgãos. Com uma ninhada de 12 filhotes de cachorro como um único grupo de teste, cálculos de potência, usando G * Power Software determinou que este tamanho de amostra equivale a uma probabilidade de 98,6% de encontrar um efeito baseado na sobrevivência utilizando seis animais da coorte e&gt; 99% de probabilidade, se tudo doze são levados em consideração. O modelo é, portanto, adequado para a avaliação de novos agentes, concebidas especificamente para o tratamento de infecções bacterianas neonatais e foi usado no procedimento para avaliar o potencial terapêutico da cápsula depolimerase EndoE que remove selectivamente a cápsula K1 a partir da superfície bacteriana 24-26. Ele também pode ser usado para investigar interacções hospedeiro-bactérias que têm impacto sobre o pathogenesis de E. neuropathogens coli; dentro deste contexto, tem sido utilizada para estudos de E. colonização coli A192PP e divulgação. Foi demonstrado que a E. coli A192PP persistem no tracto GI de P2, P5 e P9 filhotes em grande número; aspectos temporais da colonização nestes três grupos foram muito semelhantes (Figura 5) e reflecte a capacidade das bactérias para replicar e manter a densidade de população no intestino. A virulência do isolado clínico A192 foi melhorada por passagem em série em ratos recém-nascidos, a fim de assegurar pouca ou nenhuma redundância do uso de animais. E. coli A192 colonizado ratos neonatais P2 com 100% de eficiência, provocada bacteremia em 35% dos animais e produziram um efeito letal em 25% 27. O A192PP derivado passadas coloniza o trato gastrointestinal, produz bacteremia e provoca letalidade em todas as crias P2. Assim, o modelo pode ser utilizado para investigar a virulência de different K1 estirpes no que diz respeito à sua capacidade de invadir o sistema nervoso central e outros sistemas de órgãos a partir do local de colonização. Neste contexto, Pluschke e co-trabalhadores 23 utilizado um modelo de infecção de rato neonatal para determinar a capacidade de 95 E. coli K1 cepas de origem humana para causar bacteremia após a colonização do intestino; eles observaram grandes variações na eficiência de ambos colonização e capacidade invasiva, sustentando a natureza clonal de E. coli K1 neuropathogens. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Materiais para coleta de tecido: (A) balança, (B) tubos pré-pesados ​​contendo mídia necessárias, (C) operação de mesa, régua e agulhas de definir o animal, (D) 70% (v / v) etanol e PBS para esterilizar o equipamento de recolha de tecidos, <strong&gt; (E) kit de recolha de tecido incluindo uma grande par de tesouras para a decapitação e tesouras e pinças e lâminas de vários tamanhos e formas, (F) de gelo para preservar os tecidos, (G) 70% (v / v) de etanol para esterilizar mesa de operação e circunda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. Separação do trato GI e sistema linfático mesentérico. (A) Segure a massa central do sistema linfático mesentérica com uma pinça de dissecação multa. (B) Segure a parte proximal do intestino delgado, e puxar em direções opostas. (C) O trato gastrointestinal e sistema linfático mesentérica será totalmente separate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Sobrevivência de filhotes de ratos recém-nascidos com idade a partir de dois dias (P2) a nove dias (P9), após a administração oral de E. coli A192PP, ilustrando a forte dependência idade de infecção sistêmica. Cada grupo representa 24 recém-nascidos. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. As imagens de fluorescência de E. coli em células A192PP um esfregaço de sangue a partir de um cachorro P2 infectada, após a administração oral de bactérias. O antigénio de lipopolissacárido ó na superfície bacteriana foi rained elevação com anticorpo policlonal de coelho anti-O18 e segundo anticorpo conjugado Alexa546 de cabra anti-coelho. A cápsula K1 foi visualizado com reagente EndoE-GFP. Virtualmente todas as bactérias detectados em amostras de sangue exibida a cápsula de protecção K1. As imagens foram capturadas pelo Dr. Andrea Zelmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="A Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. E. coli A192PP colonização intestinal a seguir à administração do inoculo bacteriano. O DNA foi extraído a partir de todo intestino e E. unidades formadoras de colónias / g (CFU / g) de tecido coli K1 determinado pela reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) gene alvo polysialyltransferase (NEUS) tal como descrito noutro local 17 </sup&gt;. LOD: limite de detecção. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Característica </td><td> Saudável </td><td> Insalubre </td></tr><tr><td> Cor da pele </td><td> Rosa </td><td> Pálido / Amarelo </td></tr><tr><td> Agilidade (reflexo de endireitamento) </td><td> Pup reverte imediatamente em colocação para trás </td><td> Dificuldade em reverter colocação para trás (&gt; 3 seg) ou não pode alcançar </td></tr><tr><td> Uma leve pressão no abdômen </td><td> Não há som </td><td> Som da agitação </td></tr><tr><td> Estômago line / leite </td><td> Visível e branco </td><td> Não visível </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> Quente </td><td> Relativamente frio * </td></tr><tr><td> Peso </td><td> Ganho de 1,5-2 g por dia </td><td> Nenhum ganho ou perda de peso </td></tr><tr><td> Comportamento quando colocado na gaiola </td><td> Move-se para a mãe e começa feeding </td><td> Não é possível mover em direção a mãe e mostra dificuldade para se alimentar </td></tr></tbody></table> Tabela 1. sete pontos sistema de pontuação: As três primeiras contagens listados são geralmente os primeiros sinais observados. * Recém-nascidos com infecção sistêmica experiência temperatura corporal elevada (&gt; 2 ° C). No entanto, devido à falta de agilidade dos animais para chegar a sua mãe para manter a temperatura corporal, os animais não saudáveis ​​pode separar-se da maca e sentir frio à mão nua.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.8K visualizações.  University College London.  Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide. 

Vídeo: Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em Modo Batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...