Nosso protocolo permite a disseminação bacteriana e o rastreamento de cargas em um modelo experimental de sepse neonatal em tempo real, e a capacidade de correlacionar outros marcadores da doença com a carga do patógeno. Este protocolo permite analisar longitudinalmente a sepse em camundongos neonatais individuais, proporcionando a oportunidade de observar e comparar dinâmicas de infecção e disseminação bacteriana em tempo real. Testes pré-clínicos de intervenções para sepse neonatal podem ser realizados com este método, permitindo o monitoramento dos efeitos do controle hospedeiro das bactérias.
Comece colocando filhotes com correspondência etária em grupos de lixo de alta ou baixa dose dentro de um armário de nível dois de biossegurança. No terceiro ou quarto dia pós-natal, registo os pesos de todos os filhotes antes da inoculação. Carregue seringas de insulina com PBS ou o inóculo E.coli lux de alta ou baixa dose no armário de biossegurança e coloque as seringas carregadas no gelo.
Coloque o recém-nascido para ser injetado em uma superfície limpa dentro do armário de biossegurança e levante a pele na nuca como se para esfolar o filhote. Insira a agulha chanfrada logo abaixo da pele no espaço criado entre a pele e o músculo. Quando a agulha pode ser sentida sob a pele, injete 50 microliters do inoculante enquanto libera simultaneamente a porção beliscada da pele para evitar o fluxo de costas, em seguida, remova a agulha lentamente e com cuidado.
Quando todos os filhotes tiverem sido injetados da mesma maneira, devolva os filhotes para suas barragens. Imediatamente após a injeção e nos pontos de tempo experimentais apropriados posteriormente, coloque a gaiola com e.coli lux infectados camundongos neonatais e barragem em uma capa de fluxo laminar de nível dois de biossegurança e abra o software no computador micro CT. Depois de inicializar o sistema e esperar que a temperatura do palco seque a 37 graus Celsius e a temperatura do CCD para travar a 90 graus Celsius negativos, coloque até quatro filhotes anestesiados na caixa de imagem na câmara de imagem na posição propensa.
Feche a porta da câmara de imagem e selecione a opção de imagem de luminescência. Selecione o filtro aberto e o próximo e defina o filtro de excitação para bloquear e o filtro de emissão para abrir. Selecione 500, 520, 560, 580, 600 e 620 nanômetros.
Em seguida, imagem os filhotes antes de devolvê-los para a gaiola com a represa com monitoramento até a recuperação da anestesia. No ponto final experimental apropriado, em um armário de biossegurança, dou o recém-nascido eutanizado com 70% de etanol para evitar contaminação e colocar o animal no lado direito. Use fórceps para agarrar a pele entre o abdômen e a perna esquerda traseira e use uma tesoura cirúrgica de ponta fina para fazer uma incisão na pele.
Em seguida, continue a incisão em direção à parte de trás do animal até que todo o baço seja exposto. Use as fórceps e a tesoura para remover o baço do abdômen e colocá-lo na solução apropriada para sua aplicação a jusante. Para obter os pulmões, retire completamente a pele do peito e entre na base do esterno com a tesoura mantida verticalmente, corte para cima até que a caixa torácica seja dividida.
Use fórceps para agarrar os pulmões direito e esquerdo individualmente e remover os pulmões da cavidade torácica. Remova o coração do tecido pulmonar com uma tesoura. Em seguida, coloque o pulmão na solução apropriada para sua aplicação a jusante.
Para realizar um ensaio de morte bacteriana in vitro, coloque o baço não infectado em um coador de nylon de 40 micrômetros dentro de uma placa petri estéril de 60 milímetros contendo cinco mililitros de PBS suplementados com soro bovino 10% fetal e use um estéril êrgula de seringa de três mililitros para desagregar o tecido em uma única suspensão celular. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e colete-as por centrifugação. Resuspend a pelota em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos por três a quatro baços.
Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, lave os baços em PBS e resuspenja a pelota em 250 microliters de PBS complementados com albumina de soro bovino e dois milimões EDTA para contar. Em seguida, isole as células positivas Ly6 B2 com as contas imunomagnéticas apropriadas de acordo com o protocolo do fabricante e semee as células positivas Ly6 B2 enriquecidas em uma única vez 10 para as cinco células por 100 microliters de densidade completa por poço em uma placa preta ou branca de 96 poços. Prepare o inóculo bacteriano na multiplicidade desejada de infecção em um volume final de 100 microliters por poço e adicione 100 microliters de inóculo bacteriano ou médio sozinho a cada poço para uma incubação de uma hora na incubadora de cultura celular.
Ao final da incubação, substitua o meio por 200 microliters de meio fresco completo suplementado com 100 microgramas por mililitro de gentamicina para remover qualquer bactéria extracelular restante e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais duas horas. No final da incubação e em cada ponto de tempo experimental posteriormente, use um leitor de placas para medir a luminescência em cada poço da placa de cultura tampada antes de devolver a placa à incubadora de cultura celular até a próxima leitura. Enquanto a maioria dos animais apresenta altos níveis de bactérias no sangue em 24 horas após a infecção, alguns filhotes têm bactérias baixas ou indetectáveis no sangue, sugerindo a liberação da infecção por este ponto de tempo.
Além disso, as células esplênicas positivas Ly6 B2 neonatais infectadas com e.coli bioluminescente por uma hora antes da remoção de bactérias extracelulares e posterior tratamento de gentamicina expressaram um alto nível de luminescência em três horas que diminui ao longo do tempo indicativo de liberação bacteriana. A imagem animal viva das bactérias luminescentes confirma ainda mais o aumento da disseminação e crescimento de bactérias em filhotes neonatais ao longo do tempo em 10 e 24 horas após a infecção. A imagem intravital em conjunto com a microC facilita a identificação de focos de infecção dentro do cérebro, pulmões e outros tecidos periféricos.
Os pulmões de alguns camundongos altamente infectados demonstram regiões opacas consistentes com consolidação inflamatória que co-localizou sinais bacterianos luminescentes. Estas regiões de exsudato inflamatório presumido não são observadas em pulmões de controle não infectados. Um aumento significativo na expressão inflamatória da citocina em relação aos controles também é observado em grupos de baixo e alto inóculo, correlacionando-se com um notável espessamento da parede alveolar, aumento da hemorragia alveolar e infiltração inflamatória nesses animais.
As coisas mais importantes a se lembrar são executar a técnica adequada ao realizar as injeções e prestar atenção rigorosa aos recém-nascidos ao administrar a anestesia. Utilizando essa técnica, podemos visualizar a sepse neonatal em tempo real para estudar intervenções e hospedar terapias direcionadas visando melhorar a resposta imune.
