Os autores gostariam de agradecer a Emilie Mairey e Emmanuel Donnadieu para a instalação inicial do procedimento.

1. Célula hospedeira humana e cultura bacteriana <ol><li> HUVECs cultura entre passagem 1 e 9 a 37 ° em uma incubadora umidificada com 5% (v / v) de CO 2. Passagem das células quando se aproximam de 80% confluência com tripsina / EDTA para fornecer culturas de manutenção em 75 cm 2 frascos de cultura e culturas experimentais em câmaras de fluxo descartáveis ​​(μ-Slides VI). </li><li> Retirar médio dos frascos para ser várias passagens, lavar as células com 10 ml de PBS, retirar e substituí-lo com 1,5 ml de tripsina / EDTA. Permitir que as células para separar uma cultura de células em incubadora por 5 minutos a 37 ° C. </li><li> Coletar as células com 10 ml de meio de cultura de células em um tubo de coleta de 15 ml. Agregar as células com uma centrifugação de 5 minutos (a 200 g), à temperatura ambiente. Suspender as células em 4 ml de Endo-SFM suplementado com 10% (v / v) FBS e contá-los em uma câmara de Malassez, de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Introduzir 30 mL de uma 1x10 6 células por ml de suspensão HUVEC no canal (3x10 4 no total) e permitir que as células a aderir durante 3 horas a 37 ° em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% (v / v) de CO 2. Adicionar um volume adicional de 120 mL de Endo-SFM para encher os poços. Células devem formar uma monocamada confluentes (Figura 2). </li><li> Crescer N. meningitidis expressando GFP (neste caso a tensão 8013 GFP expressar sob o controle de um promotor IPTG indutível), em placas de agar GCB contendo suplementos Kellogg e 5 mg / ml de cloranfenicol, a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) CO 2 durante 16 horas. </li></ol> 2. Adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras <ol><li> Ajustar a concentração de bactérias cultivadas em placas de ágar GCB a um OD600 de 0,05 com pré-aquecido Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS e incubar por 120 minutos a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) de CO 2, sob agitação suave (130 rpm). Induzir a expressão GFP adicionando 1 mM IPTG para o meio de cultura para o período de incubação todo. </li><li> Coloque o Slide-μ descartáveis ​​no palco de um microscópio invertido equipado com uma plataforma aquecida para manter a temperatura da amostra a 37 ° C. </li><li> Despeje pré-aquecido Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS em um copo de vidro esterilizado e encher uma seringa estéril 50 ml com este meio. Anexar a &quot;entrada&quot; tubulação para a seringa e encher com a introdução médio. </li><li> Conecte o &quot;entrada&quot; para o tubo μ Slide-, com cuidado, a fim de evitar a introdução de ar na câmara. Então, apor a &quot;saída&quot; do tubo para o outro lado e, cuidadosamente, encher o canal com média de aproximadamente 1 cm de distância da câmara &quot;exit&quot;. </li><li> Medir o OD600 bacteriana e ajustar para 0,15 em Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS. A fim de olhar para as bactérias individual, qualquer agregados deve ser interrompido por vórtex vigoroso da amostra bacteriana. </li><li> ML colocar 100 de Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS médio para o reservatório e adicionar 100 ml da solução bacteriana tomadas a partir do topo da solução agitadas para evitar qualquer amostragem restantes agregados de bactérias. </li><li> Cuidadosamente introduzir o volume de 200 mL para o μ Slide-girando a torneira para injetar a bactéria para dentro da câmara. </li><li> Introduzir Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com uma tensão de cisalhamento compatível com adesão de 0,044 dinas / cm 2 por 15 minutos. </li></ol> Ver, por exemplo video 1 ou figura 3. Após esta etapa, mova os pontos 3, 4 ou 6. 3. Quantificação da adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras <ol><li> Após a adesão inicial de 15 minutos, adquirir imagens de dez campos aleatoriamente enquanto o líquido ainda está circulando. </li><li> Analisar as imagens obtidas utilizando o software ImageJ 8, a fim de acessar o número médio de bactérias adherant por campo. Isto é feito da seguinte forma: em primeiro lugar, cada imagem é thresholded usando o &quot;Threshold&quot; janela encontrados no menu &quot;Imagem&quot; para destacar individuais aderir bactérias fluorescentes, minimizando o fundo das células. Então, cada única bactéria é contado, usando o Plug-In &quot;Counter Cell&quot; ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Os dados para cada imagem são relatados em uma planilha do Excel e são em média de quantificar o número médio de bactérias aderentes por campo. </li></ol> 4. Medir a resistência ao fluxo de bactérias individuais aderentes para células hospedeiras <ol><li> Bomba da seringa programa set-up para gerar tensão de cisalhamento variando 3-100 dinas / cm 2 por 5 minutos. </li><li> No final dos 5 minutos, adquirir dez campos escolhidos aleatoriamente, conforme descrito no passo 3.1, mas com o fluxo interrompido prior à aquisição. </li><li> Analisar as imagens obtidas como descrito no passo 3.2 e quantificar o número médio de bactérias remanescentes por campo. </li></ol> 5. Medir o crescimento de uma bactéria isolada aderente a um microcolony <ol><li> Introduzir Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com o stress de cisalhamento escolhido por várias horas. Gravar imagens em tempo real microscopia de vídeo em um quadro a cada 5 minutos. </li><li> Após microscopia de vídeo, parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software. Um exemplo da proliferação bacteriana pode ser visto no vídeo 2. </li></ol> 6. Medir a resistência ao fluxo de aderentes microcolônias bacteriana <ol><li> Após a formação de microcolônias grandes na superfície celular (step5.2) 03/02 adquirir imagens de ambas as células (por contraste de fase) e bactérias (por GFP-fluorescência) antes da aplicação do fluxo. Para o resto do experimento, o protocolo de aquisição vai monitorar somente a fluorescência. </li><li> Aplicação de tensão de cisalhamento alta por 5 minutos (300-100 dinas / cm 2) e gravar imagens em um quadro a cada 5 segundos. </li><li> Parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software. </li><li> Em seguida, remover o &quot;exit&quot; tubo de primeira e com cuidado, para evitar o esvaziamento do canal e em seguida, adicione pré-aquecido meio fresco para encher os poços antes de remover a &quot;entrada&quot; da tubulação. </li><li> Para determinar quantitativamente o efeito do estresse de cisalhamento sobre a resistência bacteriana, um ensaio de revestimento pode ser realizado da seguinte forma: recolher os restantes médio e lavar a μ Slide-duas vezes com 120 mL de PBS, que remove o meio restantes do canal (ambos lavagens são ) também coletados. </li><li> Separar as células infectadas com a adição de 50 l de tripsina / EDTA por 5 minutos a 37 ° e misturar esta amostra isolada com a suspensão coletadas na etapa anterior. </li><li> Realizar diluições em série em PBS e placa de uma fração 10 ml em placas de agar GCB, em triplicado, a fim de determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> Vídeos 3 e 4 comparam a estirpe selvagem com o mutante pilV. 7. Desapego bacteriana de microcolônias <ol><li> Infectar as células na câmara de fluxo, repetindo os passos 2.1 a 2.8 e permitem que a infecção se durante 30 minutos. </li><li> Remover as bactérias não ligado, aumentando o fluxo para 10 dinas / cm 2 por um período de 2 minutos e permitir a infecção para continuar por 2h. </li><li> Reduzir o fluxo para 0,15 dinas / cm 2. </li><li> A cada hora, recolher uma gota de médios saindo da câmara de fluxo. </li><li> Realizar diluições seriadas das amostras e da placa-los em placas de ágar GCB. </li><li> Determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2. </li></ol> 8. Resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> Figura 1: Diferentes etapas de uma monocamada celular que pode ser observado e medido na presença de fluxo no processo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> Figura 2: monocamada de células endoteliais na câmara de fluxo no início de um experimento (ausência de tensão de cisalhamento). Cerca de 50 células endoteliais são organizadas em uma monocamada sub-confluentes. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> Figura 3: Representação gráfica de adesão inicial de bactérias na superfície celular. Valores para três campos são indicados para dar uma idéia da variação de campo para campo, que é esperado (0.044 dinas / cm 2). Vídeo 1. Visualization de adesão inicial de bactérias na monocamada celular como uma função do tempo (0044 dinas / cm 2). Expressando GFP-bactérias estão seguindo a direção do fluído. O filme é acelerado 60 vezes, a duração real do vídeo é de 10 minutos. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Video 2. Depois de bactérias adesão inicial foram autorizados a se proliferar na superfície celular por um período de 7 horas (acelerada mil vezes). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Vídeo 3. Após Proliferação na superfície celular do mecânicoal resistência de microcolônias foi testada através do aumento do nível de tensão de cisalhamento a 10 dinas / cm 2 por 5 minutos, mas microcolônias tipo selvagem são resistentes acelerou 60 vezes. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a> Video 4. Microcolônias formado pelo mutante pilV são interrompidos por aumentar o fluxo (10 dinas / cm 2). Este mutante não induzir a remodelação da membrana plasmática sob microcolônias e é, portanto, mais altamente sensíveis ao aumento da tensão de cisalhamento (vídeo é acelerado 60 vezes) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Clique aqui para ver o vídeo.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A importância da tensão de cisalhamento e, em geral de aspectos mecânicos em biologia é cada vez mais reconhecido. Por exemplo, as propriedades altamente adaptados adesivo da família Selectina de proteínas no processo de adesão de linfócitos e rolando na parede vascular tem sido reconhecida através da introdução de tensão de cisalhamento no processo. O procedimento descrito acima foi aplicado aos Gram-negativos bactéria Neisseria meningitidis, mas deve ser aplicável a uma ampla gama de patógenos. A importância da tensão de cisalhamento foi mostrado também para outros patógenos e sites de outras infecções. Adesão bacteriana condicionada pela tensão de cisalhamento foi descrita pelo estudo da adesina FimH encontrado em Escherichia coli uropathogenic (UPEC) 9. Semelhante ao selectinas, a interação entre FimH e seu receptor da célula hospedeira mostrou-se reforçada por cisalhamento induzida por forças mecânicas 9 eo CFAE adesina de E. coli enterotoxigênica foi relatado também para mediar a adesão de células do epitélio intestinal através de um corte-dependente mecanismo 10. Relatamos, usando o protocolo de fluxo laminar câmara de ensaio descritos neste capítulo que o Streptococcus agalactiae pili foram essenciais para a adesão deste patógeno a células epiteliais em condições de escoamento 11. Esses estudos confirmam que o nosso ensaio de câmara de fluxo é uma ferramenta útil para a investigação de células do hospedeiro-patógeno interações sob condições de estresse de cisalhamento.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> μ Slide-VI 0,4 kit fluxo </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Seringa de 50 ml Plastipak Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tubulação de Tygon R3603 3,2 x 4,8 milímetros </td><td> Fisher-Científico </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Torneira de 3 vias, 2 luer fêmea luer macho </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscópio invertido, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD ou ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

Durante infecções bacterianas uma seqüência de interações ocorrem entre o patógeno e seu hospedeiro. Adesão bacteriana à superfície da célula hospedeira é muitas vezes o passo inicial e determinante da patogênese. Embora experimentalmente a adesão é mais estudado em condições estáticas de adesão ocorre realmente na presença de fluxo líquido. Primeiros encontros entre as bactérias e seu hospedeiro, muitas vezes ocorrem no nível das mucosas, boca, pulmão, intestino, olhos, etc, onde o muco flui ao longo da superfície das células epiteliais. Depois da infecção, patógenos, ocasionalmente, o acesso a circulação sanguínea causando doenças graves, como sepse, septicemia e meningite. A característica definidora dessas infecções é a habilidade desses patógenos para interagir com as células endoteliais na presença de sangue circulante. A presença de fluxo de muco, líquido ou sangue, por exemplo, determina a adesão porque gera uma força mecânica sobre o patógeno. Para caracterizar o efeito do fluxo de um líquido geralmente se refere à noção de tensão de cisalhamento, que é a força tangencial exercida por unidade de área por um fluido em movimento perto de uma parede fixa, expressa em dinas / cm 2. Intensidades de tensão de cisalhamento variam muito de acordo com o tipo de embarcações diferentes, o tamanho do órgão, localização etc (0-100 dinas / cm 2). Circulação nos vasos capilares pode atingir valores de tensão de cisalhamento muito baixas e até mesmo parar temporariamente durante períodos que variam entre alguns segundos a vários minutos 1. Na outra extremidade do espectro de tensão de cisalhamento nas arteríolas pode chegar a 100 dinas / cm 2 2. O impacto da tensão de cisalhamento em diferentes processos biológicos tem sido claramente demonstrado como por exemplo, durante a interação de leucócitos com o endotélio 3. Para levar em conta esse parâmetro mecânico no processo de adesão bacteriana aproveitamos um procedimento experimental baseado na utilização de um fluxo descartáveis ​​câmara 4. Células hospedeiras são cultivadas em câmara de fluxo e bactérias fluorescentes são introduzidas no fluxo controlado por uma bomba de seringa. Inicialmente focada nossas investigações sobre o patógeno Neisseria meningitidis bacteriana, uma bactéria Gram-negativa responsável por septicemia e meningite. O procedimento descrito aqui nos permitiu estudar o impacto da tensão de cisalhamento sobre a capacidade das bactérias para: aderir às células 1, a proliferar na superfície da célula 5 e destacar a colonizar novos sites 6 (Figura 1). Informações técnicas complementares podem ser encontrados na referência 7. Valores de tensão de cisalhamento aqui apresentados foram escolhidos com base em nossa experiência anterior e 1 para representar os valores encontrados na literatura. O protocolo deve ser aplicável a uma ampla gama de patógenos, com ajustes específicos dependendo dos objetivos do estudo.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K visualizações.  INSERM U970. Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Vídeo: Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Imunologia e Infecção

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...