Os autores gostariam de agradecer a oficina MRC-LMB para a produção do cano da arma gene reforçada. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. David R. Hampson na Universidade de Toronto para o uso de equipamentos e recursos.

A utilização de animais e tecidos de origem animal devem aderir estritamente a aprovação ética comitê sob regras e regulamentos locais. Todos os tecidos obtidos durante este estudo seguiram os critérios de experimentação animais do MRC-LMB. 1 Preparação de Materiais e Meios de Cultura <ol><li> Prepare todas as soluções que utilizam água Millipore; utilizar apenas reagentes de grau analítico. Preparar e armazenar todos os reagentes à temperatura ambiente (salvo indicação em contrário). </li><li> Adicione 500 ml de solução salina tamponada com HEPES (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtrar através de uma unidade de filtro estéril de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Adicione 500 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS; de 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, 137 mM de NaCl, KCl 2,7 mM, pH 7,4). Esterilizar em autoclave. </li><li> Preparar meio neuronal, completando DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco) com HEPES 25 mM, 10% de soro fetal de vitelo, 30 mM de glucose, 1: 100 N2 supplement, penicilina-estreptomicina 1100 U / ml; pH 7,2. Filtro com uma unidade de filtro estéril de 0,2 um. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Faça solução de polivinilpirrolidona (PVP) de ações com 20 mg em 1 ml PVP 100% de etanol. Alíquota isso em 1 ml quantidades, congelar e armazenar a -20 ° C. A solução de trabalho é de 0,05 mg / ml, por conseguinte, adicionam-se 10 ul de solução de reserva de PVP a cada 4 ml de etanol a 100%. </li><li> Prepara-se uma solução de reserva 0,05 M, espermidina em água Millipore; ajustar o pH para 7,2. </li><li> Adicione uma solução de agarose a 2% em DMEM (2 g de agarose grau electroforese em 100 ml de DMEM em um frasco de tampa de rosca esterilizado). Microondas isso até que a agarose foi dissolvida. Guarde na geladeira a 4 ° C durante várias semanas, se necessário. </li></ol> 2 Preparação de Organotípicas Fatias <ol><li> Eutanásia C57 Preto 6 machos da idade desejada por asfixia com CO2, seguido por decapitação. Remover o cérebro usando cortes lateral do crânio, partindo do forame magno e terminando noos lobos olfativos. Suavemente elevar a partir da parte traseira do crânio para expor o cérebro. </li><li> Cortar entre os lóbulos olfactivas e o córtex frontal e rostral ao cerebelo. Suavemente elevar a porção rostral do cérebro e cortar os nervos ópticos. Por fim, retire o cérebro e colocá-lo em uma placa de petri preenchida com soro fisiológico gelado frio HEPES no gelo. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, retire a pia usando uma pinça fina; cuidadosamente remover meninges e vasos sanguíneos em torno do cérebro. </li><li> Coloque o cérebro fresco em um pequeno molde recipiente e cubra-o com a solução de agarose arrefecido a ligeiramente acima da RT. Em seguida, arrefecer rapidamente o molde a 4 ° C, colocando-o em gelo. NOTA: Processar os fatias tão rapidamente quanto possível para evitar a perda de viabilidade. </li><li> Quando a agarose foi definido (5 - 10 min), remoção do cérebro embebidas em agarose a partir do molde (guarnição se necessário) e, em seguida, cola-lo para a plataforma vibroslicer. Coloque isso em uma câmara vibroslicer contendo gelo estéril PBS frio. Disinfect a câmara vibroslicer antes de serem utilizados com etanol a 70% para minimizar as contaminações subsequentes. </li><li> Corte o cérebro usando um vibroslicer personalizado construído ou equivalente comercial. O conceito de modelo foi desenhar um fatiador de tecidos que podem gerar uma grande amplitude e alta frequência de movimentos horizontais para a aresta da lâmina, enquanto minimiza as vibrações verticais. </li><li> Utilizar a frequência de oscilação de 90 Hz, a uma amplitude de 1,5 - 2,0 mm, e a lâmina de corte posicionada num ângulo de 15 ° em relação ao plano horizontal; definir o bloco de montagem prende o cérebro embebidas em agarose a mover-se em 1,7 mm / min, para a lâmina. Recolhe secções (150 um) para um meio contendo gelo cultura câmara fria (DMEM Pen / Strep + 10% de FCS). Ver corte e manipulação das fatias de tecido como um vídeo complementar em Arsenault e O&#39;Brien 13. </li><li> Delicadamente, coloque as fatias em inserções de cultura de células (0,4 um, 30 milímetros de diâmetro) em uma bandeja 6 multi-bem com os med culturaIA no exterior do inserto, e incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. NOTA: Para a viabilidade do tecido adequado, ser extremamente gentil ao transferir e manipular as fatias. Além disso, o excesso de fluido irá impedir que as fatias organotípicas de aderir à membrana do cartucho do filtro. Se isso acontecer, remova o excesso de fluido ou placa novamente. </li><li> Apesar de os cortes organotypic podem ser cultivadas por algumas semanas, prossiga para a transfecção, o mais tardar quatro dias após o plaqueamento para melhores rendimentos de transfecção. NOTA: Para evitar o crescimento excessivo da glia em condições de cultura de longo prazo, o uso AraC ou meio sem soro 2. </li></ol> 3 Preparação revestido de ADN Micro e Nano-projéteis <ol><li> Prepare nano-projéteis usando 40 nm partículas de ouro diâmetro. Resumidamente, adicionar 50 ul de espermidina 0,05 M, e 10 uL de ADN a 1 mg / ml (pEYFP-N1) e 10 mg de partículas de ouro. <ol><li> Adicionar cálcio e espermidina no mix de soluçãotura durante ADN micro-partículas de ouro de preparação, a fim de auxiliar a ligação de moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro. NOTA: A quantidade de DNA usada por mg de ouro transportadoras (DLR), deve situar-se entre 1 e 5 ug de ADN por mg de ouro 1. Além disso, a quantidade de partículas de ouro transportadoras que vai ser disparado por cartucho (MLQ), em si deve variar de 0,1 a 0,5 mg de ouro. O DLR e MLQ devem ser julgados e otimizado para cada usuário, dependendo do sistema particular sob investigação, bem como o tipo de partícula e gene arma usada. </li></ol></li><li> Misturar utilizando um vórtice enquanto se adicionavam lentamente 50 mL de 1 M de CaCl2 em fracções de 10 - 15 mL. Após 5 min de vórtex ocasional, centrifugar a 1000 xg por 30 segundos, em seguida, remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de partículas de ouro em 3,5 ml de 0,075 M de PVP. </li><li> Desenhar desta suspensão em tubos (diâmetro interno 2,36 milímetros), utilizando uma seringa. Coloque o tubo na estação de preparação de tubulação. Permitir que opartículas de ouro para assentar e remover o sobrenadante por aspiração com uma seringa. Girar o tubo de espalhar uniformemente as partículas de ouro, que foram subsequentemente secas sob uma corrente de azoto constante de 5 L por min. </li><li> Para criar ADN balas, cortar o tubo usando um cortador de tubos em um centímetro de comprimento. Ou imediatamente inserir no interior do cartucho de pistola de genes ou manter desidratado (4 ° C), até ser necessário. </li></ol> 4. Biolistic transfecção em Organotípicas Fatias <ol><li> Execute as seguintes etapas dentro de uma capela de fluxo laminar estéril. </li><li> Insira uma bateria de 9 V e um suporte de cartucho vazio na arma gene Helios. </li><li> Fixe a pistola de genes para o tanque de hélio, com a mangueira de hélio. Fogo 2-3 espaços em branco (espaços vazios) a 50 psi para pressurizar o tubo de hélio e os reservatórios da arma. </li><li> Carregar os cartuchos contendo o ouro revestido de ADN dentro dos suportes de cartucho e carregar o suporte na pistola de genes. </li><li> Desaperte o gene gun espaçador e anexaro cano da arma de genes modificados para a pistola de genes. </li><li> Utilizando uma pinça estéril, colocar um elemento filtrante contendo a fatia organotípica em um prato de plástico estéril. </li><li> Remova a mídia da fatias organotypic. </li><li> Ajuste a pressão do gás a 50 psi. Observação: A proteção dos olhos é essencial e protetores de ouvido aconselhável. </li><li> Coloque a pistola de genes nas distâncias adequadas, utilizando a montagem de medição para 10 mm. Procurar com cuidado o centro do tambor sobre a região desejada para entrega genética. </li><li> Após o disparo, substituir as pastilhas de volta para o seu prato com meio fresco e devolvê-las às condições normais de crescimento, isto é, 37 ° C com 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Uma vez terminado, feche o tanque de hélio, solte a pressão da pistola de genes e retirar a arma gene do tanque de hélio. </li><li> Retire o suporte do cartucho e descartar os cartuchos e limpar a arma gene. </li><li> Verifique o tecido para a morfologia e para a penetração bem sucedida por viLízing as fatias utilizando um microscópio invertido. Se estiver usando micropartículas, dispersar uniformemente o ouro; não deve haver áreas densas de partículas de ouro visto na fatia. As nanopartículas, devido ao seu pequeno tamanho não pode ser visto como unidades individuais por técnicas de microscopia convencional. </li><li> Após o intervalo de tempo apropriado (normalmente 1-2 dias), as fatias de fixar em 4% de paraformaldeído (PFA) para observação microscópica. NOTA: Fixação em PFA nem sempre é desejado. Para imagem de células vivas evitar este passo. </li></ol> 5 Fixação e visualização de fatias do cérebro <ol><li> Após transfecção biolística, fatias lavar duas vezes em PBS durante 2 min. </li><li> Fix fatias por incubação em frescos, gelada PFA a 4% em PBS durante 20 min. </li><li> Lavar as fatias duas vezes em PBS durante 2 min. </li><li> Gentilmente cortar rodada da membrana suporta o uso de um bisturi, sem perturbar as fatias montadas sobre eles. Use uma pinça para colocar cada membrana apoio / fatia em uma lâmina de microscópio. Descanse o organotypic fatias por cima da membrana da lâmina de vidro. </li><li> Adicionar uma gota de meio de montagem por cima da fatia e adicionar uma lamela suavemente sem qualquer força directamente em contacto com a fatia organotípicas. </li><li> Fixe a lamela com uma fina camada de verniz para as unhas. </li><li> Ver as fatias em um microscópio apropriado. </li></ol> 6. Aplicações confocal <ol><li> Visualize as fatias usando uma confocal de varredura a laser microscópio vertical com um 60x / 1,4 abertura numérica (NA) de imersão em óleo lente objetiva. NOTA: A característica mais problemática do microscópio confocal é o tamanho pinhole (fixado em 1 UA), que é capaz de isolar e recolher um plano de foco, eliminando assim o fora de foco &#39;névoa&#39; normalmente visto com uma amostra fluorescente. Os detalhes finos são muitas vezes obscurecido pela névoa e este não pode ser detectada num microscópio nonconfocal. </li><li> Defina o laser de argônio para um comprimento de onda de excitação de 488 nm e otimizar a coleta de lositted luz na banda de 500-520 nm. Tipicamente, recolhem imagens em 1024 x 1024 pixels e com pilhas de z-secções em intervalos de 0,5 micron para abranger toda a largura de cada uma das células do nervo, que foi analisada. <ol><li> Para observar a morfologia do núcleo, contra-coram as células com DAPI (comprimento de onda de excitação fixado em 405 nm e a emissão de luz recolhida entre 420-4 40 nm). Finalmente, para o exame de fluorescência vermelha, colocar o laser em 561 nm para excitação e 565-620 nm para emissão. </li></ol></li><li> Normalmente, aquisição de imagens usando um zoom de 4X varredura que cobriu uma área de 57,6 mM 2; tamanhos de imagem foram na região de 1.024 x 1.024 pixels. Pilhas recordes de z-seções em intervalos de 0,5 micron e projeções de 5-8 quadros combinados. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+the+central+nervous+system+after+intracerebroventricular+injection+of+adeno-associated+viral+vectors+in+neonatal+and+juvenile+mice.">Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice.</a> Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).</li><li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+protease-cleaved+SNARE+fragments+induce+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells.">Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).</li><li>Arsenault, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapling+of+the+botulinum+type+A+protease+to+growth+factors+and+neuropeptides+allows+selective+targeting+of+neuroendocrine+cells.">Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells.</a> Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).</li></ol>

Dr. John A. O'Brien holds patents for the improved gene gun barrel. US patent number 10/380,452 and European patent Number 01974517.3.

O protocolo descreve abordagens para entregar corantes e materiais genéticos em fatias organotípicas adultas utilizando uma pistola de genes melhorada. Essencialmente, os tipos de corantes e a variedade de possíveis genes fazem deste método multifacetado e passível de responder a uma grande variedade de questões biológicas. O método de entrega regiosseletiva utilizado, neste caso, a região específica do cérebro, abre novos caminhos para a experimentação como modulação de genes heterólogos de áreas localizadas dentro de uma arquitetura biologicamente relevante não foi facilmente exequível antes. Temos previamente determinado que este método pode ser usado em fatias organotípicas adulto, onde sinapses maduras são totalmente formados, tal como revelou melhoria na sobrevivência de células e expressão de genes heterólogos para muitas semanas 13. Com o advento de novas e melhoradas as condições de cultura para o cérebro de mamíferos, bem como outros tecidos, a utilização de modulação genéticas regiosselectiva se tornará cada vez mais úteis para uma grande variedade de BiocheMical analisa. Como vamos destacar aqui e anteriormente mencionado por outros 24, muitos fatores diferentes podem facilmente afetar a precisão e confiabilidade de entrega biobalística. Em primeiro lugar, a preparação das partículas de ouro ligados a corantes ou de DNA deve ser adequadamente equilibrado para evitar a agregação e a fim de facilitar a expulsão da carga do cartucho. Cálcio e espermidina na solução de micro partículas de ADN-ouro pode ajudar a ligação das moléculas de ADN para as nanopartículas de ouro. A capacidade para as nanopartículas de penetrar nas células, sob pressão reduzida foi previamente determinado 17. Em segundo lugar, a arma gene deve ser montado o mais estável possível com o ângulo ea distância correta. Um manómetro de confiança é também necessário para a reprodutibilidade, para manter a integridade do tecido, e para acelerar adequadamente as partículas de ouro para os seus objectivos pretendidos. Com efeito, a distância, a orientação, e a estabilidade do equipamento também estão factores cruciais para a targeting e precisão de entrega regiosseletiva. Como estas estruturas cerebrais são muito pequenas, pequenas variações no ângulo de disparo poderia facilmente tornar todo o processo mais confiável. E, finalmente, a preparação e manutenção de fatias organotypic viáveis ​​foram repleta de dificuldades para muitas décadas ainda protocolos abundantes e confiáveis ​​para animais diferentes, regiões do cérebro, idades e co-culturas estão disponíveis 2,4,25,26. Estes procedimentos devem ser antes de submeter os tecidos para procedimentos biolística otimizado pelo usuário. Isto irá mais facilmente permitir ao utilizador verificar unbiasedly o impacto das partículas biolística e o efeito do gene heterólogo nas suas próprias culturas. Para este fim, a utilização de genes fluorescentes tais como EYFP EGFP e tanto pode permitir um novo utilizador para testar a precisão de direccionamento e também a seguir a viabilidade celular através da expressão do gene heterólogo ao longo de um período sustentado de tempo 13. Muitos dos passos críticos para fiávele uso reprodutível deste protocolo são destacados nos três parágrafos seguintes. Para a transfecção eficaz, a concentração de DNA deve ser apropriado. As concentrações que são muito baixos prejudicaria o rendimento transfecção enquanto que as concentrações muito altas pode causar aglomeração das nanopartículas. Os agregados de ouro pode reduzir drasticamente a eficiência da transfecção, causar distribuições irregulares, e pode levar a um aumento da citotoxicidade e stress oxidativo. Problemas com a eficácia do revestimento são provavelmente devido à expiração da solução espermidina (deve ser substituído a cada 2 a 3 meses). Para uma propagação biobalística adequada, a rotulagem deve ser mesmo. A marcação não-homogénea da suspensão de nanopartículas de ouro / ADN pode ser devido à solução de PVP. Também deve ser substituído cada 2 a 3 meses. Revestimento das nanopartículas de ouro pode ser visto na electroforese em gel de agarose, como uma faixa de MW mais elevado 27. Cada sist biológicalos sob investigação, bem como cada instrumento diferente usado pode exigir pequenas mudanças na pressão do gás para atingir níveis optimizados de transfecção e propagação biobalística. O parâmetro crítico é a pressão do impulso de hélio necessário para retirar o micro ou nano-transportadores a partir do cartucho de plástico e empurrá-las para o tecido. A pressão do gás de alta vai afetar a sobrevivência da célula, porque vai criar ondas de choque em todo o alvo e interromper ou retirar o tecido da matriz 17. Visando o cano da arma de genes e possuindo o aparelho exatamente perpendicular ao tecido é importante para a entrega precisas biolística. A área seleccionada deve ser colocado no centro do tambor directa, precisamente de 10 mm da abertura exterior. Isto resulta em um diâmetro de 3 mm de distribuição de partículas de ouro em volta do epicentro. O cano da arma gene deve ser limpa com álcool 70% após cada utilização. Para proteger o tecido a partir de grandes agregados de partículas, o tambor também contém uma malha de nylon que should ser substituídas regularmente para manter o desempenho ideal. A fim de substituir as malhas desapertar a tampa, em seguida, inserir uma nova malha de nylon entre a tampa eo O-ring. Células marcadas por fluorescência deveria ser visível pelo menos 1 - 2 dias após a transfecção em torno do epicentro. Ausência ou desalinhamento de rotulagem pode ser resultado de uma preparação inadequada e instabilidade da montagem arma gene. As observações de células usando microscopia confocal depende de uma série de factores: o comprimento de onda da luz de excitação / emissão, o tamanho do orifício, NA da lente objectiva, de índice de refracção dos componentes no caminho da luz, a profundidade do tecido, e o alinhamento de o instrumento. Esses fatores devem ser otimizados para cada sistema sob investigação. Recentes avanços em biolï¿½tica foram exploradas para o sucesso deste método. O cano da arma de genes utilizados no presente estudo foi modificado de modo a reduzir a pressão necessária, assim como canalizar o biolï¿½ticapadrão de dispersão para uma forma mais restrita e específica área de 17,19. Outras modificações barril tentaram restringir a disseminação de biobalística e reduzir a pressão de saída 28 ainda este gene cano da arma projetado projetado pelo Dr. O&#39;Brien é um único componente instalado na arma Helios Gene padrão. Subsequentemente, as partículas sub-micrométricas de ouro foram usadas para reduzir a capacidade de invasão das partículas micrométricas que determinaram previamente causado dano celular e em última instância, a perda de expressão do gene heterólogo sustentada. Estas modificações do procedimento de biolística melhorou a viabilidade global e reprodutibilidade do método 13. Outras melhorias na preparação fatia como solução de problemas em profundidade do processo de corte, usando uma matriz de DMEM-Agarose para preservar o cérebro, e vários outros avanços úteis para organotípica preparação fatia do cérebro relatado anteriormente 13 nos permitiu explorar o uso de fatias de adultos que desenvolveram maduraredes sinápticas. Em nosso estudo, principalmente utilizados corantes e genes heterólogos fluorescentes para visualizar a morfologia das células como uma leitura sobre a eficiência de transfecção e uma capacidade de imagem das características morfológicas dos neurônios nos tecidos cerebrais do rato. A relação sinal-ruído da entrega estocástica dentro de um raio definido nos permitiu isolar completamente porto dendrítica de uma única célula dentro de seu contexto de origem. Como são utilizados numerosos esforços para investigar essas características morfológicas, de mapeamento &#39;conectonomia &quot;ou para marcar células individuais para várias análises, este método pode ser facilmente combinada com protocolos existentes, tais como eletrofisiologia e neurite medições 29,30. Evidentemente, as combinações de genes heterólogos fluorescentes poderia permitir uma delineação muito mais robusta das células individuais como da distribuição estocástica de proteínas fluorescentes, e a sua combinação poderia determinar a cor das células individuais 31,32. A utilização de promotores específicos de células, como a sinapsina e proteína glial fibrilar ácida a montante do exão do gene heterólogo pode também restringir a expressão de 33 subpopulações. Com efeito, a variedade sem fim de material genético pode também ser administrado de uma maneira regio-selectiva por nanopartículas de ouro, utilizando o mesmo procedimento. As regiões totais transfectadas podia assim ser analisados ​​com os métodos tradicionais, tais como a dissecção e submetendo-a região inmunotransferência para analisar o efeito localizado do gene heterólogo. As melhorias nos processos fatia organotypic também permitirá uma maior utilização de tecidos do cérebro para a experimentação de longo prazo, bem como permitir o uso de outros tecidos e co-culturas e facilitaria os procedimentos de transfecção. Lipid e transfecção polímero previamente relatado para afetar a homeostase da membrana, internalização, permeabilidade proteína 34 e freqüentemente mostram uma eficiência muito baixa para transf terminally diferenciado neurônios. Direccionamento celular específico de carga é também susceptível apenas a células que expressam os receptores da superfície celular necessários para a internalização, e embora este método pode ser altamente selectivo, que pode faltar regiosselectividade 35 segmentada. Os vetores virais de outra forma são muitas vezes difíceis e caros de produzir, exigem normas rígidas e têm na ocasião demonstrou preocupações com a segurança. Entrega biobalística, portanto, tem uma capacidade inigualável para transf regiosseletivamente neurônios e outros tipos de células dentro dos tecidos viáveis. Como o ouro é não tóxico, mais avanços no uso de biobalística poderia pavimentar o caminho para usos biomédicos, tais como a administração transdérmica farmacêutica, na entrega gene vivo não invasiva, bem como terapias genéticas não virais localizadas.

Originalmente, a técnica de biobalística, uma frase da virada para &quot;balística biológicos&quot;, foi criada para a transferência de genes mediada por partículas em células de plantas 1. Este método físico de transformação celular ou nanopartículas micro acelera a velocidade elevada para superar as barreiras físicas das membranas celulares impermeáveis ​​de modo a fornecer cargas, tais como o DNA ou corantes. Porque não dependem de ligando-receptores específicos e / ou as propriedades bioquímicas nas membranas da superfície das células, a transferência de genes mediada por partículas pode ser facilmente aplicado a uma variedade de sistemas biológicos, tais como fatias cerebrais organotípicas. Usando fatias organotypic têm vantagens sobre outros em plataformas in vitro, uma vez que manter muitas propriedades anatômicas e bioquímicas que são pertinentes para in vivo biologia 2-4. As fatias de conservar a maior parte das características arquitetônicas locais de onde eles se originaram e preserve atividade neuroquímica ea conectividade das sinapses. O uso de fatias do cérebro para a pesquisa básica, e em empreendimentos farmacêuticos, concomitantemente tem aumentado com o número de possíveis manipulações biotecnológicas para medir e monitorar os comportamentos neurobiológicos do cérebro em um in vivo como contexto 3,5-7. As grandes vantagens para a utilização de sistemas de ensaio baseados em organotípicas de fatias é que ele proporciona um controlo fácil e experimental permite manipulações precisas de ambientes extracelulares. Proveitosamente, sistemas de cultura organotípica fatia foram estabelecidas a partir de uma variedade de regiões cerebrais, tais como, mas não limitado a, o córtex, medula espinhal e cerebelo de 8-10. Além disso, tem sido demonstrado uma série de co-culturas, o que permite a avaliação da comunicação intercelular entre as regiões cerebrais distais, bem como entre os neurônios e células patológicas 11,12. Muitos protocolos já foram estabelecidos para successfully fatias cultura organotypic e pode manter a viabilidade a longo prazo e muitos estudos recentes agora utilizar os métodos de interface membrana e diversas modificações para ele 13. Este princípio mantém as fatias organotípicas na interface entre o meio e uma atmosfera humidificada da incubadora, colocando as fatias em um filtro de membrana porosa. O meio pode, assim, proporcionar nutrientes suficientes para alimentar as fatias organotípicas através movimento capilar. Normalmente fatias foram preparados a partir de animais pós-natal precoce (3-9 dias de idade; P3 - 9). No entanto, a partir de tecidos cerebrais essas fatias apresentam um elevado grau de plasticidade celular e tem uma resistência inerente às solicitações mecânicas, o que é útil para obter culturas viáveis, ainda sinapses maduras e circuitos neuroanatômico não totalmente desenvolvido in vivo, até 2 a 3 semanas de idade 14. Por exemplo, observações anteriores tinham demonstrado que os obtidos a partir de fatias de hipocampo P0 - 1 neonatos, embora altamente VIABle seguinte preparação, foi perdendo algumas características morfológicas. Essencialmente, eles mostraram-se inadequadas para as culturas de longo prazo, sugerindo células imaturas eram mais propensos a de-diferenciada em comparação com culturas organotypic de animais mais velhos 15,16. Por esta razão, o nosso método foi otimizado para fatias de cérebro organotypic adultos em que a maturação e desenvolvimento arquitetônico tenham atingido os seus estágios terminais 13,17-21. No entanto, este método também é adequado para recém-nascidos e fatias organotípicas juvenis. Uma vez que as fatias organotípicas viáveis ​​foram produzidos toda a placa contendo as fatias pode ser trazido para a montagem biolística e submetidos a entrega regiosselectiva e transfecção. A montagem adequada da pistola de genes (tal como descrito na Figura 1), orientado a 90 °, a uma distância de 10 milímetros directamente sobre as fatias (a partir da abertura para o tecido), permite o fornecimento biolístico rápida dos 40 nm irld cargas de partículas revestidas. Estas cargas, tais como corantes fluorescentes e vectores de ADN, bem como qualquer gene de interesse, são facilmente entregue nas fatias viáveis ​​com facilidade. Este método, portanto, descreve o protocolo necessário para fornecer, de uma maneira regio-selectiva, carga nanopartículas de ouro revestido em fatias de cérebro organotípicas viáveis. O cano da arma gene e montagem ideal pode ser visto na Figura 1. Para mais informações sobre o barril e nanopartículas melhorou balística, consulte O&#39;Brien, et al. 17. Refinamentos subsequentes também são indicados para o utilizador para optimizar as condições, tais como a quantidade adequada de ouro entregue por área alvo, como definido microtransportador quantidade de carregamento (MLQ), e para determinar a quantidade de ADN carregado por mg de ouro, definido como ADN Carregando Proporção (DLR). Antes de precipitar DNA em partículas de ouro e colocá-los na tubulação Tefzel que compreende os cartuchos da arma gene real &#39;9 ;, é necessário para calcular a quantidade de ADN e de ouro necessária para cada transfecção, que podem diferir um pouco entre os tecidos e condições (proporção deve ser mantida entre 1 mg de ouro e 1 ug de ADN de 1: 5). É vital para preparar a proporção adequada de MLQ a DLR em contrário DNA revestido partículas de ouro poderia aderir juntos formando maior do que a aglomeração esperado, o que poderia reduzir a homogeneidade global da propagação biobalística, bem como danos aumento do tecido e citotoxicidade. Este método mostra as recentes melhorias na prestação de biobalística, que foram testados e considerados passíveis de fatias do cérebro organotypic neonatais, jovens e adultos. Além disso, através da exploração de spread reduzido biobalística do cano da arma gene, o usuário agora é capaz de transfecção seletivamente uma região pontual no cérebro. Após o tempo de incubação apropriado, a expressão das proteínas fluorescentes, que atinge os seus valores máximos entre 24 e 48h, pode ser visualizada por microscopia confocal e epifluorescência. Estes fluorophores permitir a análise morfológica e localização das células individuais dentro de estruturas biologicamente relevantes. No entanto, a modulação regiosselectiva das fatias organotípicas de outros genes heterólogos também podem ser monitorizadas por quaisquer outros testes passíveis para estas preparações. Possíveis estratégias úteis para a entrega de genes localizados são apresentados na Figura 2.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="656">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Helios gene gun system</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2431</td>
			<td>Gene gun and tube prep station</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">KCl</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S7907-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>P9791-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.2 &#181;m sterile filter unit</td>
			<td style="width:141px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>to filter media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:141px;">Gibco</td>
			<td>21885-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:141px;">Gibco</td>
			<td>10270-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N2</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>856568-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>277649-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Spermidine</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>161-3100EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Vibroslicer</td>
			<td style="width:141px;">Laica</td>
			<td style="width:119px;">VT1200</td>
			<td>We used a custom design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gene gun mount</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Built in house at U of T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Humidified cell culture incubator</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Gold nanoparticles</td>
			<td style="width:141px;">cytodiagnostics</td>
			<td style="width:119px;">G-40-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEYFP-N1</td>
			<td style="width:141px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tefzel tubing</td>
			<td style="width:141px;">Bio Rad</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Barrel</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom made by the LMB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture insert</td>
			<td style="width:141px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:141px;">Sigma</td>
			<td>76240 Fluka</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for convenience</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>user defined for usage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Glass slide</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td>2588-CA48323-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Microcover glass</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td colspan="2">2448-CA48366-067-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:141px;">Vector laboratories</td>
			<td>H-1400&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

regioselective biolistic targeting in organotypic brain slices using a modified gene gun

A transfecção de DNA tem sido inestimável para ciências biológicas e com os recentes avanços em preparações fatia do cérebro organotypic, o efeito de vários genes heterólogos poderia, assim, ser investigado facilmente, mantendo muitos aspectos da biologia in vivo. Tem havido um interesse crescente para transf neurônios terminalmente diferenciadas para que os métodos de transfecção convencionais têm sido repleta de dificuldades, como os baixos rendimentos e perdas significativas para a viabilidade. Biolistic transfecção pode contornar muitas destas dificuldades ainda apenas recentemente esta técnica foi modificada de modo que é favorável para uso em tecidos de mamíferos. Novas modificações na câmara de acelerador ter maior precisão de tiro da arma do gene e aumentou suas profundidades de penetração ao mesmo tempo, permitindo o uso de menor pressão de gás (50 psi), sem perda de eficiência de transfecção, bem como permitir a propagação regiosseletiva focalizada do paARTIGOS para dentro de 3 mm. Além disso, esta técnica é para a frente e mais rapidamente do que para realizar microinjections fastidiosos. Ambos transitória e expressão estável de nanopartículas são possíveis com bombardeamento onde expressão episómico podem ser detectados dentro de 24 horas e a sobrevivência de células mostrou-se melhor do que, ou igual a, pelo menos, os métodos convencionais. Esta técnica tem contudo uma vantagem importante: ela permite a transfecção para ser localizada dentro de um único raio retido permitindo assim que o utilizador isolar anatomicamente efeitos do gene heterólogo. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para preparar adultos viável fatias organotypic e submetê-los a regiosseletiva transfecção utilizando uma arma gene melhorado.

Viabilidade fatia organotípicas pode ser monitorizado com a actividade de lactato desidrogenase, rotulagem iodeto de propídio, e coloração dUTP como foi anteriormente relatado 13,22. Evidentemente, a viabilidade ea integridade das fatias são importantes para a expressão sustentada a longo-prazo da carga genética entregue. Após a entrega biolï¿½tica nas fatias organotípicas, a expressão do gene heterólogo fluorescente foi monitorizado por microscopia confocal. O aperto da propagação biolï¿½tica usando o barril modificado pode ser visto na Figura 3A. Figura 3B mostra uma imagem representativa da região do hipocampo transfectadas utilizando ADN nanopartículas de ouro revestido. Figura 4 mostra imagens representativas de fatias organotípicas adulto rato transfectadas. Como pode ser observado na Figura 4A, um neurónio, com um porto de Purkinje dendrítica notável encontrada na interface da camada de Purkinje e da camada molecular do cerebellum mostra rotulagem pronunciado após transfecção transitória com biolï¿½tica pEGFP-N1. Figura 4B mostra uma ampliação maior do que estes dendritos espinhas podem ser observadas. Figura 4C mostra uma célula piramidal encontrada na região CA1 do hipocampo após o fornecimento biolístico de nanopartículas de ouro revestidas pDSredFP . Corantes fluorescentes codificado em vez de cargas de DNA também pode ser usado de um modo semelhante ao visualizar as características morfológicas em fatias organotípicas. DiO, que marca as membranas de plasma, pode delinear mais rapidamente morfologias celulares individuais ou pode ser utilizado em conjunto com um biolística de ADN revestido entregues para a mesma região para confirmar a regioselection. Como pode ser visto na Figura 5A um neurónio coradas com DiO no hipocampo, também mostra longos dendritos com numerosos espinhos. Uma seta indica o axónio o qual é identificado pela presença de boutons sinápticas em comparação com o dentritic espinhas nos outros neurites. Figura 5B mostra um outro exemplo de CA1, que destaca numerosas saliências do hipocampo, com um contra-corante de DAPI para marcar o núcleo. Figura 5C mostra uma ampliação maior destes tipos de dendrites paralelas com numerosos espinhos. Evidentemente, essas imagens ilustram características morfológicas seguintes rotulagem celular. Nada impede que a mesma metodologia a ser aplicada para entrega de qualquer número de genes exógenos que revestem as nanopartículas de ouro. Para permitir a confirmação visual da transfecção bem sucedida, um único plasmídeo pode ser construída para co-expressar tanto o gene de interesse e uma proteína repórter fluorescente no mesmo vector. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig1highres.jpg" /> Figura 1 Gene cano da arma e de montagem. (A) A melhorar<html> d barril desenvolvido pelo Dr. O&#39;Brien no MRC-LMB, que tem uma distribuição restrita biolistico que minimiza os danos de tecidos, diminuindo a pressão necessária para a aceleração de partículas. (B) A vista lateral de uma pistola de genes optimizados montagem desenvolvido pelo Dr. Henderson e Dr. Andras Nagy, da Universidade de Toronto. A montagem segura a arma de genes, precisamente 90˚ perpendicular às fatias organotípicas enquanto permite ao utilizador controlar com precisão a distância de distribuição biolistica. Para condições ideais biolística a abertura barril deve ser colocado diretamente sobre a região de interesse a uma distância de 10 mm da fatias organotypic. (C) Vista traseira da arma gene montagem. A região de interesse para ser transfectada necessita de ser colocado directamente por baixo da abertura do tambor. Segmentação pode ser confirmado com corante (diolistic) ou transfecção proteína fluorescente (biobalística).ank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig2highres.jpg" /> Figura 2. preparação organotípicas fatia e direccionamento regiosselectiva. (A) Um DMEM incorporado cérebro do rato adulto pronto para corte. (B) O molde foi colada sobre a montagem com a lâmina pronta para cortar uma fatia vibroslicer. (C) regiosseletiva expressão de genes heterólogos estratégias para entrega biolï¿½tica coronais em fatias de cérebro organotípicas. Imagens preparados a partir de imagens obtidas a partir dos Atlas Cerebral Allen atlas de referência anatômica 23. O painel esquerdo mostra duas regiões diferentes do cérebro direccionadas, tal como um exemplo. Para restringir a expressão do gene (1) para a área cortical do hemisfério esquerdo. Para restringir a expressão de genes heterólogos (2) a região do hipotálamo no cérebro. Painel do meio mostra that a expressão de dois genes heterólogos (3 e 4) pode ser isolado e compara o hipocampo dos dois hemisférios na mesma fatia organotípica, eliminando essencialmente qualquer tendência de utilizar secções diferentes e / ou que assegurem a possibilidade de tratar a diafonia distal dos efeitos do esses genes. O painel direito mostra a possível sobreposição de entrega transgénico para expressar o primeiro gene (5) em uma região cortical preciso ao expressar um outro gene (6) em uma díspar ainda sobreposição área cortical. Isso permite analisar o efeito da modulação genética de cada gene heterólogo sozinho e também em combinação dentro da mesma fatia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig3highres.jpg" /> Figura 3 padrão de dispersão Biolistic visto em filter imagem de baixa ampliação e papel. (A) O tambor foi disparado melhorada sobre papel de filtro para determinar a propagação de partículas de ouro. O lado esquerdo mostra a distribuição do barril melhorada enquanto o painel da direita mostra o tambor normal. Preto bar: 1 cm. A imagem obtida a partir de O&#39;Brien et al. 17. (B) imagem baixa ampliação que mostra o padrão de transfecção estocástica dentro dos três milímetros propagação biolï¿½tica dentro da região do hipocampo de ratinhos seis semanas de idade. Branco bar.: 100 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig4highres.jpg" /> Figura 4. Biolistic entrega de proteína fluorescente de ADN codificados em fatias organotípicas de seis semanas ratos velhos. (A) inverted imagens confocais de uma fatia organotípicas fixo do cerebelo de uma célula de Purkinje pEGFP-N1 partículas de ouro revestidas transfectadas. A imagem foi tirada em 40X. Preto bar.: 30 mm (B) mostra uma ampliação de porto dendrítica de outra célula Purkinje para destacar as espinhas 60x. Preto bar.: 5 m (C) mostra uma imagem confocal de fatias fixos retirados na região do hipocampo em 60x ampliação de quatro DSredFP transfectadas células piramidais. Preto bar.: 10 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52148/52148fig5highres.jpg" /> Figura 5 Diolistic entrega de corantes fluorescentes de rotulagem membrana em fatias organotípicas. (A) mostra a imagem ao vivo de um neurónio do hipocampo labeled com DiO sob ampliação 20X. As espinhas dendríticas pode claramente ser observada, bem como o axónio como identificados pela ausência de espinhas dendríticas e a presença de boutons sinápticas indicados por uma seta branca. Branco bar: (B) coloração 30 mm pronunciada da região do hipocampo marcado com DiO e contrastado com DAPI.. Barra branca:. De 30 um (C) Maior ampliação (60x) de espinhas dendríticas encontrados na região CA1 do hipocampo. Branco bar.: 5 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52148/52148fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.

Regiosseletiva Biolistic Segmentação em Organotípicas fatias do cérebro do Usando um Modificado Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

regioselective-biolistic-targeting-organotypic-brain-slices-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K visualizações.  University of Toronto. Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices. 

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Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Neurociência

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when neural circuits are matured and refined. Misregulation at this stage may lead to neurological and psychiatric disorders such as autism 
and schizophrenia1,2. Many genes have been studied in the prenatal brain and found crucial to many developmental processes3-5. However, their 
function in the postnatal brain is largely unknown, partly because their deletion in mice often leads to lethality during neonatal development, and partly because their requirement in early development hampers the postnatal analysis. To overcome these obstacles, floxed alleles of these genes are currently being generated in mice 6. When combined with transgenic alleles that express Cre recombinase in specific cell types, conditional deletion can be achieved to study gene function in the postnatal brain. However, this method requires additional alleles and extra time (3-6 months) to generate the mice with appropriate genotypes, thereby limiting the expansion of the genetic analysis to a large scale in the mouse brain.
Here we demonstrate a complementary approach that uses virally-expressed Cre to study these floxed alleles rapidly and 
systematically in postnatal brain development. By injecting recombinant adeno-associated viruses (rAAVs)7,8 encoding Cre into the neonatal brain, 
we are able to delete the gene of interest in different regions of the brain. By controlling the viral titer and coexpressing a fluorescent 
protein marker, we can simultaneously achieve mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling. This method bypasses the requirement of 
many genes in early development, and allows us to study their cell autonomous function in many critical processes in postnatal brain development,
 including axonal and dendritic growth, branching, and tiling, as well as synapse formation and refinement. This method has been used successfully 
in our own lab (unpublished results) and others8,9, and can be extended to other viruses, such as lentivirus 9, as well as to the expression of 
shRNA or dominant active proteins 10. Furthermore, by combining this technique with electrophysiology as well as recently-developed optical 
imaging tools 11, this method provides a new strategy to study how genetic pathways influence neural circuit development and function in mice 
and rats.

An in vivo method to test gene function in postnatal brain is described. Recombinant AAVs expressing Cre and/or a fluorescent protein are injected into neonatal mouse brain. Mosaic gene inactivation and sparse neuronal labeling are achieved, allowing rapid analysis of gene function in processes critical to neural circuit development.

Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Presynaptic Dopamine Dynamics in Striatal Brain Slices with Fast-scan Cyclic Voltammetry

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and amphetamine), the role it plays in psychiatric illnesses (e.g. schizophrenia and Attention Deficit Hyperactivity Disorder), and its involvement in degenerative disorders like Parkinson's and Huntington's disease. Under normal physiological conditions, dopamine is known to regulate locomotor activity, cognition, learning, emotional affect, and neuroendocrine hormone secretion. One of the largest densities of dopamine neurons is within the striatum, which can be divided in two distinct neuroanatomical regions known as the nucleus accumbens and the caudate-putamen. The objective is to illustrate a general protocol for slice fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) within the mouse striatum. FSCV is a well-defined electrochemical technique providing the opportunity to measure dopamine release and uptake in real time in discrete brain regions. Carbon fiber microelectrodes (diameter of ~ 7 &mu;m) are used in FSCV to detect dopamine oxidation. The analytical advantage of using FSCV to detect dopamine is its enhanced temporal resolution of 100 milliseconds and spatial resolution of less than ten microns, providing complementary information to in vivo microdialysis.

Using fast-scan cyclic voltammetry to measure electrically evoked presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices.

Pré-sináptica de dopamina Dynamics em fatias de cérebro estriado com Fast-scan voltametria cíclica

Extensive research has focused on the neurotransmitter dopamine because of its importance in the mechanism of action of drugs of abuse (e.g. cocaine and ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Gravação de plasticidade sináptica em fatias Hippocampal agudas, mantidas em um pequeno volume reciclagem - perfusão- e sistema de câmara de submersão-tipo

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced tools currently used to study neurons, have only partly been taken on by oligodendrocyte researchers. Cell type-specific staining by viral transduction is a useful approach to study live organelle dynamics. This paper describes a protocol for visualizing oligodendrocyte mitochondria in organotypic brain slices by transduction with adeno-associated virus (AAV) carrying genes for mitochondrial targeted fluorescent proteins under the transcriptional control of the myelin basic protein promoter. It includes the protocol for making organotypic coronal mouse brain slices. A procedure for time-lapse imaging of mitochondria then follows. These methods can be transferred to other organelles and may be particularly useful for studying organelles in the myelin sheath. Finally, we describe a readily available technique for visualization of unstained myelin in living slices by Confocal Reflectance microscopy (CoRe). CoRe requires no extra equipment and can be useful to identify the myelin sheath during live imaging.

Myelinating oligodendrocytes promote rapid action potential propagation and neuronal survival. Described here is a protocol for oligodendrocyte-specific expression of fluorescent proteins in organotypic brain slices with subsequent time-lapse imaging. Further, a simple procedure for visualizing unstained myelin is presented.

Visualização e imagem ao vivo do Oligodendrocyte organelas em fatias Organotypic cérebro usando microscopia Confocal e vírus Adeno-associado

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...