Gostaríamos de agradecer a Mark Lucanic e Hwai-Jong Cheng para ajudar com a aquisição das imagens de baixa ampliação de fatias do hipocampo toda apresentadas neste vídeo. Gostaríamos também de agradecer a Sarah Parrish para ajudar com o texto que acompanha o vídeo.

PROTOCOLO PARA TRANSFECÇÃO biobalística Fazer balas Balas são boas para até 6 meses, mas pode começar a diminuir em termos de eficiência de transfecção após 2-3 meses. Balas devem ser armazenados a 4 ° C na presença de pellets dessecante. Sempre deixe os frascos de cintilação, em que as balas são armazenados, à temperatura ambiente antes de abrir o frasco. Antes de começar tenho pronto: <ul><li> Espermidina (0,05 M) </li><li> CaCl 2 (1M) </li><li> EtOH (100% de alta qualidade-garrafa fechada) </li><li> Autoclavado H 2 0 </li><li> DNA a ser transfectadas </li><li> Polivinilpirrolidona (PVP-20 ações mg / ml) </li><li> 2 X 15 ml cônico (2/bullet set) </li><li> Tubulação (cortado em 1 X ~ 30 polegadas conjunto bala /) </li><li> Cintilação frascos (set 1/bullet) </li><li> Pellets dessecação </li><li> Seringa de 10 ml w / tubo na extremidade </li></ul> Prepare tubulação: <ol><li> Dry ~ 30 polegadas de tubo (cerca de 2 polegadas, ultrapassam direito O-ring), na estação tubo w / N 2 de gás (0,4 de pressão) para um mínimo de 20 min. </li></ol> Precipitar DNA em contas de ouro: <ol><li> Prepare DNA a ser transfectados em 50 volumes μmL total em tubo de microcentrífuga (DNA máximo de 50 mg no total) </li><li> Pesar 6-8 mg de ouro e transferir para um tubo de microcentrífuga </li><li> Adicionar 100 mL de 0,05 M espermidina ao ouro e à sonicate por 20 segundos </li><li> Adicione o mL 50 de DNA ao ouro / espermidina </li><li> Vortex (cerca de configuração 5) w / tampa aberta </li><li> Add-drop 100 mL sábio de CaCl 2 1M </li><li> Sonicate brevemente (&lt;5 seg) </li><li> Permitir a precipitar por 10 min em temperatura ambiente </li><li> Sonicate brevemente </li></ol> Prepare a solução de PVP durante a sonicação: <ol><li> Faça solução diluída em 15 ml PVP cônica, 3,5 ml diluída PVP para cada conjunto de balas (adicionar 7,5 mL de 20mg/ml estoque PVP a 3,5 ml EtOH 100%) </li></ol> Lavagem contas de ouro com EtOH: <ol><li> Spin down contas de ouro a toda a velocidade por 10 segundos em microcentrífuga </li><li> Elimine o sobrenadante, mas manter uma pequena quantidade de líquido em cima de contas de ouro </li><li> Lavar 3X com 1ml EtOH, sonicate brevemente cada vez, se necessário </li></ol> Ressuspender ouro / DNA em solução PVP: <ol><li> Ressuspender o sedimento de ouro em 200 mL da solução diluída 3,5 ml PVP / EtOH </li><li> Vortex da pelota de ouro para voltar a suspender (brevemente sonicate se necessário) </li><li> Transferir os 200 mL de ouro / solução PVP para um novo 15 mL cônica </li><li> Continue desta maneira, adicionando 200 mL de PVP em um tempo até todo o ouro foi transferido para a 15 mL cônica, eo volume final é de 3,2 mL </li></ol> Tubo de revestimento: <ol><li> Desligue N 2 na estação tubo e remover tubos secos </li><li> Anexar tubos secos à seringa de 10 ml </li><li> Agitar vigorosamente o 15 mL cônica cheia de ouro / PVP </li><li> Coloque a extremidade do tubo em ouro / solução PVP e chupar lentamente tendo o cuidado de evitar bolhas </li><li> Deixar ~ 2 polegadas seca de ambas as extremidades do tubo </li><li> Com o tubo ainda ligado a seringa e preenchido com a solução de ouro / PVP, coloque cuidadosamente o tubo de volta na estação </li><li> Mark as extremidades do tubo onde a solução fica </li><li> Deixe o ouro se contentar com 5 min com a seringa conectada </li><li> Sugar-up a solução muito lentamente puxando a seringa de modo que o ouro resolvido é deixado para trás (não se esqueça de fazer lavagem de volta) </li><li> Separe a seringa </li><li> Rodar 90 ° e deixe descansar 2 segundo </li><li> Girar 180 ° e deixe descansar outro dois segundo </li><li> Rode o tubo por 5 segundos </li><li> Ligue o N 2, de modo que a válvula lê entre 0,4-0,5 e girar o tubo revestidas de ouro durante a secagem por 5 min. </li></ol> Corte de tubos: <ol><li> Remova a tubulação da estação prep-tubo e cortar as pontas na marca. </li><li> Colocar um frasco de cintilação rotulado sob o helicóptero para pegar tubos de cartuchos de corte </li><li> Tubulação lugar no helicóptero tubos e cortar o tubo com navalha limpa </li><li> Coloque um pellets dessecação em frasco de cintilação </li><li> Armazene os cartuchos a 4 ° C </li></ol> Tiroteio Slices Tissue Ao fotografar fatias cultivadas, é importante empregar uma técnica relativamente estéreis, a fim de evitar a contaminação. Lembre-se que ao fotografar duas construções diferentes, ambos os conjuntos de balas pode ser carregado no suporte do cartucho mesmo, mas o barril do forro e da tela deve ser alterado entre as construções. Antes de começar tenho pronto: <ul><li> Balas DNA (vamos frasco de cintilação à temperatura ambiente antes de abrir) </li><li> Fatias de tecido </li><li> Helios Gene Gun </li><li> Hélio tanque com mangueira de arma gene ligado &lt;/ Li&gt; <li> Suporte do cartucho </li><li> Forro de plástico barril com O-ring no lugar </li><li> Difusor (modificado) </li><li> Tela difusor </li><li> Fórceps </li></ul> Preparar a arma gene: <ol><li> Forceps lugar usando o ouro cartuchos de plástico revestidas no suporte do cartucho. </li><li> Coloque o suporte do cartucho na arma gene pela primeira empurrando bloqueio </li><li> Segura o suporte do cartucho com bloqueio </li><li> Obter um forro barril com um anel de vedação ea tela difusor firmemente no lugar </li><li> Parafuso do cano-liner na arma gene </li></ol> Tiroteio fatias cultivadas com a arma gene: <ol><li> Coloque em aquecedores de orelha </li><li> Ligue a arma gene em mangueira de gás hélio tanque conectado </li><li> Aumente a pressão no tanque a 180 PSI </li><li> Atire um espaço em branco no ar, a fim de remover qualquer poeira ou restos da tela difusor. Para disparar a arma, primeiro aperte o botão de bloqueio de segurança até que a arma emite um sinal sonoro, em seguida, puxe o gatilho. </li><li> Depois de atirar no vazio, retire as fatias da incubadora </li><li> Arma avançar para construir primeiro </li><li> Atire com a tela difusor cerca de 0,5 - 1 polegada da fatia </li><li> Antecedência o cartucho entre os poços. </li><li> Depois de filmar o bem último, coloque as fatias de volta para a incubadora </li><li> Desligue a pressão do gás e liberação antes de separar a arma da mangueira Hélio </li><li> Desapertar forro do cano, e remova o cartucho e as conchas utilizadas </li></ol> Limpeza titulares cartucho e forros barril: <ol><li> Cartuchos lugar, forros barril, e telas de difusor em um copo com água e sabão </li><li> Coloque um copo no sonicador banho e sonicate por 20 min </li><li> Enxaguar com água até que todos os resíduos de sabão são removidos </li><li> Mergulhe em EtOH 70% por uma hora </li><li> Coloque sobre papel toalha para secar secar durante a noite </li><li> Limpar cartuchos, forros barril, e as telas podem ser reutilizados em subseqüentes transfections biobalística </li></ol> Problemas dicas de fotografia para Transfection biobalística Transfecção biobalística às vezes pode resultar em condições de transfecção de qualidade inferior. Ela pode levar a muito poucos ou muito muitas células transfectadas, muito alta ou níveis de expressão muito baixa, ou pode causar fatias de tecido para tornar-se geralmente pouco saudável. Muitas vezes resultam fatias insalubres da explosão de pressão. Aqui estão algumas dicas para obter fatias de tecido ideal transfectadas. Se fatias parecem ser pouco saudável (ou se as células demais estão transfectadas / fatia), tente: <ul><li> distância de disparo aumentar </li><li> diminuição da pressão sobre tanque de gás </li><li> diminuindo a quantidade de ouro </li><li> cortando o centro do difusor Bio-Rad e substituindo o centro com uma tela difusor. </li></ul> Se as células transfectadas são muito poucos, tente: <ul><li> diminuindo distância de disparo </li><li> pressão crescente sobre tanque de gás </li><li> aumentar a quantidade de ouro </li><li> aumentar o número de fatias de tecido / poço </li><li> certifique-se o O-ring no barril-liner está intacta. </li></ul> Se você obter fatias com ambas as células demais e demasiado poucos transfectadas durante as filmagens mesmo certifique-se: <ul><li> que você está segurando a arma simetricamente acima bem </li><li> que o ouro é uniformemente revestimento interior da tubulação. (Se você está recebendo uma linha de ouro, extrair o sobrenadante do tubo a uma taxa mais rápida uma vez que o ouro tem estabelecido e girar o ouro mais antes de ligar o nitrogênio. Se, por outro lado, você está recebendo listras de ouro , este é provavelmente devido à exposição demasiada umidade durante a tomada de bala: certifique-se que você está usando uma garrafa fechada de EtOH, que a tubulação está completamente seco antes do revestimento, e que você nivelamento das tampas e preparar balas em tempo hábil). </li></ul> Se a eficiência de transfecção parece ótimo (# células transfectadas / fatia), mas o nível de expressão parece muito alta ou muito baixa: <ul><li> ajustar o DNA relação ao ouro. (Por exemplo, se for demasiado baixa manter a quantidade de ouro, mas aumentar a quantidade de DNA.) </li><li> ajustar a quantidade de tempo entre fotografia e coleta de dados </li></ul> No caso de transfecção dual, se você está recebendo muito pouca expressão de um de seus construtos, ajustar a relação dos dois construtos de maneira apropriada e certifique-se que ambas as construções estão sob o mesmo promotor, para se certificar de que um promotor não vai competir fora do outro.

<ol>
	<li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles.">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li><li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun.">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li><li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biolistic+transfection+of+neurons.">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Transfecção biobalística é um meio físico de transfecting células via bombardeamento de tecido vivo com alta velocidade de DNA revestido partículas de ouro. Em partículas transferência de genes mediada, em geral células transfectadas resultado quando a bala vem para descansar no núcleo. Embora muitos métodos de transfecção diferentes existem, como microinjeção, lipofílico de fosfato de cálcio-transfecção eletroporação, transfecção e viral, transfecção biobalística pode oferecer um trabalho menos intensivo, e alternativa eficiente para transfecting células que não são facilmente transfectadas com estes outros métodos. Na verdade, ele foi desenvolvido inicialmente como uma técnica para transferência de genes em plantas, pois a presença da parede celular feita através de métodos de transfecção difícil preexistentes 1. Da mesma forma, Biolistics ganhou popularidade no campo da neurobiologia já pós-mitóticas neurônios são notoriamente difíceis de transfecção 2,3. Em particular, é amplamente reconhecido como a técnica de princípio para ser usado em experimentos que visam avaliar a morfologia multa de neurônios individuais em fatias de cérebro intacto. Os métodos descritos aqui apresentar uma explicação detalhada e abrangente de como executar transfecção biobalística de fatias de cérebro de cultura usando um gene de mão-gun (o Helios sistema Gene Gun; Bio-Rad). Transfecção biobalística tem se tornado o método preferido para transfecting neurônios em cultura fatia, pois permite que a transfecção de um número escasso de células em todo o fatia do cérebro. Desta forma, os neurônios individuais podem ser examinados de forma isolada. Uma vez que esta técnica é particularmente adequada para transfecting neurônios no cérebro fatia, é muitas vezes usado em conjunto com dois fótons de microscopia, uma vez que a visualização 2-fóton de excitação das células permite fluorescente etiquetado profunda no tecido de espalhamento de luz 4. Na verdade as imagens de alta ampliação único neurônios piramidais apresentados ao longo deste video foram capturados usando um microscópio a laser personalizado construído dois fótons de digitalização. Em conclusão transfecção biobalística é um meio eficiente de transfecting células individuais dentro do contexto de uma alta densidade de células vizinhas, e como tal tem se mostrado extremamente útil para fluorescente rotulagem neurônios individuais na cultura fatia neuronal.

Embora tenhamos listados todos os produtos separadamente, é mais econômico para compra &quot;Helios Gene Gun-System&quot;, que inclui com todos os produtos da Bio-Rad listados acima (cat # 165-2431).

preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture

Transfecção biobalística é um meio físico de transfecting células bombardeando tecido com partículas de alta velocidade DNA revestido. Nós fornecemos um protocolo detalhado para transfecção biobalística de rato fatias do hipocampo, desde a preparação inicial de balas revestidas de DNA para o tiroteio final das culturas fatia organotípicas usando uma arma gene. Transfecção arma gene é um meio eficiente e fácil de transfecting neurônios e é especialmente útil para fluorescente rotulagem um pequeno subconjunto de células na fatia do tecido. Neste vídeo, primeiro esboço dos passos necessários para revestir as partículas de ouro com DNA. A seguir, demonstram como a linha de dentro do tubo de plástico com as balas de ouro / DNA, e como cortar essa tubulação para obter os cartuchos de plástico para carregar na arma gene. Finalmente, realizamos biobalística transfecção de culturas hipocampais de ratos fatia, demonstrando manipulação da Bio-Rad Helios arma gene, e oferecendo conselhos de resolução de problemas para obter fatias de tecido saudável e ideal transfectadas.

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Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Nós descrevemos um método para preparar balas DNA revestido de ouro e demonstrar o uso de balas tais biolistically transfectar neurônios em cultura de fatias do hipocampo.

Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

preparation-gene-gun-bullets-biolistic-transfection-neurons-slice

Research

JoVE Journal

Biology

52.2K visualizações.  University of California, Davis. Nós descrevemos um método para preparar balas DNA revestido de ouro e demonstrar o uso de balas tais biolistically transfectar neurônios em cultura de fatias do hipocampo.

Vídeo: Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

Preparação Slice horizontal da Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Biologia

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection de neurônios do hipocampo

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Preparação e manutenção dos neurônios da raiz dorsal Gânglios em culturas Compartmented

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.