T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.

1. Gene Segmentação projeto <ol style="margin-left: 40px;"><li> Encomendar um clone BAC adequado que cobre a região genômica de interesse. Certifique-se de que este é isogênico com o tipo de células ES de ser modificado por exemplo, clones RPCI-23 e RPCI-24 BAC para gene alvo com C57BL / 6 ES células. </li><li> Aplicar gene convencional critérios de segmentação ao projetar o vetor de direcionamento. Parâmetros-chave incluem se a modificação é necessária para ser constitutiva ou condicional, definindo exons críticos (CE) para eliminação de uma estratégia gene nocaute e espaçamento e colocação de cassetes intrónicas. NOTA: Cada uma delas tem sido discutida em detalhe em outro lugar 10. </li><li> Escolha regiões genómicas cada 5-6 kb de flanqueamento do local de modificação alvo. NOTA: O tamanho da inserção é, portanto, tipicamente subclonado 10-12 kb, embora o limite superior possa ser tão alta como 80 kb com uma cópia do plasmídeo de subclonagem baixo como p15A, pBR322, etc., e até 200 kb, com um BACvetor. </li></ol> 2. Multiplex recombineering Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oligos do projeto para a espinha dorsal plasmídeo (subcloning plasmídeo) e o marcador de selecção (cassete de inserção). Conceber cada oligo de tal modo que ele contém 180 pb HA flanqueando o local alvo genómico e 20 pb da sequência de iniciação específica da cassete de inserção ou o plasmídeo de subclonagem (Figura 2). NOTA: os braços de homologia não deve conter elementos repetitivos, presença de elementos repetitivos resultará em direcionamento incorreto e subclonagem. Elementos repetitivos pode ser detectada por meio de ferramentas baseadas na web, como o &#39;&#39; Repita Masker &#39;&#39;. </li><li> Incluir um local único da enzima de restrição (RE) em um dos oligos de vectores para linearizar o vector de abordagem selectiva de genes para células ES alvo (Figura 2). </li><li> Verifique os parâmetros oligo usando um programa analisador de oligo. Tome cuidado para evitar estruturas secundárias na região primings. </li><li> Shorter HA (50 pb) da cassete de inserção é tolerado e produz menor número de recombinantes, mas garantir que o plasmídeo subcloning HA é sempre mais longo (180 pb). </li><li> Determinar a orientação da inserção de ADN genómico do clone de BAC em particular usando ferramentas com base na web, como &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Estabelecer a direcção de replicação de oris, verificando o mapa do esqueleto de plasmídeo BAC usado na construção da biblioteca BAC. NOTA: oris é geralmente oposta à direcção de transcrição do marcador de cloranfenicol (Chl) para todos os plasmídeos de TAS vulgarmente utilizados. </li><li> Adicionar duas fosforotioato (PTO) ligações terminais com a extremidade 5 &#39;do oligonucleótido que é oposta à direcção de replicação no clone de BAC. Adicionar uma modificação 5 &#39;fosfato para o oligo inverso (Figura 2). NOTA: A cassete PCR phosphorothioated assimétrica sobre a digestão Red gera um ssDNA intermediário que pode iniciar a cadeia atrasadado garfo de replicação. NOTA: Maximal freqüência de recombinação multiplex é observado com as cassetes protegidas cadeia atrasada. Costa principal protegido ou cassetes protegidas dupla pode não produzir a eficiência de recombinação equivalentes em algum loci. </li><li> Encomende oligos com PAGE ou purificação HPLC. </li></ol> 3. BAC Transformation Clone com pSC101 BADgbaA recombineering plasmídeo. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para fazer com que a E. estirpe de E. coli que carrega o recombineering BAC proficiente, transformá-lo com o plasmídeo pSC101 BADgbaA contendo os genes vermelhas 16. NOTA: O plasmídeo pSC101 BADgbaA contém os genes vermelhos e RecA sob o controlo do promotor araC de P-arabinose BAD indutivel, um marcador de selecção de tetraciclina e o replicão pSC101 sensível à temperatura. <ol><li> Esfaquear uma ponteira estéril na cultura agar BAC e inocular 5,0 ml de caldo lysogeny (LB) pH 8,0 contendo 12,556; g ml -1 Chl. Crescer a 37 ° C durante 5 horas com agitação a 200 rpm. </li><li> Relaxar 10% (v / v) de glicerol, tubos de microcentrífuga e cuvetes de electroporação em gelo. Arrefece-se uma grande centrifugadora de microcentrífuga e refrigerado a 4 ° C. </li><li> Determinar a densidade óptica (OD) da cultura utilizando um espectrofotómetro e medir a absorvância a 600 nm. Preparar células electrocompetentes (como descrito abaixo) quando uma leitura de DO 600 de 0,3 a 0,8 é alcançado. </li><li> Girar as células num tubo de centrífuga de 50 ml em uma grande centrifugadora a 1216 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células com 1 ml de glicerol a 10% gelada e girar para baixo em células 17.949 xg durante 20 seg a 4 ° C. Realizar a lavagem passo de um total de 3 vezes. </li><li> Ressuspender as células num volume total de 50 ul de glicerol a 10% e adicionar 10-200 ng do plasmídeo pSC101 recombineering BADgbaA. Obter uma suspensão de células individuais pipetandopara cima e para baixo várias vezes e, em seguida, transferir as células para uma pré-refrigerada um milímetro lacuna cuvete de electroporação. </li><li> Electroporate as células com uma configuração de 1,8 kV, 25 mF e 200 Ω. Nota: Verifique as configurações corretas para cada marca de electroporator. Uma constante de tempo de electroporação menos do que 4 indica a presença de sal e outras impurezas. </li><li> Imediatamente recuperar as células em 1 ml de LB e transferência das células para um tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Crescer a cultura BAC gbaA a 30 ° C durante 2 horas com agitação a 200 rpm. NOTA: O plasmídeo pSC101 BADgbaA é perdido quando as células são cultivadas a 37 ° C, devido à inactivação do factor de replicação sensível à temperatura repe. Cultivar células gbaA a 30 ° C, para manter as funções recombineering. </li><li> Adicionar 9 ml de LB contendo 12,5 ng ml -1 de Chl e 4 ug mL1 de tetraciclina (Tet) para a cultura de BAC gbaA recuperado. Cresça aBAC gbaA cultura O / N em 30 &#160; ° C com agitação a 200 rpm. NOTA: A eficiência de transformação do plasmídeo electroporating gbaA super-enrolado é suficientemente alta para permitir o crescimento saturação de O / N em meios líquidos. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de Inserção Cassetes e Subclonagem Plasmids <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para incorporar AH à inserção da cassete (s) e o plasmídeo de subclonagem, realizar a reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os oligos longo modificados tal como descrito abaixo. <ol><li> Opcional: para evitar plasmídeo transição na reacção recombineering, usar uma origem R6K ou molde estreito plasmídeo gama de hospedeiros semelhante para amplificar a cassete de inserção. </li><li> Alternativamente, linearizar o plasmídeo molde utilizando uma digest RE (Tabela 2). Escolha um RE que corta fora da região de amplificação da PCR e é inativada calor. Calor inactivar o RE, como recomendado pelo manufacturer. </li><li> Defina-se reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando um sistema de DNA polimerase de alta fidelidade HotStart. Prepara-se uma mistura principal de PCR como descrito (Tabela 3). Realizar o ciclo térmico, como mostrado (Tabela 3). </li></ol></li><li> Analisar os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose. Carga de 1-5 uL de cada PCR sobre um 1% (w / v) de gel de agarose contendo 0,5 mg mL-1 de brometo de etídio (EtBr). NOTA: A presença de produtos de amplificação não-específicos não interfere na reação recombineering. Em alguns casos, no entanto, dimeros de iniciadores pode diminuir a eficiência recombineering. </li><li> Purifica-se os produtos de PCR utilizando um kit de purificação de PCR. <ol><li> Opcional: remover o plasmídeo molde de PCR por tratamento com Dpnl seguido por PCR clean-up. Eluir ADN num volume mínimo de água desionizada estéril (como recomendado pelo fabricante). NOTA: A adição de DpnI para não purificados de PCR reações resulta em redução da eficiência de clivagem de the modelo do DNA de plasmídeo desnaturado. </li></ol></li><li> Quantificar por PCR de ADN amplificado por análise em gel de agarose de encontro a um conjunto de padrões de ADN conhecidos por exemplo, λ HindIII digest ou usando um espectrofotómetro NanoDrop. </li></ol> 5. Além disso Subclonagem Inserção <ol style="margin-left: 40px;"><li> Dilui-se a S / N BAC gbaA cultura de 50 vezes por adição de 200 ul em 10 ml de LB + + Chl Tet. Crescer em 30 &#160; ° C com agitação a 200 rpm durante 1 h 50 min. Incluir uma amostra a ser utilizada como controlo negativo. </li><li> Relaxar todos os materiais e equipamentos recombineering a 4 ° C, conforme descrito no passo 3.1.2. </li><li> Pour LB agar pH 8 placas contendo a concentração correcta de o antibiótico selectivo apropriado (s), que irá permitir a selecção do fragmento de ADN que é inserida, assim como para a selecção do vector de subclonagem (Tabela 4). NOTA: Alguns antibióticos são sensíveis ao pH. Use LBágar pH 8 como uma regra. </li><li> Prepara-se uma solução a 10% de L-arabinose (v w /). Filtre através de esterilizar um filtro de seringa de 0,2 um. NOTA: A arabinose induz a expressão de proteínas a partir do plasmídeo recombineering gbaA. </li><li> Verifique o OD da cultura BAC gbaA usando um espectrofotômetro. Uma vez que um OD 600 de 0,25-0,3 é atingido, induzir as proteínas recombineering como descrito no passo seguinte. </li><li> Adicionar 200 ul da solução de arabinose a 10% até 10 ml de cultura de BAC para atingir uma concentração final de arabinose de 0,2%. Incluir uma cultura não induzida (sem arabinose) a ser utilizada como controlo negativo. </li><li> Transferir a cultura para um BAC 37 &#160; ° C incubadora de agitação e induzir a expressão vermelho por 45 min com agitação a 230 rpm. NOTA: Expressão de proteínas vermelhos é ineficiente a 30 ° C. </li><li> Girar as células e lava-se com 10% de glicerol, 3 vezes, conforme descrito no passo 3.1.5. </li><li> Adicionar 600-1,000 ng de cada um do plasmídeo de subclonagem e a cassete (s) de inserção para a reacção recombineering. Incluir um vector apenas e vector além de controles individuais de inserção para verificar a proficiência recombinação e integridade do vector e as cassetes. </li><li> Obter uma suspensão de células individuais por pipetagem cima e para baixo. Realizar a electroporação tal como descrito no passo 3.1.7 e recuperação subsequente em 1 ml de LB a 37 ° C durante 1 h para os plasmídeos de multi-cópias ou em 10 ml de LB a 37 ° C durante 3 h para os vectores BAC. </li><li> Placa de diferentes diluições da cultura recuperado por exemplo, 90%, 10%, 1%, nas placas de agar de selecção dupla e crescer a 37 &#160; ° C durante 16 horas. </li></ol> 6. Análise de recombinantes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Opcional: Escolha de 6 a 12 colônias e realizar colônia PCR utilizando um iniciador de flanqueamento HA e um primer específico de inserção. Inclua o plasmídeo subcloning eo cas inserçãoSette plasmídeo assim como o clone de BAC-mãe como controlos negativos. <ol><li> Realizar análise em gel de agarose das PCRs colônia. Identificar os clones positivos pela presença de uma banda brilhante com o tamanho esperado. NOTA: A elevada eficiência do processo de clonagem recombinantes SPI gera principalmente correctas. </li></ol></li><li> Escolha colónias em 5 ml de LB pH 8 contendo o antibiótico selectivo e crescer O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar mini-preparações de ADN utilizando um kit de purificação de coluna de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Prepare BAC ADN miniprep usando isolamento de fenol-clorofórmio padrão ou um protocolo semelhante. </li><li> Execute digere RE no DNA miniprep. DNA separado por eletroforese em gel de agarose. Analisar os padrões de ER para identificar os clones contendo os tamanhos de fragmentos esperados do vector direcionamento correto. Escolha um RE claramente que discrimina entre o vector sem inserto (s) e o vector contendo o inserto (s). </li><li> Optional: a obtenção de células que são desprovidas do BAC, que ainda está presente na E. coli após recombineering, usar o plasmídeo miniprep de ADN para transformar DH5alpha ou DH10B E. células de E. coli. </li><li> Execute sequenciamento de DNA em todo o HA e cassete de inserção para verificar erros de síntese oligo. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+identification+of+the+mouse+circadian+Clock+gene+by+transgenic+BAC+rescue.">Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue.</a> Cell. 89, 655-667 (1997).</li><li>Rostovskaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+human+ES+cells.">Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells.</a> Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).</li><li>Giraldo, P., Montoliu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+matters:+use+of+YACs,+BACs+and+PACs+in+transgenic+animals.">Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals.</a> Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).</li><li>Hill, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+trimming:+minimizing+clone+overlaps.">BAC trimming: minimizing clone overlaps.</a> Genomics. 64, 111-113 (2000).</li><li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection.">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li></ol>

T.R.R is the inventor of a British patent application on multiplex recombineering technology.

Construção de linhas de células ES e modelos de mouse tem historicamente envolvidos gene alvo usando construções de plasmídeos que continham o alelo 4 modificado. No entanto, a construção destes vectores de direccionamento de genes complexos provou ser um gargalo significativo na produção tempo de tais modelos. O desenvolvimento de estratégias de construção vector recombineering baseado permitiu melhores desenhos vetoriais e montagem do vetor mais eficiente. No entanto, os protocolos recombineering atuais ainda envolvem várias etapas, exigem intermediário de purificação de plasmídeos e usar diferentes estirpes bacterianas. A sub-clonagem de inserção mais oferece uma nova abordagem para a construção do vector que pode ser realizada em um evento de electroporação na estirpe hospedeira BAC residente. O utilitário de SPI em segmentação gene foi aqui testado numa variedade de aplicações de construção de vector. Em todos os casos aqui examinados, SPI mostrou-se eficiente e o plasmídeo recombinante correta foi produzido.Na maioria dos casos, as múltiplas cassetes diferentes foram correctamente inserido no vector de direccionamento. Grandes cassetes de ADN e vectores foram facilmente acomodados no protocolo SPI e demonstrou a flexibilidade do presente sistema. SPI baseia-se na utilização de sequências longas de homologia e fosforotioato (PTO) protecção das cassetes de ADN linear. Modificação PTO confere protecção contra exonucleases para o ADN linear e a longo 20,21 HA aumenta a eficiência de recombinação para permitir a multiplexação. No entanto, a síntese de sequências oligo mais longos aumenta as possibilidades de acumulação de erros especialmente deleções. Mutações no oligo pode ser particularmente prejudicial se eles cobrem regiões de proteína codificação. Sequenciamento de DNA em todo o HA e cobrindo todo o comprimento da fita inserida é altamente recomendável para eliminar clones com quaisquer alterações de sequência. Uso de um sistema de polimerase de ADN de alta fidelidade também é sugerido para evitar a introdução de umy erros de PCR. O comprimento e composição do HA do plasmídeo de subclonagem é mais crítico em relação à inserção da cassete (dados não mostrados). Para aplicações particularmente sensíveis, tais como a construção de vectores knockin, onde quaisquer mutações em regiões de exão não são tolerados, o HA da cassete de inserção pode ser reduzido (pb 50-120) para evitar problemas associados com os oligos longos. A cassete de inserção também pode ser não modificado ou deixado phosphorothioated dupla (onde o conhecimento do sentido de replicação não está disponível). Mas multiplexing, nestes casos, ainda requer longo protegido HA plasmídeos subclonagem. Uma advertência desta estratégia particular é a diminuição da eficiência de multiplexação que podem potencialmente impactar SPI clonagem em loci diferentes. O comprimento da inserção da cassete e do plasmídeo de subclonagem é um outro parâmetro importante na SPI clonagem. Moléculas de ADN maiores electroporate menos eficientemente e o efeito cumulativo é, dado o reexi- para introduzir todos os alimentadores na mesma célula (resultados não apresentados). Multiplexing é mais eficiente com cassetes de inserção menores. DNA fragmentos maiores que 3 kb também colocar um limite no processamento ssDNA Red mediada, que é mais eficiente até 3 kb 30. Cassetes de inserção superiores a 3 kb são dual ressecada e recombinar com menos eficiência através de um beta via independente 20. Portanto, a seleção de colônias suficientes para identificar o clone correto torna-se importante nestes casos. A longa duração da recombinação pós eletroporação também aumenta as chances de recuperação do clone correto em exercícios SPI difíceis. Até quatro pequenas cassetes (&lt;1,5 kb) podem ser inseridos simultaneamente com o processo de SPI, embora a eficiência de multiplexação diminui com cada cassete adicional (dados não mostrados). No entanto, isso reflete o resultado de um experimento SPI óptima e é aconselhável a considerar os limites de multiplexação ao usar muitas grandes cassetes. </p&gt; O desenvolvimento de ferramentas de edição de genoma como cluster repete palindrômicas curtas regularmente intercaladas (CRISPR) sistema endonuclease -cas9 permitiu a criação de novas modificações do genoma e tem levado a mais eficiente engenharia genoma 36. No entanto, essas tecnologias novas complementaram vectores de genes alvo em vez de suplantado eles. Prevê-se que o sistema CRISPR-cas poderia substituir seleção antibiótico e aperfeiçoar o protocolo recombineering multiplex.

O desenvolvimento de tecnologias de segmentação de genes permitiu a construção de linhas de células e modelos de ratos para investigar diferentes sistemas biológicos 1-3. A primeira etapa chave na modificação de uma sequência genômica é a concepção e construção de um gene alvo vetor 4. Vectores de recombinação são as construções de plasmídeos que transportam o alelo de interesse contendo as modificações (s) desejados flanqueadas por um marcador de selecção (por exemplo, neomicina), e regiões genómicas longos necessários para recombinação homóloga eficiente em células de mamíferos 5. Modificação gene preciso que é conseguido através da introdução do vector de direccionamento para estaminais embrionárias (ES) 6 células ou células somáticas 7, em que a recombinação homóloga entre extensões idênticas de sequência de ADN no vector de abordagem selectiva e o locus genómico resultados na transferência da modificação pretendida para a conversão do gene por genoma 8. Tal modified células ES podem ser injectados em blastocistos de ratinho para produzir prole (quimeras) que pode, em seguida, transmitir estes alelos modificados através da linha germinativa 9. Uma via alternativa para produzir ratinhos transgénicos envolve a microinjecção de um vector de expressão de genes individuais em zigotos de ratinho unicelulares, o que leva a uma integração aleatória do vector no genoma do rato 10. Os métodos tradicionais de construção do vector ter invocado convencional &quot;corta e cola&quot; clonagem usando enzimas de restrição e ligases de ADN a clonar o marcador de selecção diferente e fragmentos genómicos em uma estrutura do vector. No entanto, um factor de limitação inerente de clonagem tradicional é o posicionamento e escolha de sítios de restrição, especialmente com sequências de DNA mais longos. Isso muitas vezes requer várias etapas de subclonagem e também apresenta sequências de DNA estranhos no vector, o que muitas vezes leva a uma menor eficiência do gene alvo. Recombineering (eng recombinagênicoineering) é uma tecnologia de engenharia de ADN que ultrapassa estas limitações através da utilização de recombinação homóloga (HR) mediada por proteínas de recombinação do fago em E. coli 11,12. Uma vez que qualquer região de uma sequência homóloga pode servir como um substrato de recombineering, as restrições sobre disponibilidade de locais de restrição são removidos. Grandes sequências de DNA podem ser facilmente modificados diretamente in vivo, assim também preservar a sua integridade estrutural 13. Recombineering é muito eficiente com homologias curtas (50 pb) 14 e, portanto, braços de homologia (HA) pode ser convenientemente incorporados em sequências oligo sintéticos. Em um experimento recombineering típico, um oligo ou um DNA de cadeia (dsDNA) fragmento duplo contendo HA é electroporados em recombineering E. competente células de E. coli contendo o alvo localizados no cromossoma ou num plasmídeo de 15. O potencial de recombinação é conferido pela expressão induzida do rec Redombination proteínas do fago 16,17 ou as proteínas de RecET do profago 18 rac. A exonuclease Vermelho / RecE converte dsDNA linear a um ADN de cadeia simples (ssDNA) intermediária, que é então ligado pelo seu parceiro, Vermelho / RecT, uma proteína de cadeia simples de recozimento (SSAP) 19. O emparelhamento de um longo ssDNA ou a uma curta oligo com a sua sequência complementar alvo ocorre na costa de retardamento do garfo de replicação e conduz à incorporação da sequência no local alvo. Retardamento ADNcs recombinação é a base da alta eficiência de recombineering e pode ser descrita pela &quot;beta&quot; modelo recombinação 20,21. Um fluxo de trabalho recombineering típico para construir um vector de abordagem selectiva de genes envolve qualquer uma das duas seguintes vias. Uma via envolve a subclonagem da região genómica desejado a partir de um clone de BAC de rato dentro de um plasmídeo seguido pela inserção sequencial dos locais de recombinação LoxP, um marcador de selecção <saté&gt;, 22, etc., ou a rota alternativa envolve segmentação do local genómico BAC com os diferentes elementos do vetor segmentação por várias rodadas de recombineering 10,23 e, em seguida subclonando o locus modificado em um plasmídeo por reparação gap clonagem 24,25. Variações sobre o tema têm sido usados ​​em diferentes condutas de alto rendimento recombineering como parte de programas de produção em grande rato 26,27. No entanto, esses procedimentos envolvem etapas demoradas e complicadas, requerem o uso de vectores especializados e E. coli estirpes (por exemplo, as células que expressam Cre) e utilizar um ou mais passos intermédios de purificação de ADN de vector e re-transformação (Tabela 1). A sub-clonagem de inserção de adição (SPI) é uma técnica recombineering romance que combina beta recombinação e reparação da clonagem num único processo (Figura 1). Montagem vector SPI é simples, rápida e flexível e oferece uma melhoria significativa em recombi padrãonharia abordagens (Tabela 1). Aqui, vamos demonstrar a facilidade e utilidade de usar SPI para diferentes aplicações de construção vector com especial destaque para a construção de projetos de vetores não-padrão e desafiadoras. Os casos de teste incluiu a construção de um vector repórter batendo fluorescente, uma expressão da proteína marcada batendo vector dupla, um vector BAC fluorescente repórter e um vector de knockout condicional. Estes examinados variadamente o requisito de localizar um receptor da superfície da célula, purificar um complexo proteína nuclear ou condicionalmente ablação a expressão de um gene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:941px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:315px;">Antibiotics except Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">Ampicillin, A9518-5G; 
			Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; 
			Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Zeocin</td>
			<td style="width:127px;">Invivogen:&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ant-zn-1</td>
			<td>Zeocin is also available from Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">C57BL/6 BAC clones</td>
			<td style="width:127px;">CHORI: https://bacpac.chori.org/&#160;</td>
			<td style="width:216px;">RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries</td>
			<td>129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">KOD hotstart DNA polymerase system</td>
			<td style="width:127px;">Millipore: https://www.merckmillipore.com</td>
			<td style="width:216px;">71086-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:315px;">L-Arabinose</td>
			<td style="width:127px;">Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:216px;">A3256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="189">
			<td height="189" style="height:189px;width:315px;">Long oligos</td>
			<td style="width:127px;">IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com</td>
			<td style="width:216px;">IDT Ultramers or Gene Link long oligos</td>
			<td>PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">MinElute PCR purification kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">28004</td>
			<td>Minimum elution PCR purifications kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">QIAPrep Spin Mini Prep kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen: http://www.qiagen.com&#160;</td>
			<td align="right" style="width:216px;">27104</td>
			<td>Silica column or similar matrix kits are preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:315px;">Restriction enzymes</td>
			<td style="width:127px;">NEB: https://www.neb.com</td>
			<td style="width:216px;">DpnI: R0176L</td>
			<td>See NEB website for a list of RE.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcloning plus insertion (spi) - a novel recombineering method for the rapid construction of gene targeting vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

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Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

16.3K visualizações.  University of Leicester. Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologia

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering Construções recombinação homóloga em<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

A rápida, Método Scalable para o isolamento, estudo funcional, e Análise de matriz extracelular derivado de celular

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...