Este protocolo usa o CRISPR-Cas9 para criar linhas de knock-out ou knock-in. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples e eficiente de seguir especialmente para pesquisadores iniciantes. Para a passagem celular, trate células cultivadas durante a noite com dois mililitros de 0,25% de trippsina EDTA por placa a 37 graus Celsius por dois minutos.
Quando as células tiverem levantado do fundo da placa, neutralizar a reação enzimática com dois mililitros de cultura celular média, e transferir a suspensão celular para um tubo cônico. Colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em cinco mililitros de meio de cultura celular fresca para contar. Em seguida, semente 1,8 vezes 10 para as quintas células em um poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços para cultura noturna a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono.
Para transfecção das células, adicione um volume apropriado de mistura de transfecção contendo a concentração adequada de plasmídeo CRISPR ao volume apropriado de reagente de transfecção, de acordo com o design experimental e as instruções do fabricante. Depois de incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente pelo período recomendado, adicione a solução às células de forma em gota. Em seguida, gire suavemente a placa para misturar e coloque a placa em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
No final da transfecção, adicione 150 microliters de trypsin-EDTA para dissociar as células como apenas demonstrado e coletar as células separadas por centrifugação. Resuspenque a pelota em soro bovino fetal de 2% em PBS e filtre as células através de um filtro de malha de 30 micrômetros em uma triagem celular ativada por fluorescência de cinco milímetros, ou tubo FACS. Em seguida, use as células não transfectidas para definir um portão de controle negativo no citômetro de fluxo e classificar as células transfeccionadas de acordo com o marcador fluorescente no plasmídeo CRISPR usado para a transfecção em um tubo contendo 100 microliters de meio de cultura celular.
Quando todas as células transfeinadas tiverem sido coletadas, pelota as células por centrifugação em velocidade máxima e resuspense a pelota em 300 microliters de meio de cultura celular. Semente 200 microliters de células em um poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e permitem que as células se recuperem por alguns dias em uma incubadora Celsius de 37 graus. Pelota os 100 microliters restantes de células classificadas em velocidade máxima por cinco minutos e extraia o DNA genômico da pelota resultante de acordo com protocolos padrão de extração de DNA.
Em seguida, adicione 10 microliters de tampão de reação em cadeia de polimerase, um microlitr de mistura de desoxynucleotídeo, 2,5 microliters de primer reverso definido pelo usuário, 0,5 microliters de POLIMERASE de DNA, dois a cinco microliters do modelo de DNA genômico extraído e água dupla-destilada suficiente para trazer a reação a um volume final de 50 microliters. Execute a mistura em um cicloviário térmico e resolva a reação em um gel de 2%agarose usando tampão TAE 1X de acordo com os protocolos padrão. Use um bisturi limpo e afiado para extirpar o produto de reação da cadeia de polimerase e purificar o DNA usando um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
Meça a concentração do produto usando um espectrofotômetro a 260 nanômetros de absorvimento. Prepare uma mistura de ensaio contendo 200 nanogramas do DNA isolado, dois microliters de tampão de reação Endonuclease I T7, e água dupla destilada suficiente para levar o volume final da mistura para 19 microliters. Reanneal o produto de reação em cadeia de polimerase em um cicloviário térmico nos parâmetros indicados e misture cinco unidades de Endonuclease T7 com o produto reaalado para uma incubação de 50 minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, resolva o DNA digerido em um gel de 2,5% de agarose usando tampão 1X TAE, e imagem do gel em um sistema de imagem de gel apropriado. Abra a imagem em gel no ImageJ e desenhe uma caixa retangular ao redor da banda o mais perto possível de seu limite. Clique em Analisar e Definir Medidas, confirmando que a área, o valor médio cinza e as opções de densidade integrada são verificados.
Clique em OK e selecione Analisar e Medir. O valor médio, ou de densidade de intensidade bruta, é indicativo da intensidade da banda. Quando as células transfectadas pela cultura começam a se tornar confluentes, desvinculem-as com trippsina-EDTA, como demonstrado, e semeassem as células escassamente em um prato de cultura tecidual de 100 milímetros para permitir espaço suficiente para colônias individuais crescerem antes de devolver as células à incubadora de cultura celular.
Quando as colônias começarem a se formar, use um microscópio com uma ampliação de quatro X para escolher as colônias individuais para transferência em poços individuais de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de meio de cultura celular por poço. Tome cuidado para que sua ponta não toque nas colônias circundantes para evitar a mistura de colônias dentro de poços individuais ou escolher de uma área de crescimento de colônias esparsas. Quando todos os clones tiverem sido colhidos, coloque a placa na incubadora de cultura celular até que as culturas se tornem confluentes.
Como plasmídeos não digeridos são super-enrolados, eles tendem a correr mais rápido do que seus homólogos linearizados. Para determinar se os oligonucleotídeos foram clonados com sucesso na espinha dorsal plasmida CRISPR, a colônia PCR é realizada e os clones positivos são inoculados antes que os plasmídeos sejam extraídos e enviados para sequenciamento de Sanger. O sinal fluorescente pode ser facilmente visualizado sob um microscópio após uma entrega bem sucedida dos plasmídeos, permitindo que as células transfeinadas sejam classificadas por citometria de fluxo.
Um ensaio endonuclease T7 É realizado para verificar a eficiência do decote do DNA genômico, conforme calculado a partir das intensidades das bandas observadas em um gel de agarose. Além disso, se um experimento baseado em reparo direcionado à escoologia for projetado para incorporar um local de restrição no lócus alvo, um ensaio de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição pode ser realizado com uma enzima de restrição correspondente. Para validar ainda mais que um gene de codificação de proteínas foi inativado com sucesso, uma mancha ocidental pode ser realizada para garantir que nenhuma proteína direcionada esteja presente.
A classificação das células após a transfecção elimina as células sem plasmídeos incorporados, aumentando assim a porcentagem de células exibidas em estágios posteriores como tendo um gene knock-out ou knock-in. Com o desenvolvimento dessa técnica, agora somos capazes de produzir linhas celulares eliminatórias para estudar a função genética e linhas celulares para modelar doenças específicas para entender seu mecanismo.
