This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. Preparação da Membrana Basal Matrix e Revestimento de Plasticware <ol><li> Colocar a membrana basal estoque matriz congelada de -20 ° C em gelo e descongelar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Após o descongelamento, pipeta 2 mg alíquotas de matriz da membrana basal em tubos Eppendorf de pré-refrigerados. Armazenar estes a -20 ° C até ser necessário. </li><li> Para preparar placas revestidas com matriz da membrana basal, descongelar uma alíquota sobre o gelo até o último pedaço de gelo nas desaparece tubo eppendorf (geralmente dentro de ~ 2 horas). </li><li> Após a descongelação, adicionar matriz da membrana basal para 12 ml de frio (4 ° C) DMEM / F12 para fazer a solução de revestimento de matriz de membrana basal. </li><li> Adicionar solução de matriz da membrana basal para o recipiente de cultura apropriado. Para uma placa de 6 poços, dispensar 1 ml por poço. Agitar a placa para garantir que a solução de matriz membrana basal cobre completamente cada poço. </li><li> Parafilm selar a membrana basal revestida de matriz placa / prato, e incubar a room temperatura durante 1 hora antes da utilização. Alternativamente, placas revestidas com matriz da membrana basal store / pratos a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas de revestimento. NOTA: Adicionar DMEM adicional / F12 para a membrana basal revestida de matriz placa / recipiente para evitar a secagem. Antes de usar 4 ° C membrana basal armazenado revestido de matriz placa / prato, coloque-o em uma cabine de segurança biológica e deixe-o voltar à temperatura ambiente por pelo menos 30 min. </li><li> Aspirar matriz da membrana basal completamente antes da adição de meio e células. </li></ol> 2. Preparação de meio E8 <ol><li> Prepare E8 meio de cultura por degelo suplemento E8 durante a noite a 4 ° C. </li><li> Retirar 10 ml de E8 meio basal do estoque de 500 ml e descarte. </li><li> Pipeta todo o frasco de 10 ml de suplemento E8 diretamente em 490 ml de E8 meio basal. Do meio E8 completa não quente em um banho de água a 37 ° C, como flutuações de temperatura repetidas pode degradar a bFGF no complemédio te E8. </li><li> Use meio E8 completa dentro de 2 semanas de adição do suplemento. </li></ol> 3. O descongelamento de iPSCs <ol><li> Retire um frasco de iPSCs congelados de nitrogênio líquido e colocar no gelo seco. </li><li> Descongelar rapidamente o frasco num banho de água a 37 ° C; agite o frasco em banho-maria até que apenas um pequeno fragmento de restos de gelo. </li><li> Pulverizar o frasco com etanol 70% e transferência para uma cabine de segurança biológica. </li><li> Adicionar 1 ml da temperatura ambiente, gota a gota E8 forma directamente para o frasco. </li><li> Usando uma pipeta de 2 ml, gota a gota, transferir a suspensão de células em 9 ml de meio E8 em um tubo de 15 ml. Agitar o tubo de frequência para garantir que as células e o meio de misturar bem rapidamente. </li><li> Centrifuga-se as células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de E8 suplementado com 10 uM Y-27632. </li><li> Adicionar as células a um número apropriado de porão membranpoços e revestido matriz, e coloque em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante a noite. Recomenda-se para a chapa, pelo menos, 0,2 x 10 6 iPSC por poço de uma placa de 6 poços para permitir a recuperação rápida após a descongelação. </li></ol> 4. Manutenção e Passaging Rotina de iPSCs <ol><li> Refresque médio E8 diária. </li><li> Monitorar a morfologia e de confluência de células com um microscópio invertido. iPSCs de alta qualidade crescer em colónias planas com aréolas distintas; colónias individuais possuem uma aparência de &quot;paralelepípedos-like&quot;. </li><li> Passagem as células IPSCs quando atingem ~ 70% de confluência. </li><li> Prepara-se uma solução de EDTA passaging adicionando 0,9 g de NaCl e 500 ul de EDTA 0,5 M a 500 ml de DPBS. Misture bem para dissolver de NaCl, e filtra-se sob vácuo para esterilizar. Aquecer-se uma alíquota da solução em uma passagem em 37 ° C num banho de água, antes da passagem em. </li><li> Para passagem, aspirado de meio de cultura gasto e lave as células uma vez com um volume igual de pas quentessolução Saging. Aspirar, e pipeta de EDTA suficiente de solução para revestir as passagens em células (1 ml por poço de uma placa de 6 poços). </li><li> Coloque as células em um microscópio invertido e observar as colônias da IPSC. O aparecimento de buracos dentro de colônias e bordas elevadas devem se manifestar dentro de 2 a 5 min. </li><li> Aspirar cuidadosamente a solução EDTA passaging. </li><li> Utilizando uma pipeta de 10 ml, dispensar 4 ml de meio E8 (se usar uma placa de 6 poços), sob alta pressão directamente em cada cavidade a ser passadas. </li><li> Recolher os aglomerados IPSC, e dividida em um número adequado de poços, dependendo da razão de divisão de 1: 8 a 1:12. Não excesso de pipeta, como a desagregação de aglomerados de células resultará na viabilidade pobres. </li><li> Coloque a placa em uma incubadora, e balance a placa de volta-e-vem e lado-a-lado várias vezes para dispersar as células. </li></ol> 5. Preparação de MEFs e iPSCs para Tansfection <ol><li> 48 horas antes da transfection, iPSCs passagem em ~ 1: 6 em quatro ou mais poços de uma membrana basal revestida de matriz placa de 6 poços, de modo que será de 70% confluentes, portanto, dois dias. </li><li> No dia seguinte, descongelar DR4 MEFs em meio MEF consistindo de DMEM (alto teor de glucose) suplementado com 10% de FBS e 1x MEM-NEAA. </li><li> Placa DR4 MEFs em duas placas de 10 cm a 2 x 10 ~ 4 células / cm2 e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> No dia da transfecção, alterar forma MEF a E8 suplementado com 10 uM Y-27632 30 min antes de efectuar a transfecção em iPSCs. </li><li> Opcional: Se a análise de citometria de fluxo de iPSCs pós-transfecção é desejado, remover uma placa revestida com matriz de membrana basal a partir de 4 ° C e coloca à temperatura ambiente. </li><li> Opcional: 4 horas antes da transfecção, complementar pré-cultura iPSC transfecção com Y-27632 na concentração final de 10 uM. </li></ol> 6. delicado de células dissociação Reagente um tratamentond transfecção de iPSCs usando um sistema de electroporação <ol><li> Remoção da solução primária P3 transfecção de células a partir de 4 ° C e deixar que esta atinja a temperatura ambiente durante ~ 30 min. Adicionar todo o suplemento de 100 ul para a solução de transfecção antes da utilização. </li><li> Reagente dissociação Warm-célula suave em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Obter AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) e AAVS1-CAG-EGFP doador de -20 ° C. </li><li> Remover iPSCs da incubadora e lavar uma vez com DPBS. </li><li> Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células por poço suave, e incubar iPSCs a 37 ° C durante 5 minutos, ou até maior do que 50% das células foram dissociadas a partir do vaso de cultura. </li><li> Pipeta as células para cima e para baixo algumas vezes usando uma pipeta P1000 dissociar as células restantes a partir do vaso de cultura, e para quebrar aglomerados da IPSC. </li><li> Adicionar 2 ml de meio a cada poço E8, e pipeta cima e para baixo várias vezes, utilizando uma pipeta de 10 ml de Further desagregar aglomerados de células em células individuais NOTA: A eficiência de transfecção declina significativamente se aglomerados de células não são suficientemente desagregada. </li><li> Recolhe iPSCs em um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 100 xg durante 3 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em uma quantidade mínima de meio E8. </li><li> Contar as células utilizando um hemocitómetro, após aplicação de um corante vital, tal como 0,4% de azul de Tripano. Certifique-se de que as células são suficientemente dissociado durante a contagem (1-3 células por &quot;moita&quot;). </li><li> Dispensar 3 x 10 6 células em cada um de dois tubos de 15 mL cónico, e girar para baixo outra vez a 100 xg durante 3 min. NOTA: centrifugação a baixa velocidade reduz o estresse celular e permite fácil re-suspensão de iPSCs antes eletroporação. </li><li> Ajuste o sistema de eletroporação para o programa específico para o tipo de célula para a linha de células-tronco embrionárias humanas H9 (Programa CB-150). </li><li> Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante do cell peletes. Para uma pastilha, adicionam-se 10 ug do doador RH como amostra de controlo. Para o outro sedimento adicionar 10 ug do doador HR, juntamente com 5 ug de cada TALEN (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) como amostra experimental. </li><li> Ressuspender cada pelete de células em 100 ul de solução de transfecção de células primárias P3, e transferir para uma cuvete. </li><li> Realize a transfecção e imediatamente adicionar 500 mL de meio E8 temperatura ambiente em cada cubeta. </li><li> Transfira o iPSCs gota a gota a uma transf 10 cm prato contendo MEFs DR4 preparados no passo 5.4. </li><li> Opcional: Adicionar várias gotas de cada experiência para um poço de uma membrana basal revestida de matriz placa de 6 poços se citometria de fluxo anaylsis de eficiência de transfecção é desejado. </li><li> Repita os passos de 6,15-6,17 para terminar ambas as amostras. No dia seguinte, lavar as células duas vezes com DPBS e alternar o meio de cultura para NutriStem, que parece apoiar cultura iPSC em alimentadores melhor do que E8. </li><li> Trpicos de expressão EGFP Ansient em 48-72 horas pós-transfecção; avaliar a eficiência de transfecção quanto desejado. </li></ol> 7. A puromicina Selecção de iPSCs alvejados <ol><li> Comece a selecção de puromicina 72 h após a transfecção, quando as iPSCs alcançar 70% de confluência. </li><li> Para NCRM5 iPSCs, começam selecção puromicina a 0,5 ug / ml de puromicina (1/2 da dose completa) diluída em meio de cultura NutriStem. A concentração óptima pode variar puromicina 0,25-1 ug / MLL para algumas linhas de IPSC. </li><li> IPSCs Cultura em NutriStem + 0,5 ug / ml ï¿½puromicina durante 3 dias, refrescando o meio dia. </li><li> Após 3 dias, aumentar a concentração de puromicina a 1 ug / ml. </li><li> IPSCs Cultura nos termos de 1 mg / ml seleção ï¿½puromicina por mais 7-8 dias, ou até colônias distintas aparecem grande o suficiente para colônia de picking. </li></ol> 8. Colony Picking e Expansão das iPSCs Targeted <ol><li> Membrana basal Usematriz para revestir uma placa de 96 poços por dispensar 50 ul de solução de revestimento de matriz de membrana basal (2 mg de matriz de membrana basal diluídos em 12 ml de DMEM / F12) para cada poço. Armazenar a placa a 4 ° C durante a noite antes da utilização. </li><li> Depois de se deixar a placa revestida com matriz de membrana basal para voltar à temperatura ambiente, aspirar a matriz da membrana basal e dispensar 100 ul E8 suplementado com 10 uM Y-27632 para cada poço. </li><li> Coloque um microscópio invertido em uma cabine de segurança biológica, e pulverizar levemente com etanol 70% para esterilizar. </li><li> Retire uma pipeta de Pasteur de vidro ao longo de um bico de Bunsen para obter uma ferramenta ideal colónia-colheita que tem um pequeno &quot;gancho&quot; na ponta. Esterilizar com etanol 70%, e coloque na capa para secar. </li><li> Remova a placa contendo as colónias IPSC orientadas a partir do incubador, e colocar dentro do capuz sob o microscópio. </li><li> Escolha iPSCs traçando um círculo em torno da fronteira colônia com a ferramenta de colheita colônia.</li><li> Usar o &quot;gancho&quot; da ferramenta colónia-colheita para raspar suavemente e remover a colónia iPSC da superfície da placa. Para grandes colônias, desenhando um X com a ferramenta de colheita colônia de trimestre a colônia irá facilitar o crescimento das células após a re-regulamentação. </li><li> Uma vez que aglomerados de células são separadas e livremente flutuante, use uma pipeta p200 definido para ~ 30 ul para recolher as iPSCs. Células directamente para a placa de 96 poços de placa. </li><li> Opcional: utilizar uma pipeta de p20 definida como ~ 5 mL para recolher as iPSCs para um tubo eppendorf, em seguida, adicionar 50 ul de reagente de dissociação de células suave para digerir durante 5 min a 37 ° C. Após a digestão, adicionar 500 ul meio E8 para dentro do tubo eppendorf para diluir o reagente de dissociação de célula suave e girar para baixo as células a 200 xg numa microcentrífuga de bancada padrão durante 5 min. Em seguida, aspirar a maior parte do meio e deixar ~ 30 ul para ressuspender as células e transferir para a placa de 96 poços. NOTA: Esteabordagem facilitará a dissociação do aglomerado de células e rápida expansão da colônia colhidos. </li><li> Continuar colónia colheita até que um número suficiente de colónias IPSC foram recolhidos (aproximadamente 20-30 colónias por experimento é recomendado). </li><li> Após a colheita de colónias, colocar a placa de 96 poços numa incubadora durante a noite. Refresque-se com meio completo E8 no dia seguinte, e da cultura até ~ 70% confluentes. </li><li> Células de passagem de 96 poços em um de 24 poços, em seguida, em um de 6 poços, como descrito nos passos 4,5-4,10. NOTA: os volumes de solução de EDTA e meio E8 deve ser proporcionalmente reduzida ao utilizar poços mais pequenos do que uma placa de 6 poços. </li><li> Avaliar segmentação sucesso por junção PCR e Southern blot para confirmar a integração cassete alvejado e ausência de vetores inseridas aleatoriamente 16. </li></ol>

<ol>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos para a geração bem sucedida de AAVS1 porto seguro alvejado iPSCs humanos são: (1) a entrega eficiente TALEN e doadores plasmídeos em iPSCs por transfecção; (2) optimização de dissociação iPSCs em células individuais antes da transfecção e chapeamento densidade após transfecção; (3) a optimização da dose e do tempo de selecção de droga com base no crescimento da linha iPSC; (4) cuidadosamente dissecar e escolhendo colônias direcionados e transferindo a nova placa / poço. Em ...

A capacidade de reprogramar células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas semelhantes a células-tronco embrionárias (iPSCs) foi descoberto pela primeira vez por Takahashi et al., Em 2007 1. Fibroblastos dérmicos humanos transduzidas com retrovírus expressando quatro fatores de transcrição (The Yamanaka assim apelidado fatores OCT3 / 4, Sox2, foram mostradas c-Myc, e KLF4) ser altamente semelhante às células estaminais embrionárias humanas (hESCs) com base na morfologia, a proliferação, a expressão do gene, e estado epigenética; crucialmente, iPSCs também são capazes de se diferenciarem em células de todas as três camadas germinais 1. A capacidade potencial e diferenciação proliferativa das iPSCs torna ferramentas muito atraentes; reprogramando as células de pacientes que sofrem de doenças específicas, iPSCs pode ser utilizado tanto como em sistemas modelo in vitro da doença e como potenciais agentes terapêuticos. Para este último efeito, várias questões devem ser abordadas antes de todo o potencial das iPSCsem um ambiente clínico pode ser realizado; o potencial tumorigénico de hESCs cultivadas in vitro e iPSCs, o uso de derivados de xenogénicas durante reprogramação e manutenção de células, e a necessidade de rastrear células transplantadas in vivo de todos os obstáculos cruciais para a aplicação clínica de células estaminais pluripotentes (Avaliado por Hentze et al. 2). Uma solução ideal para a necessidade de rastrear células diferenciadas pós-transplante envolveria um marcador visualmente detectável que resiste ao silenciamento e variegação, independentemente da aplicação. Expressão robusta e sustentada de transgenes integrados é o mais prontamente possível quando DNA exógeno é introduzido no porto seguro loci; isto é, locais genómicos que permitem a transcrição de um vector suficiente integrado, enquanto ao mesmo tempo atenuar as perturbações de expressão de genes vizinhos 3. Um tal local que tem sido muito bem caracterizada, desde a sua descoberta, é a integr vírus adeno-associadoção local 1 (AAVS1), no primeiro intrão 1 do regulador 12C subunidade (PPP1R12C) do gene da proteína fosfatase. Este local foi mostrado não só para permitir sustentada e expressão robusta de transgenes integrados através do tempo estendido na cultura e na diferenciação vitro 3, mas também para proteger circundante genes de perturbação da transcrição 4; ambas as características são provavelmente devido à presença de elementos isoladores de cromatina endógenas que flanqueiam o local AAVS1 5. Os avanços na engenharia ferramentas genoma durante apenas a última década, têm muito facilitada a facilidade e eficiência com que as manipulações genéticas em qualquer tipo de célula pode ser conseguido. Embora experiências bem sucedidas iniciais invocado extremamente baixos níveis de recombinação homóloga endógena (RH) com um doador introduzidas para se abordagem selectiva de genes em 6,7 CES, o uso de nucleases específicas do local, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs), que signivamente induzir a recombinação homóloga através da geração de uma quebra de cadeia dupla de DNA tem aumentado consideravelmente a eficiência de tais experiências 8,9. O reaproveitamento de ambos os ativadores de transcrição-como efetoras (contos) da planta patogênica xanthomonas gêneros e os procariotas cluster regularmente interspaced repete palindrômicas curtas (CRISPR) system / Cas9 em eficientes nucleases grife específicas do local fez gene alvo em células-tronco pluripotentes uma acessível e metodologia praticável 10-13. Um artigo recente descreveu um método eficiente para a integração estável de uma cassete repórter fluorescente no AAVS1 porto seguro locus iPSCs humanos utilizando nucleases Tale (TALENS) 14. Essas iPSCs direcionados mantiveram sua fluorescência mesmo após a diferenciação direcionado para cardiomiócitos e transplante em um modelo de rato de infarto do miocárdio (MI), proporcionando uma forte evidência para a utilidade de talestavelmente células estaminais pluripotentes fluorescente 14. Para obter colónias específicas, um método gene armadilha foi utilizado em que um aceitador de splicing (SA), 2A sequência do péptido de auto-clivagem coloca a puromicina N-acetil-transferase gene (PAC) sob o controlo do promotor endógeno PPP1R12C; assim, apenas iPSCs que tenham incorporado o ADN dador no locus AAVS1 expressar PAC, tornando-os selecionáveis ​​baseado em puromicina-resistência; (Figura 1, 15). Este protocolo detalha os procedimentos de geração de AAVS1-GFP iPSCs relatado no recente documento 14, incluindo o processo de transfecção de iPSCs com TALENS e um doador de 9,8 kb para integrar um fragmento de DNA 4.2kb no locus AAVS1 porto seguro, a seleção de iPSCs com base em picking colônias para a expansão clonal ï¿½puromicina-resistência, e. As técnicas aqui descritas podem ser aplicadas a diversos experimentos de engenharia genoma.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

A visualização do protocolo é fornecido na Figura 2, com períodos em que iPSCs são cultivados em meio diferente destaque por qualquer verde para E8 ou azul para NutriStem. É importante para transfectar apenas iPSCs de alta qualidade; examinar placas de cultura em toda a manutenção de rotina e verificar que as culturas IPSC conter colônias principalmente distintos portadores de uma morfologia de paralelepípedos-like (Figura 3A); células diferenciadas não deve ocupar mais do q...

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.3K visualizações.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Vídeo: Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Biologia do Desenvolvimento

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...