Gostaríamos de agradecer a todos os membros da célula-tronco e medicina regenerativa Grupo da Universidade de Würzburg para sugestões úteis e Martina Gebhardt, bem como Heike Arthen para excelente suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), o Ministério da Educação e Investigação alemão BMBF (01 GN 0813), os bávaros pesquisa Rede pluripotentes induzidas Stem Cells &quot;forIPS&quot; eo &quot;Stiftung Sibylle Assmus &quot;. A Figura 1 foi produzido usando Servier arte médica, disponível a partir de www.servier.com.

Os fibroblastos humanos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de uma biópsia da pele após a obtenção do consentimento informado ea depuração ética pelo comitê de ética da Universidade de Würzburg, Alemanha (relatório ético não: 96/11 datada de 10.06.2011). 1. punção para biópsia <ol><li> Desinfectar a pele do paciente. Anestesiar parte pele dos quais biópsia será feita a partir de (preferencialmente uma área menos exposta ao sol) com 0,5 a 1 ml de cloridrato de mepivacaína intracutaneamente e preparar biópsia da pele utilizando um punção biópsia 3 milímetros estéril, lavar biópsia com DPBS + 1 ml / 1 ml de gentamicina e remova gorda. Lavar biópsia duas vezes com DPBS + gentamicina, aspirado completamente DPBS e tampa biópsia com Dispase II (2,4 U / ml) e incuba-se 16 - 18 h a 4 ° C. </li><li> Aspirar Dispase completamente, lave duas vezes com DPBS e remover epiderme com uma pinça. Lave duas vezes com DPBS biópsia, adicionar 2 ml de colagenase tipo 2 (500 U / ml CDU), a transferência em 15 ml de tubo e adicionar Collagenase até 5 ml de volume total. Incubar durante 45 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Centrifugar 5 min a 180 xg e descartar o sobrenadante depois. Ressuspender o sedimento em 10 ml de DMEM-FCS-Gentamicina-meios (10% de FCS, 1 ul / ml de gentamicina) e centrifuga-se novamente durante 5 min a 180 x g. Elimine o sobrenadante e ressuspender sedimento em 1,5 ml DMEM-FCS-gentamicina-media. Transferir para frascos de cultura T25 tecido aderente e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Mudança de mídia a cada 3 dias. </li><li> Após aproximadamente 2 semanas, quando as células são confluentes em torno de partes da pele, células divididas utilizando tripsina / EDTA (0,05%): células de lavagem uma vez com DPBS, incube 5 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2, após a adição de 2 ml de tripsina / EDTA (0,05%), adicionar 2 ml de DMEM-FCS-Gentamicina-media, transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 180 xg durante 5 min; descartar pellet sobrenadante e ressuspender em quantidade adequada de DMEM-FCS-gentamicina-media. </li><li> Além disso expandir as células, alterando a forma cada 3Rd dia e divisão, tal como descrito acima, quando as células estão confluentes; adição de gentamicina pode ser interrompido após a passagem 2. </li><li> Antes de usar as células para experiências de conversão direta, certifique-se de excluir a contaminação por micoplasma por ensaios padrão. </li><li> Quando as células foram expandidas, você pode começar directamente a conversão ou congelar células para baixo usando 10% de DMSO e 90% FCS. As células devem ser armazenados em -80 ° C durante 2 dias e, em seguida, transferida para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li><li> Para a preparação de conversão, lave as células uma vez com DPBS, aspirado de DPBS e adicionar 2,5 ml de tripsina / EDTA (0,05%). Manter durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. Toque balão suavemente para separar células, ressuspender em 2,5 mL de meio de fibroblastos (DMEM incl. L-Glu + FCS a 10% + NEAA a 1% + 1% de piruvato de sódio) e transferir para tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Ressuspender as células em 1 ml de mídia de fibroblastos e pipeta cima e para baixo para gerar suspensão de células individuais. &lt;/ Li&gt; <li> Contar o número de células utilizando uma câmara de contagem Fuchs-Rosenthal- ou Neubauer-célula e a placa 3 x 10 4 culas por po de uma placa de 24 poços,. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. Infecção de fibroblastos humanos com Sendai vírus e Transdiferenciação NOTA: Para garantir a segurança, as seguintes etapas de manuseamento dos vírus tem que ser realizado numa câmara de segurança biológica e uma câmara de fluxo laminar, e com equipamento apropriado pessoal de segurança, especialmente uma máscara cirúrgica, para evitar a exposição da mucosa. <ol><li> Mudar as células a 100 ul de meios de fibroblastos (Passo 1.9). Descongele alíquotas de Oct4-, Klf4-, Sox2- e vírus c-myc-Sendai e ressuspender cada vírus em 1 ml de mídia de fibroblastos. Adicionar cada vírus com uma MOI de 3 para as células (título do vírus varia de lote para lote, mas uma parte alíquota de cada um dos vírus pode ser geralmente utilizado para a infecção de 10 cavidades de uma placa de 24 poços-) e misturar suavemente. Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 </sub&gt;. </li><li> Após 24 h o meio aspirado e adicionar 500 ul de meios neuroinduction (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) e cultura a 39 ° C, 5% de CO 2 a partir de agora. Troque a mídia todos os dias. </li><li> No dia 6 após a infecção preparar 6-Bem placas revestidas com laminina: diluir a laminina de 1 ug / ml em DPBS, adicionar 1 ml de solução em 6 bem-placas e manter a 4 ° C durante 24 h. </li><li> No dia 7, após a infecção dividir as células utilizando DPBS / EDTA: aspiram os meios de comunicação e lave as células uma vez com DPBS, em seguida, adicionar 500 mL de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 500 ul de DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml e centrifugar a 180 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1,5 ml de meio neuroinduction, placa de 6 poços em placas revestidas com laminina e adicionar ROCHA inibidor Y27632 no final de um concentration de 10 pM para as células, a cultura a 39 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Troque a mídia todos os dias. </li><li> A partir do dia 14 após a infecção, as células de cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Colónias Neuroepiteliais se tornar aparente por volta do dia 17 após a infecção por microscopia de contraste de fase. Eles devem ser grandes o suficiente para ser escolhido por volta do dia 20 após a infecção. </li></ol> 3. isolamento de colónias putativas INPC <ol><li> Um dia antes da colheita, um revestimento 48 bem-placa com laminina: diluir a laminina de 1 ug / ml em DPBS, adicionar 300 ul de solução em placas e manter a 4 ° C durante 24 h. Um dia mais tarde laminina aspirado das placas e adicionar 200 uL de meio aos poços neuroinduction. </li><li> Lave os 6 bem-placas contendo as colônias para ser retirado uma vez com DPBS e adicionar DPBS 2 ml por poço de 6 bem-placa. Escolha as colônias mecanicamente: raspar em torno de colônias usando uma agulha fina para se livrar das células circundante; definir o 2001; l Pipetman em 50 ul e escolher as colônias utilizando as respectivas pontas de pipeta. </li><li> Transferir uma colônia cada um em um poço de um 48 bem-placa revestida com laminina e gerar uma suspensão única célula mecanicamente por pipetagem cima e para baixo 10 vezes. Adicionar inibidor ROCHA Y27632 numa concentração final de 10 uM para as células. </li><li> Crescer as células na placa de 48 poços-a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 dias. Troque a mídia a cada segundo dia até que as células chegar a 80-90% de confluência (aproximadamente 3 - 4 dias.). </li></ol> 4. Expansão e Cryo-preservação do iNPCs <ol><li> Passaging e Expansão da iNPCs <ol><li> Aspirar o meio e lava-se as células com DPBS. Aspirar o DPBS e adicionar 200 ul de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, adicionar 200 uL de meio DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 minutos . </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de Neuroimeios nduction (Passo 2.2), placa em placas de 12 poços revestidas com laminina e adicionar inibidor ROCHA Y27632 numa concentração final de 10 uM para as células, a cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Após as células atingem 80-90% de confluência elas podem ser quer expandido ou congelado para baixo como se segue. </li></ol></li><li> Congelamento de iNPCs <ol><li> Aspirar o meio e lava-se as células com DPBS. Aspirar o DPBS e adicionar 300 ul de DPBS / EDTA e incubar durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2, adicionar 300 uL de meio DMEM / F12 e remover a partir da placa de suspensão em um tubo de 15 ml, centrifugar a 180 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de meio de congelação comercial NSC. Suspensão transferência para frascos de congelamento e colocar no recipiente de congelamento celular. Armazenar a -80 ° C durante 2 dias, em seguida, transferir para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol></li></ol> 5. Diferenciação de iNPCs <ol><li> Diferenciação em direção neurônioal linhagem <ol><li> Células de cultura em placas revestidas com laminina, conforme descrito acima. Meios de comunicação para Alterar neuro-diff-meios (DMEM / F-12, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 300 ng / ml de cAMP, 200 uM de vitamina C, 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF) quando as células são cerca de 70% confluente. Mudança de mídia todos os dias durante três semanas. Fazer células não divididas durante a diferenciação. </li><li> Depois de três semanas as células devem expressar o marcador neuronal TUJ1. Para ganhar mais neurônios maduros e subtipos neuronais continuar diferenciação até 3 meses. </li></ol></li><li> Diferenciação em direção linhagem glial <ol><li> Mudar meios para meios de indução da glia (1: 1 de DMEM / F-12: Neurobasal, 1x atmosfera de N2, 1x B27, 10 uM β-mercaptoetanol, 100 uM aminoácidos não essenciais 1,5 mM, L-glutamina, insulina 5 ug / ml, 40 ng / ml de T3) incluindo 20 ng / mL de EGF para induzir a diferenciação em células progenitoras gliais. Retire metade dos meios de comunicação e substituir por meios frescos todos os dias durante cerca de 2 semanas. Durante este período, as células devem ser dividida1: 3 na presença de 10 uM de inibidor ROCHA Y27632 100% de confluência quando for atingido. </li><li> Após 2 semanas diferenciar células ainda em astrócitos: quando as células são mídias de mudança quase confluentes a mídia astrocyte comercial disponível, alteração de mídia a cada segundo dia. Após cerca de 7 dias as células começam a expressar marcadores de astrócitos (por exemplo, GFAP). Se as células obter 100% confluentes durante o protocolo de diferenciação, dividi-los em uma proporção de 1: 2 na presença de 10 uM de inibidor ROCHA Y27632. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Aqui nós mostramos o isolamento e conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais livre de transgenes expansíveis e sua progênie diferenciada como base putativo para a terapia de substituição de células ou aplicação em análises de despistagem de drogas. Conversão directa linhagem de células somáticas em NPCs foi conseguido através da expressão forçada de transcrição específicos de linhagem factores 26,33,34. No entanto, em muitos casos, fibroblastos fetais foram u...

Em 2006 Yamanaka e colegas pode mostrar pela primeira vez, a possibilidade de reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente 1. Este desdiferenciação foi conseguida por sobre-expressão de quatro factores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4, e c-Myc em fibroblastos de murino. Os chamados células estaminais pluripotentes induzidas gerados (IPSCs) mostram a equivalência funcional para células estaminais embrionárias (CES) e pode, assim, ser diferenciadas em todos os tipos de células do organismo adulto. Um ano mais tarde, a reprogramação iPSCs também poderia ser conseguido, por fibroblastos humanos 2. Experiências em modelos animais demonstraram que as células iPSC derivados podem em geral ser utilizadas para a terapia de substituição de células, por exemplo, na doença de Parkinson (DP) de 3-5. No entanto, várias limitações associadas com o uso de iPSCs representam obstáculos para a plena realização de seu potencial terapêutico. Em primeiro lugar, a reprogramação das células para um estado pluripotente e subsequentecontrolo de qualidade é geralmente um processo demorado e ineficiente, produzindo, em procedimentos de cultura de células extensos e, portanto, dispendiosas. Em segundo lugar, iPSCs precisa de voltar a ser diferenciadas em células do tipo desejado de interesse antes da aplicação biomédica e a probabilidade de células pluripotentes residuais na população diferenciada abriga um potencial tumorigénico significativa e, assim, exibe um risco elevado após o transplante de células 6. Em terceiro lugar, o processo de reprogramação é normalmente conseguida através da indução de factores de reprogramação por infecção lenti- ou retroviral. A integração destes vírus no genoma do hospedeiro pode levar a mutagénese por inserção e / ou reactivação descontrolada dos transgenes 7,8. Sistemas não-integrativos foram desenvolvidos para entregar os fatores de reprogramação para células alvo, o que minimiza o risco de mutagénese de inserção do transgene e reactivação. Exemplos para essas abordagens livre de transgenes são a reprogramação de células usando não-integraçãoAdeno ou vírus Sendai 9,10, vectores baseados em DNA ou 11 a aplicação de métodos de DNA-free, como a transfecção de ARNm sintético 12 ou transdução de proteínas recombinantes 13,14. Outro método promissor para a derivação de livre-iPSC transgene é a utilização de construções de reprogramação de lentivírus modificadas-loxP e eliminação subsequente de transgenes que utilizam o sistema de recombinação Cre-loxP DNA 15,16. Uma abordagem mais simples para gerar células neurais para a terapia de substituição de células representa conversão directa de fibroblastos em neurônios pós-mitóticas 17-20. Vierbuchen et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores de transcrição Ascl1, Brn2 Myt1l e resulta na geração de 20% de neurónios de fibroblastos de murino 17. Em 2011 ele foi mostrado para que os mesmos três fatores de transcrição em combinação com superexpressão de NeuroD1 permitir transdiferenciação dos fibroblastos humanos em neurons 19. Neurônios humanos induzida também pode ser gerada por superexpressão de Ascl1 e NGN2 sob dupla SMAD- e GSK3β- inibição 20. Notavelmente, a conversão directa de fibroblastos em neurónios gera, uma população de células pós-mitóticas não proliferativa que não permite uma maior expansão e biobanking. Recentemente, a conversão directa de fibroblastos para uma população de células neurais tronco / progenitoras proliferam foi relatado 21-26. Por razões de clareza, todos estes tipos de células serão nomeados como células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) neste relatório. Han et al. Overexpressed Brn4, Sox2, c-Myc e Klf4 para gerar iNPCs. Tal como os seus homólogos de células-tronco neurais derivadas de células ou de tecidos primária ou pluripotentes estes iNPCs são tripotential e poderia ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos 21. Nosso grupo relatou um protocolo de conversão ligeiramente diferente envolvendo superexpressão de Sox2, Klf4, E c-Myc e induzida por expressão para Oct4 apenas 5 dias. Com esta abordagem que poderia gerar de forma estável proliferação de iNPCs embrionárias e adultas fibroblastos de murino que exibem silencioso completo da reprogramação fatores 22. Em contraste com iPSCs, iNPCs não apresentam um potencial tumorigénico 27 após o transplante. Utilizamos com sucesso células convertido em um modelo animal de desmielinização, ratos deficientes em mielina, demonstrando que são clinicamente úteis iNPCs 22. Até então, NPCs só poderia ser gerada a partir de células-tronco pluripotentes ou tecido neural primário 28-32. iNPCs são estavelmente células expansíveis que podem ser criopreservadas e são capazes de se diferenciar em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Muito esforço tem sido feito para adaptar o protocolo conversão direta de mouse para células humanas 23,26,33,34. Em 2012, foi publicado que a superexpressão do único fator Sox2 em fibroblastos é suficiente para gerar murino e humanos iNPCs <sup&gt; 33. Os autores relataram geração de iNPCs humanos a partir de fibroblastos de prepúcio fetais e caracterizada pela coloração-los contra Sox2 e Nestin. No entanto, as células alvo utilizadas para reprogramação representam um tipo muito particular de células que não estará disponível na prática clínica e não havia nenhuma caracterização funcional de células convertidos por transplante num modelo animal realizada. Uma publicação mais recente descreve a geração de células progenitoras neuronais restritas de fibroblastos fetais humanos por sobre-expressão de Sox2, c-Myc e um ou outro ou Brn2 Brn4 34. As linhas de células geradas mostrou capacidade de auto-renovação e pode ser diferenciadas em vários tipos de neurónios terminais. No entanto, a utilização de fibroblastos fetais é desfavorável, uma vez que estas células são de origem heterogénea e não se pode excluir a presença de, por exemplo residual, as células estaminais da crista neural nas preparações. Em 2014, Zhu et al. Relataram a conversão direta de humano adulto e neofibroblastos natais em células progenitoras neurais tripotential por sobre-expressão de Sox2 juntamente com Oct4 ou Oct4 sozinho e adição de moléculas pequenas para o meio de cultura celular. Nomeadamente, com base na sua estudos Sox2 sozinhos foi insuficiente para induzir a conversão directa 26. Mais recentemente, Lu et ai. Relatou que a sobre-expressão de factores Oct4- o Yamanaka, Sox2-, Klf4-, c-Myc pelo vírus Sendai, durante 24 horas e subsequente inactivação do vírus por um aumento da temperatura resulta na geração de neural tripotential expansível 23 células precursoras. Em conclusão, apesar de os protocolos publicados para a conversão de células humanas até agora têm em comum a sobre-expressão de pelo menos um ou mais dos factores de Yamanaka, muitas vezes, de uma forma atempada restrito, não há nenhuma indicação clara dos factores moleculares mínimos necessários para dirigir directa conversão em iNPCs. A sobre-expressão atempada restrito de Oct4, quer por meios genéticos, transfecção com ARNm sintético, ou cproteína ell-permeante em conjunto com a expressão constitutiva de Sox2, Klf-4, c-Myc e não resultou em linhas estáveis ​​INPC humanos ainda. Assim, a aplicação do vírus Sendai para sobre-expressar todos os factores Yamanaka e oportuno limitar a sua actividade de inactivação por calor do vírus 23 em conjunto com as condições optimizadas dos meios de indução neural 22,31 representa a estratégia preferida até agora. Vários estudos demonstram a funcionalidade celular de NSCs ou os seus homólogos diferenciadas em diferentes modelos de doença animal. Progenitores neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas foram transplantadas em modelos do rato da doença neuroinflamatória esclerose múltipla 35,36. A aplicabilidade de células progenitoras neurais derivadas de células estaminais embrionárias humanas, em EAE (encefalomielite auto-imune experimental) -mice foi mostrado pela primeira vez em 2008 35. As células precursoras neurais multipotentes foram injetadas nos ventrículos do cérebro do rato, e o resultado do transplanteed na redução dos sinais clínicos da EAE. Kim et al., Gerado a partir de precursores oligodendrogliais hESCs e aqueles transplantado por via intracerebroventricular em ratinhos EAE. Embora transplantes não sobreviveram por mais de 10 dias, os ratos apresentaram melhora significativa da função neurológica e redução de células imunes pró-inflamatórios na substância branca 36. Terapia com células-tronco também tem sido aplicada para pré-clínicos segmentação da doença de Parkinson como NPCs poderia ser empregada com sucesso em seus respectivos modelos animais. Para isso, as células progenitoras ou foram derivados a partir de tecido de cérebro fetal 37 diferenciadas a partir de células estaminais pluripotentes 38-40 ou células estaminais mesenquimais foram 41 utilizados. Em 2012, mostrou que iNPCs rato são capazes de produzir a proteína proteolipídica, a principal componente de proteína de mielina, após a transplantação para o cérebro de ratos (MD) deficiente em mielina 22. Por esse experimento prova de princípio a applicabil terapêuticodade de iNPCs foi primeiramente provado e logo confirmada por outro estudo 32. No entanto, o potencial de utilização terapêutica de humanos iNPCs continua a ser explorado. Aqui mostramos um processo robusto e integrado de (i) a derivação de células primárias humanas a partir de doentes adultos por biópsia da pele, (ii) a conversão directa de fibroblastos humanos em um estado progenitora neuronal e (iii) a capacidade de iNPCs ser diferenciadas em neuronal e linhagens gliais. O uso deste protocolo vai ajudar a acelerar a geração de células humanas autólogas para aplicações terapêuticas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astrocyte media</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td align="right">1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td align="right">48301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon medchem</td>
			<td align="right">1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type2</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>PAN&#160;</td>
			<td>P10-032100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Roth</td>
			<td align="right">4720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td align="right">50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP-antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLIF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>GEM-700-112-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67-antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSC freezing media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4-antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>inh-sb43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>&#160;LifeTechnologies</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumpyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox1-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-205725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 146986-50-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de fibroblastos da pele de adultos e subsequente diferenciação em células somáticas oferece perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos que contornar as barreiras de histocompatibilidade. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e subsequente diferenciação completa em linhagens desejadas continua a ser um obstáculo para a tradução clínica da tecnologia iPSC por causa do potencial instabilidade genômica e neoplásico associado. Recentemente, nós e os outros mostraram que as células somáticas não só pode ser convertido em iPSCs mas também em diferentes tipos de células-tronco somáticas multipotentes usando fatores definidos, evitando assim a progressão através do estado pluripotente. Em particular, a conversão directa de fibroblastos humanos em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) anuncia a possibilidade de uma fonte de células autólogas novo para várias aplicações tais como a substituição de células, modelagem doençae o rastreio de drogas. Aqui, descrevemos o isolamento de fibroblastos primários humanos adultos por biópsia da pele e sua eficiente conversão direta em iNPCs por expressão oportuna restrito de Oct4, Sox2, Klf4, bem como c-Myc. Colónias neuroepiteliais Sox2-positivos aparecem após 17 dias de indução e linhas INPC pode ser estabelecida de forma eficiente pelo isolamento monoclonal e expansão. Ajuste preciso da multiplicidade de infecção viral e suplementação do fator inibidor de leucemia durante a fase de indução representam fatores críticos para alcançar a eficiência de conversão de até 0,2%. Até agora, as linhas INPC específicos do paciente poderia ser expandida para mais do que 12 passagens e uniformemente exibir características morfológicas e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais, tais como a expressão de nestina e Sox2. As linhas INPC podem ser diferenciados em neurônios e astrócitos como avaliado por coloração contra TUJ1 e GFAP, respectivamente. Em conclusão, nós relatamos um protocolo robusto para a derivação e direct conversão de fibroblastos humanos em células progenitoras neurais de forma estável expansíveis que podem fornecer uma fonte celular para aplicações biomédicas, tais como a substituição da célula neural autólogo e modelagem de doença.

Aqui apresenta-se descrição de um processo integrado que permite a geração de células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) a partir de fibroblastos humanos que tenham sido obtidos por uma biópsia por punção da pele em menos de 8 semanas (Figura 1). INPCs paciente-specifc pode ser ainda mais diferenciado em linhagens neuronais e gliais e abrigar um enorme potencial para a terapia de substituição de células e modelagem doença. Infecção dos fibroblastos com Oc...

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Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

derivation-adult-human-fibroblasts-their-direct-conversion-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K visualizações.  University of Würzburg.  Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais. 

Vídeo: Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neurociência

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...