We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

NOTA: O cuidado e manipulação experimental de todos os ratinhos neste trabalho foi aprovado pelo Comitê Institucional Animal Care e Uso da Universidade Cornell. 1. Preparação para Cirurgia <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos necessários usando uma autoclave ou procedimentos de esterilização aprovados. No mínimo, incluir um bisturi, tesouras, tesouras vanna, pinça, chave de fenda do joalheiro, cotonetes, um conjunto de afastadores, o implante (Figura 1A) e seu sistema de entrega (Figura 1D, E). </li><li> Limpe todas as superfícies, incluindo as maçanetas estereoscópio, com 70% de etanol e / ou desinfetantes adequados. </li><li> Criar um campo estéril sobrepondo o stereotax custom (Figura 1D) e em torno de bancada com campos estéreis. A almofada de aquecimento (de preferência realimentação controlada) deve ser colocada no topo do stereotax e sob os lençóis esterilizados. </li></ol> 2. Prepararo mouse para Cirurgia <ol><li> Anestesiar um rato com menos de 5% de isoflurano / oxigênio em uma câmara de indução até a taxa de respiração diminui para cerca de 1 respiração / sec. </li><li> Transferir rato para uma área de preparação de distância a partir do campo estéril, utilizando um cone de nariz para continuar exposição isoflurano. Reduzir isoflurano a 2%. Aplicar colírio para evitar o ressecamento da córnea. </li><li> Administrar glicopirrolato (uma droga anticolinérgica) a 0,05 mg / 100 g por via intramuscular no rato, utilizando os membros posteriores 29-30 agulhas G e 3/10 cc seringa, proporcionando aproximadamente 50% do volume de injecção por ramo. NOTA: Glicopirrolato serve para evitar o acúmulo de líquido nos pulmões, enquanto o mouse está sob anestesia. </li><li> Usando clippers elétricos, raspar uma parte do dorso do rato, cerca de 3 cm de comprimento por 2 cm de largura e centradas no arco torácica. Limpe todo o cabelo cortado bem longe da área raspada. </li><li> Administrar as seguintes injecções por via subcutânea e distal ao raspadapatch usando 29-30 agulhas G e seringas de 3/10 cc: 1 ml / 100 g de rato 5% de glucose em soro fisiológico (por hidratação), 5 mg / kg de cetoprofeno rato (um NSAID para analgesia), 0,2 mg / kg de dexametasona rato ( um esteróide anti-inf lamatório para reduzir a inflamação). </li><li> Usando cotonetes, realizar três lavagens alternadas de iodo e etanol a 70%, à espera 1 min entre lavagens. </li><li> Administrar 100 ul de 0,125% de bupivacaína (um bloqueio do nervo periférico) por via subcutânea utilizando 29-30 agulhas G e 3/10 cc seringa para o centro da mancha raspada para reduzir a dor no local da incisão. </li><li> Transferência do mouse para o costume stereotax (Figura 1D), inserir termômetro retal, e esperar cerca de 10 min para bupivicaine entrem em vigor. </li></ol> 3. Exponha e limpar o Dorsal Lâminas de 3 Adjacente Thoracic Vértebras <ol><li> Usando a lâmina de bisturi, criar uma pequena (5 mm ou menos) por cima da incisão vértebras de interesse (Figura 2A). </li><li&gt; Usando o auxílio de pinças ou por inserção da ponta de uma tesoura cirúrgica e espalhando as alças, aumentar o tamanho da abertura na pele por dissecação romba. </li><li> Usando um bisturi ou tesouras cirúrgicas, dissociar suavemente fáscia conjuntivo entre a pele e o músculo subjacente. </li><li> Use afastadores para segurar a pele, permitindo tão grande uma área de trabalho possível (Figura 2B). Tome cuidado para não aumentar a carga sobre o peito e, assim, obstruir a respiração. </li><li> Usando um par de fórceps, pega o rostral-mais vértebra que será exposto através do músculo sobrejacente. Utilizando um bisturi, o tecido cortado em ambos os lados do processo dorsal de todos os três vértebras (Figura 2c). </li><li> A utilização de qualquer combinação de uma lâmina de bisturi, cotonetes, e / ou raspador de osso, remover todo o tecido que recobre a partir da lâmina dorsal (Figura 2D). </li><li> Usando uma tesoura cirúrgica, cortar cuidadosamente tendões ligados às vértebras em ambos lateral bordas da coluna vertebral (Figura 2E). </li><li> Usando o bisturi, com cuidado remover o máximo de tecido a partir dos bordos laterais da coluna vertebral, tal como possível, a fim de proporcionar uma superfície de aperto limpo. </li><li> Suavemente debride as vértebras de qualquer tecido macio restante, utilizando um raspador de osso e / ou um cotonete. Apare qualquer tecido incongruente em outros lugares usando uma tesoura cirúrgica (Figura 2F). NOTA: É essencial para a fixação e realização da laminectomia dorsal que as vértebras são claramente expostos. Um cauterizador pode ser útil no controle da hemorragia subsequente. </li><li> Deslocar afastadores para segurar o tecido circundante da coluna vertebral em adição à pele (Figura 2F). </li><li> Prenda as barras laterais implante para os dentes nos postes de entrega e carregá-los para os detentores de pós-(como na Figura 1E). </li><li> Prenda as vértebras 3 usando as barras laterais, aplicando pressão suficiente para segurar securely (Figura 2G, H). Use uma pinça para ajudar a garantir um nível de fixação das vértebras 3. Note-se que várias tentativas pode ser necessária. Certifique-se de que as barras laterais são tanto a nível e antes paralelo com a realização do laminectomy. </li><li> Cuidadosamente limpar e secar a superfície dorsal das vértebras pinçada usando cotonetes. </li></ol> 4. Execute um Laminectomy Dorsal <ol><li> Insira as pontas das tesouras Vannas no espaço epidural da vértebra pinçada medial e espremer as alças levemente; se o osso for seco, deve rachar ao longo do comprimento da lâmina dorsal. Repita este procedimento no lado contralateral para liberar a lâmina. </li><li> Delicadamente, segurando a lâmina solta pelo processo dorsal com uma pinça, cortar cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo nas extremidades rostral e caudal da lâmina e levante-a. </li><li> Usar soro fisiológico 0,9% e / ou líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF), lave bem longe qualquer overlyi sangueng a medula espinhal. Use cotonetes para absorver o excesso de fluido. </li><li> Com uma tesoura Vannas, aparar cuidadosamente as bordas laterais do osso de volta para as barras laterais do implante. Mais uma vez, lavar e controlar o sangramento usando cotonetes e soro fisiológico / ACSF. </li><li> No caso em que uma porção do periósteo foi isolada e sobrepõe-se a medula espinal, suavemente remover este tecido com cotonetes de algodão e / ou um 29 - agulha 30 G. Tome cuidado para não ferir a medula espinhal nessa porção do procedimento. Não confunda o periósteo solto com a dura-máter embrulhado. </li><li> Cuidadosamente, selar as restantes extremidades expostas do osso com um ou ambos de cianoacrilato e acrílico dental (Figura 2I). Tome especial cuidado para não permitir que as colas a fluir para a medula espinhal exposta. </li></ol> 5. Seal da Câmara <ol><li> Posicione a placa superior com cuidado para que os 4 slots alinhar com os 4 furos nas barras laterais ea abertura recobre o spin expostacabo al (Figura 1B e 2J). </li><li> Usando chave de fenda do joalheiro, comece com cuidado o primeiro parafuso, estabilizando o eixo da chave de fenda com outro par de fórceps. Não aperte o parafuso nesta fase, mas inseri-lo de modo a que os primeiros tópicos estão engajados. Repita esse processo para os outros 3 parafusos. NOTA: É útil para usar titânio ou outros fórceps não magnetizáveis ​​para ajudar a posicionar os parafusos nesta fase. </li><li> Com todos os 4 parafusos no lugar, aperte cada parafuso alternadamente pela mesma quantidade em pequenos incrementos até parafusos estão bem fixados (Figura 2K). Note-se que isto não é invulgar para a placa de topo a flectir durante este processo. Tome cuidado para não apertar os parafusos muito, pois a cabeça do parafuso pode quebrar e pressão descendente excessiva vai desalojar a braçadeira e / ou resultar em lesão medular. </li><li> Usar um elastómero de silicone para preencher o espaço entre a medula espinal e da janela de vidro. Porque corças não produzem ácido acético durante a cura, use KwikSil marca elastômero e dicas de mistura. Aplicar uma porção liberal do silicone para a medula espinal exposta. Tome cuidado para se livrar de qualquer silicone contendo bolhas de ar da ponta de mistura antes da aplicação para a medula espinhal. </li><li> Trabalhando rapidamente, pressione suavemente a 5 milímetros # 0 lamela para a inserção na placa superior. Aplicar pressão suficiente para apertar progressivamente o elastómero líquido para cercar a medula espinal, mas não resultar na compressão da medula espinal (Figura 2L). Determinar a hora para o elastômero é de aproximadamente 90 segundos, por isso certifique-se a lamela é aplicada rapidamente. </li><li> Em caso de uma vedação não, espere até que o elastômero definiu, remova-o suavemente a partir do implante com uma pinça, e repetir 5,4-5,5. </li><li> Cobrir as bordas de elastómero exsudado com acrílico dental / cianoacrilato e aderir ao osso circundante, tanto quanto possível para evitar que o elastómero de deslocamento sobre a superfície da medula espinhal. </li><li> Remover afastadores e puxe a pele para cima em torno da borda do implante. Usando cianoacrilato, aderir a pele para as bordas do implante (Figura 2 M, N). </li><li> Inserir # 0-80 - 1/4 &quot;parafusos de ajuste para as asas da placa superior (Figura 1C e 2 O). </li><li> Usando acrílico dental, selar eventuais lacunas nas fendas dos parafusos da placa superior (Figura 2P). </li></ol> 6. Cuidados Pós-Operatórios <ol><li> Remover animais da anestesia e coloque em uma grande gaiola limpa. Certifique-se de que a gaiola é suficientemente grande para que a câmara não senão em nada (tal como o mergulho em forma de V para uma garrafa de água e / ou alimentos) durante o curso de locomoção normal durante toda a gaiola. NOTA: uma gaiola de ratos padrão é ideal. </li><li> Coloque a gaiola sobre uma superfície aquecida, enquanto o animal recupera. Não devolva o mouse para a companhia de outros animais, até que se recuperou totalmente. </li><li> Verifique beha animaisvior dentro de 1-2 pós-operatório hr para os sinais de dor ou angústia e integridade do implante. NOTA: Sob condições normais, o animal deve ser capaz de deambulação com perturbações modestos para movimento. </li><li> Continue a verificar animais cada 8 - 12 horas para a primeira 72 horas, medição de peso e monitorar o comportamento. Verifique se os animais são ativos e móvel durante a noite. Alimento molhado na forma de terra chow misturado com água ou géis nutricionais, pelotas de comida e água potável deve ser fornecida ao nível do solo. Hidratação adicional de injeções subcutâneas ou intraperiotoneal devem ser fornecidos, se necessário. </li><li> Administrar 5 mg / kg cetoprofeno mouse e 0,2 mg / kg por via subcutânea rato dexametasona em 24 e 48 pontos no tempo hr, no pós-operatório. Além disso, 0,005-0,010 mg / 100 g de rato deve ser administrada a cada 8 horas por via subcutânea durante 72 h. </li></ol> 7. imagiologia in vivo <ol><li> Anestesiar um rato sob5% de isoflurano / oxigênio em uma câmara de indução até a taxa de respiração diminui para cerca de 1 respiração / sec. </li><li> Transferência do mouse para o costume stereotax (Figura 1D) com feedback controlado almofada de aquecimento e inserir termômetro retal. Reduzir isoflurano a 2%. </li><li> Administrar glicopirrolato 0,05 mg / 100 g por via intramuscular rato nos membros posteriores usando 29-30 agulhas G e 3/10 cc seringa, proporcionando aproximadamente 50% do volume de injecção por ramo. </li><li> Administrar 1 ml / 100 g de rato 5% de glucose (para hidratação) por via subcutânea em soro fisiológico, uma vez por hora. </li><li> Insira os titulares câmara enfiado no pós-titulares utilizados para a cirurgia (Figura 1F). Ajuste a altura e torcer as mensagens sobre os parafusos de ajuste na placa superior. </li><li> Com ambos os titulares anexado, elevar os titulares nos suportes de pós-até que o peito pode expandir-se livremente sobre a inspiração. NOTA: Tanto o firme apego dos titulares e da livre expansão do significan peitotly reduzir artefatos de movimento devido a respiração. </li><li> Realizar imagem como desejado. </li><li> Quando imaging for concluída, os postos mais baixos, torcer fora titulares de câmara, retire termômetro retal, e lugar do mouse sobre uma superfície aquecida para se recuperar. Não devolva o mouse para a companhia de outros animais, até que se recuperou totalmente. </li></ol>

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K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

A técnica demonstrada aqui permite repetida, time-lapse, in vivo de imagens do mouse dorsal SC para muitas semanas pós operatório sem a necessidade de procedimentos cirúrgicos subsequentes. Este procedimento representa uma melhoria substancial sobre estudos de imagem repita-cirurgia ou sobre abordagens histológicas portmortem, cuja informação sobre a dinâmica celular é perdido. Temos anteriormente 30 demonstraram o valor desta técnica para estudar SCI patologia in vivo. A extensão longitudinal máxima de imagens foi determinada pelo crescimento de um denso tecido fibroso sobre a superfície dorsal do SC. Ao longo do tempo, este crescimento resultou na perda de contraste de imagem e resolução. Este crescimento também tem sido visto em preparações cirúrgicas alternativas 31. Curiosamente, observou-se que este crescimento podem ser minimizados lavando cuidadosamente superfície dorsal SC para remover produtos derivados do sangue, a superfície de vedação deo osso corte com cianoacrilato, bordas da câmara de vedação bem com elastômero de silicone, e minimizando o espaço intersticial entre o SC dorsal e a tampa de vidro. Recentemente, outra abordagem semelhante à nossa própria utilizando uma câmara de policarbonato tem sido demonstrada 32. A utilização de policarbonato é vantajosa uma vez que é compatível com raios-X e modalidades de imagem acústica, que não é o caso para as peças em aço inoxidável. No entanto, com a tecnologia agora ubíqua de impressoras 3D, partes da câmara pode ser fabricada a partir de uma ampla variedade de materiais para atender necessidades específicas. Nós imprimimos recentemente todas as nossas peças em um fotopolímero clara. Uma desvantagem principal de uma câmara fechada, é a incapacidade de administrar dosagens repetidas de drogas exógenas ou corantes adequados para imagiologia de 34 SC. No entanto, por capitalizando sobre a estabilidade mecânica do nosso sistema atual, nós já usou nossa câmara de presente para o sucessoly ancorar um cateter intratecal ligado a uma porta implantada subcutaneamente por injecção, o que permitiu a administração de fármaco em vários pontos de tempo, mesmo num sistema de câmara fechada (trabalho não publicado). Além disso, devido à natureza modular da placa de topo, as futuras versões desta preparação incluirá uma câmara possa ser fechada novamente para permitir a aplicação repetida de ambos os agentes terapêuticos e marcadores fluorescentes. É também possível prever placas de topo é montado com os eléctrodos para a gravação de inserções, ópticos, e as portas para a entrega de drogas. Essas adições provavelmente seria mais difícil aplicar a usar o sistema mais minimalista de Fenrich et al. 31. Em conclusão, a nossa câmara fornece uma plataforma de gateway em que diversos experimentos podem ser baseadas.

Time-lapse em microscopia vivo em organismos intactos permite a visualização direta dos processos biológicos complexos que são inacessíveis para análise de ponto-time única tradicional, tais como imuno-histoquímica. Especificamente, a microscopia multi-fotão (MPM) 1 permite a formação de imagens de tecido de espalhamento, tais como o neocórtex roedor, quando tiver sido alcançado imagiologia até 2,3 e em excesso de 4 de 1 mm. Quando combinado com os preparativos cirúrgicos 5-7 em que um único procedimento permite acesso óptico para o cérebro por semanas a meses, estas abordagens de microscopia foram usados ​​para estudar os processos dinâmicos do cérebro em estados saudáveis ​​e doentes 11/08. Além disso, os protocolos foram desenvolvidos 12,13 que prevêem a imagem in vivo em vigília (ou seja, não anestesiados) animais, permitindo a imagem funcional celular resolução durante ensaios comportamentais. Estes protocolos foram utilizados para comparisons de atividade neuronal correlacionada 14, astrócitos sinalização 15 em animais anestesiados e vigília de cálcio, a identificação de aglomerados neuronais específicos de tarefas 16, bem como a capacidade dos neurônios de discriminar localização objeto sobre suiça de estimulação 17. Dado o potencial desta abordagem para elucidar os mecanismos saudáveis ​​e patológicas, lapso de tempo de imagem in vivo foi aplicado para a medula espinal de rato (SC), permitindo a identificação de degeneração axonal aguda (DAA), um mecanismo 18 de doença. Estudos subsequentes investigados os efeitos de lesões periféricas em gânglios da raiz dorsal (DRG) de regeneração axonal 19, a função dos vasos sanguíneos na regeneração axonal 20, a quimiotaxia de células gliais em resposta ao ferimento 21, a migração de células T em encefalomielite auto-imune experimental (EAE) de 22, a actividade de 23,24 a microglia e astrócitos 25 em resposta a amyotrophesclerose ica lateral (ALS), o papel de STAT-3 em brotamento axonal após a lesão SC (SCI) 26, e um mecanismo de perda axonal e recuperação 27 na EAE. Apesar do sucesso destas abordagens, todos estes estudos foram limitados a qualquer uma sessão de imagem única, limitando assim os estudos de dinâmica de curto prazo, ou então necessário repetir aberturas cirúrgicas do animal em cada ponto de tempo de imagem, o que limita o número de pontos no tempo acessíveis e aumentando a probabilidade de artefatos experimentais de confusão. Protocolos para estas cirurgias foram previamente publicados 28,29. Recentemente, publicamos uma técnica de 30 para a implantação de uma câmara espinhal crônica que permitiu time-lapse imaging MPM no rato SC ao longo de várias semanas sem a necessidade de cirurgias repetidas. Resumidamente, esta preparação cirúrgica incluiu a realização laminectomia na coluna vertebral torácica inferior e a implantação de uma câmara de quatro partes. A câmara incluídatrês peças de aço inoxidável custom-usinadas que apertadas as vértebras em torno do laminectomy, e uma lamela de vidro colocado sobre o SC e presa com elastômero de silicone. Esta técnica permitiu para a imagem latente de rotina a mais de cinco semanas de pós-operatório em estados saudáveis ​​e feridos, sem a necessidade de cirurgias repetidas. O número de pontos de tempo de imagem foi limitada apenas pela frequência a que o animal pode tolerar a indução da anestesia. A visualização foi vida limitado pelo crescimento de um denso tecido fibroso sobre a superfície da SC. Além disso, verificou-se que o implante cirúrgico não teve efeito a longo prazo sobre a função motora. Desde a nossa primeira publicação, abordagens alternativas que permitam também de imagem a longo prazo na SC foram descritos em outro 31-33. Este protocolo demonstra o nosso procedimento para a implantação da câmara de medula desenvolvemos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:68px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:201px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">15000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps, scissors, scalpel, etc.</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">multiple&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -magnetic fixator</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -retractor</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-09</td>
			<td>other retractors may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -elastomer</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">feedback controlled heating blanket</td>
			<td style="width:68px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:115px;">Model: TC-1000 Mouse&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Part No. 08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">stereotax</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber holders</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:68px;">Loctite</td>
			<td style="width:115px;">Loctite 495</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8101</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8501</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycopyrrolate</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:68px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ketoprofen</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Elastomer</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Mixing Tips</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIKMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Seguindo o procedimento anterior, cada fase da cirurgia deve imitar os resultados obtidos em cada estágio da operação delineado na Figura 2. Cuidado especial deve ser feita quando a aplicação do elastómero de silicone para eliminar as bolhas de ar sob o vidro ou, pelo menos, para assegurar que eles são localizado na periferia da área de interesse (Figura 2L). Para um cirurgião com experiência, complicações cirúrgicas que exigem a eutanásia, quer durante a cirurgia ou durante o primeiro 24 horas pós-cirurgia ocorrem em aproximadamente 20% das operações. Estas complicações mais freqüentemente surgem de hemorragia tecido mole excessiva ou falta de fixar firmemente a câmara para a coluna vertebral. Em câmaras implantadas com sucesso, a janela tipicamente permanece opticamente transparente para várias semanas (Figura 3). Apesar dos melhores esforços, um crescimento fibroso opaco,, neoplásicas forma frequentemente dentro de alguns dias, resultando em obscuri parcialng de janela (Figura 3C - F, linha tracejada preta). Estruturas fluorescentes são difíceis de ver usando microscopia 2PEF debaixo deste tecido fibroso. Encontramos uma distribuição bimodal de resultados, com aproximadamente 50% de janelas implantadas com sucesso restante clara durante mais de 5 semanas após a cirurgia, e aproximadamente 50% ofuscado tornando-se dentro de 1 - 3 semanas. Para janelas que ficam claras a maioria dos lugares, dentro da experiência de visualização de janela só um modesto grau de neovascularização em ou acima da dura-máter (Figura 3D - F, asteriscos verde), o que não impede 2PEF imagem. O nosso estudo anterior 30 mostrou um aumento em microglia mas não densidade astrócitos sob a janela e vértebras adjacentes, indicando ligeira inflamação análoga à observada nas preparações de janela cranianos 5. Em ratinhos transgénicos que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) em um subconjunto de raiz dorsal GangliA (DRG) neurónios (linha YFPH; Jackson Labs), axónios foram claramente distinguível por semanas no pós-operatório (Figura 4A e b) e, desde que quatro meses de um animal (dados não mostrados). Os vasos sanguíneos (Figura 4A e B) foram feitas visível por retro-orbital injetar fluorescente Texas Red marcado dextrano no plasma sanguíneo. Também microglia foram visualizadas em ratinhos que expressam GFP numa CX3CR1 knock-in rato (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) cruzou a linha YFPH (Figura 4C). Contraste e resolução modestamente deteriorou ao longo do tempo (Figura 4C), devido à formação de um crescimento fibroso excessivo anteriormente descrito 30. Rotineiramente fotografada durante 3 horas em uma única sessão, sem mortalidade e quantas vezes a cada 12 horas. A duração das sessões e freqüência é limitada pela tolerância do animal para indução anestésica, concomitante com as considerações éticas que acompanham a dor e sofrimento para animais de laboratório. &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Figura 1. Um conjunto personalizado cirúrgico facilita a entrega câmara durante a implantação e estabiliza a câmara durante as sessões de imagem subsequentes. Duas barras laterais e uma placa superior (A) são montadas (B) usando pequenos parafusos da coluna vertebral para dentro da câmara (C). A mesa cirúrgica, com mensagens extensíveis (D) permite a entrega e de fixação das barras laterais para as vértebras utilizando pinos de detenção (E). Sessões de imagem subsequentes em vez usar mensagens com rosca interna para anexar à câmara através dos parafusos de ajuste nas asas do implante (F). Painel b desta figura foi modificado a partir Farrar et al., Nature Methods, 30, 2012 com a permissão da Nature Publishing Group.96 / &quot;target =&quot; _ blank &quot;52196fig1large.jpg&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Figura 2. Uma laminectomia dorsal e é realizada uma câmara de imagem crónica é implantado para fornecer acesso óptico para a medula espinal. O processo está descrito em montagem. Em primeiro lugar, a pele (painéis A, B; secções protocolo 3,1-3,4) e músculos (C; 3,5) são retraídos para expor a três vértebras subjacente. O tecido que recobre estes três vértebras é removido (D, E, F; 3,6-3,10) e os processos laterais são raspadas limpo antes de serem fixadas em ambos os lados (G, H; 3,12). Cuidadosamente, a lâmina dorsal da vértebra central é removida, e os bordos do osso selado (I </strong&gt;; 4. 6). Uma placa de topo é aplicada (J; 5.1) e parafusos apertados na posição (K; 5.3) para fixar a câmara antes de a câmara de vedação com elastómero de silicone e vidro de cobertura (L; 5,5). Depois de os pinos de entrega são removidos (M; 5,8), a pele é colada às paredes da câmara (M, N; 5,8) e os parafusos de fixação são inseridos nas asas (S; 5,9). Finalmente, os slots de parafusos são selados com acrílico dental (P; 5.10). E o mouse é colocado em uma gaiola limpa para recuperar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Figura 3. Uma câmara espinhal crônica permanece ov opticamente transparenteser várias semanas. Imagens de luz branca da medula espinal, que vão desde alguns minutos (A) a três semanas após a cirurgia (F). Marcos vasculares são identificáveis ​​em todos os pontos temporais (setas amarelas). Pouca mudança é vista em um dia após a cirurgia (B). Supercrescimento denso fibroso (C - F, delimitada pela linha tracejada no canto inferior direito) está presente em até três dias e resulta em obscurecimento parcial da área de imagem. Neovascularização Mild (D, E, F, asteriscos verdes) também está presente, mas não obscurece a vasculatura original na luz branca ou 2PEF de imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Figura 4. Uma câmara de medula crónica permite repetido imagem multi-fotão sem a necessidade de cirurgias de repetição. imagiologia repetida de ratinhos transgénicos que expressam YFP em um subconjunto de axónios DRG (verde) em funicular dorsais da medula cabo e vasculatura (vermelho) marcado por injecção intravascular corante (A, B). A atividade da microglia (malva) também pode ser acompanhada ao longo do tempo em Thy1-YFP / CX3CR1-GFP camundongos transgênicos dupla (C). Enquanto axônios e microglia permanecem visíveis, contraste e resolução declínio modestamente ao longo do tempo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados ​​e demonstrada.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

a-procedure-for-implanting-spinal-chamber-for-longitudinal-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

13.9K visualizações.  Cornell University.  Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a implantação de uma câmara de imagem óptica crônica sobre a medula espinhal dorsal de um rato vivo. A câmara, procedimento cirúrgico, e imagiologia crônica são revisados ​​e demonstrada. 

Vídeo: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

A seqüência de difusão na Medula Espinhal Rat Cervical

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...