Este método permite o exame da dinâmica proteica in vivo dentro do sistema nervoso central intacto para abordar questões em neurociência e imunologia. As principais vantagens deste procedimento são uma excelente estabilidade de movimento para aquisição de imagens, breve tempo cirúrgico, redução da exposição do operador à anestesia gasosa e backplates personalizáveis baratos. A demonstração visual deste método é fundamental, pois é difícil remover o osso sem danificar o tecido do sistema nervoso intimamente subjacente durante as etapas de laminectomia do procedimento.
Antes de iniciar o procedimento, use um software de design auxiliado por computador 3D para criar um modelo para as dimensões indicadas. Então temos um objeto, que é o objeto tridimensional, que é com isso que podemos começar. O que posso fazer então é colocar configurações sobre isso para a versão de impressão.
Então, se eu abrir Editar isso, entrar no Advanced, abrir uma janela que me permita olhar para todas essas configurações. Defina a temperatura do bocal para 205 graus Celsius, a temperatura do leito para 45 graus Celsius e a velocidade de impressão para 45 milímetros por segundo em uma impressora 3D. Use um bocal de ent quente de 0,4 milímetros e uma altura de camada de 0,2 milímetros para imprimir as placas traseiras.
Em seguida, avalie as placas traseiras impressas visualmente para sua integridade estrutural. Falhas estruturais brutas indicam defeitos de impressão. Quando as placas traseiras estiverem prontas, coloque a cabeça de um rato anestesiado de oito a 12 semanas em uma almofada de calor entre as barras de ouvido de um auxiliar cirúrgico e aplique pomada nos olhos do animal.
Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, use uma lâmina número 11 para fazer um rostral de 1,5 centímetros para caudal incisão midline sobre a região lombar superior torácica inferior e separar a pele do peritônio. Use fórceps para descascar qualquer tecido conjuntivo transparente restante sob a pele para expor a musculatura superficial. Deslocar os músculos com uma lança cirúrgica de espuma junto com o músculo mais profundo restante da vértebra alvo.
Para criar um assento para a placa traseira, limpe o músculo do aspecto posterior da torácica 11 e o aspecto anterior da torácica 13. Usando fórceps para remover o músculo restante dos tendões, conforme necessário. Quando todo o músculo tiver sido removido, corte cuidadosamente os tendões com fórceps até que seja alcançado espaço suficiente para visualizar e manipular a medula espinhal.
Confirme que a dura-luz do espaço intervertebral, o osso laminar semitransparente, o vaso sanguíneo superficial central sob o osso, e a artéria radiadora anterior são claramente visíveis. Molhe a região com fluido espinhal cerebral artificial quente e use uma microfuradeira para afinar o osso laminar usando traços retos paralelos ao longo eixo da medula espinhal. Agarrando suavemente o processo superficial de espimoss com fórceps, levante a vértebra.
O osso deve levantar facilmente. Use fórceps número quatro para limpar quaisquer fragmentos ósseos, controlando qualquer sangramento com uma lança cirúrgica e pressão suave e constante, conforme necessário. Em seguida, enxágue o tecido com fluido espinhal cerebral cerebral quente.
Para implantação de vidro de cobertura, aplique delicadamente um copo de tampa de borossilicato de três milímetros no cabo exposto. Use uma pequena espátula para aplicar 39 graus Celsius aquecido 2% à borda do vidro e permitir que a ação capilar desenhe a agarose sob a superfície de vidro de cobertura. Aplique adesivo tecidual aos processos articular ósseo exposto da vértebra adjacente intacta no nível torácico 11 e 13 colunas vertebrais.
Aplique adesivo de tecido adicional em um anel ao redor do local da laminectomia sobre o tendão adjacente e o processo transversal. Em seguida, use uma nova espátula para aplicar cimento dental misturado com acelerador na camada adesiva do tecido e coloque uma placa traseira no campo cirúrgico centrada sobre a janela de vidro da tampa. Aplicar várias camadas finas de cimento dental resulta em uma adesão mais forte da placa traseira, mas certifique-se de colocar a placa traseira rapidamente antes que o cimento dentário comece a secar.
Depois de permitir que o cimento dental cure por 10 minutos, preencha a base interna e a parte inferior do fundo com adesivo adicional. A aplicação do cimento dental em camadas finas pode ajudar a reduzir o risco de o cimento se espalhar para o vidro da tampa e agarose, o que pode comprometer todo o protocolo. Quando o cimento dentário secar, aplique um suporte de placa de trás bifurcado na posição apropriada sobre a janela e enrosque a placa traseira no suporte da placa traseira.
Em seguida, aplique soro fisiológico na placa traseira para testar o vazamento. O animal e a plataforma cirúrgica podem então ser transferidos para a tabela óptica de um microscópio de dois fótons para imagem através da janela de vidro da tampa. Neste experimento representativo, o EGFP positivo claudin-5 foi visualizado dentro das junções apertadas fluorescentes rotuladas ao longo de um plexo vascular.
O delineamento claro das estruturas de junção apertadas na projeção Z indica que o deslocamento mínimo da imagem XY é produzido após uma laminectomia bem sucedida, colocação da janela e implantação da placa traseira. Ao tentar este procedimento é importante lembrar que esta microcirurgia é difícil e pode levar tempo para dominar. No entanto, uma vez dominada, esta cirurgia pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos.
Após esse procedimento, outros métodos, como duas microscopia de fótons e imagem in vivo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre remodelagem neurovascular e outros processos da doença envolvendo a medula espinhal.
