Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pela Subcomissão de Investigação Animal Care, que serve como Cuidado e Uso Comitê de animal Institucional (IACUC) para o Hospital Geral de Massachusetts, e estão de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde. 1. animal Habitação e Procedimento Handling <ol><li> Após a chegada, os ratos fêmeas casa adulto Sprague Dawley cerca de 8-10 semanas de idade (pesando 200-225 g) em grupos de caixas de plástico 3-4 polegadas com cama de lascas de madeira. Mantê-los em uma dieta de acesso ad libitum à comida e água e um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz. Deixar ratos para se aclimatar às condições de habitação e de animais facilidade para um mínimo de 1 semana. NOTA: Todos os procedimentos deste manuscrito são realizados durante o ciclo de luz. </li><li> Após este período de aclimatação, lidar com todos os animais durante 5 min cada, para 2-3 dias. Adequadamente pegar a ratos, uma de cada vez (suportado pelo tronco e não pela cauda),mantê-los de forma segura, e acariciá-los durante este tempo. Lidar com os animais que aparecem mais estressado, nervoso ou ansioso por longos períodos de tempo. Faça isso para minimizar a lidar com o estresse, o que pode afetar os seguintes passos neste protocolo. NOTA: O número de dias e quantidade de tempo lidar com os animais pode variar entre diferentes laboratórios; no entanto, estes devem ser coerentes entre os experimentos dentro do mesmo laboratório. </li></ol> 2. Monitorização do ciclo estral: Vaginal Swab Manchas e Procedimento de coloração <ol><li> Adicione solução salina a 0,9% (cloreto de sódio dissolvido em água destilada). Umedeça um aplicador com ponta de algodão nesta solução. Blot a ponta usando uma toalha de papel para evitar a saturação excessiva, o que poderia levar a coleta de amostra insuficiente ou perda de células. Segurando a cauda para cima longe da abertura vaginal, insira suavemente a ponta de algodão dentro do canal vaginal e rolar em torno das paredes para capturar células vaginais soltos. </li><li> Se o animal urina na camaponta ton, substitua-o por um novo, como a contaminação da urina irá tornar mais difícil para a identificação de fase. Tenha muito cuidado para não causar sofrimento ao animal durante este procedimento, porque a exposição ao estresse vai interromper o ciclo estral. Ao recolher amostras, visam alcançar uma inserção rápida e retirada que não é muito profundo como para minimizar o estímulo extra para o colo do útero, o que pode induzir a pseudociese. NOTA: pseudogestação pode ser identificado como um ciclo estral acíclicos que tipicamente dura cerca de 12 dias, isto é, dias consecutivos de diestro 25. </li><li> Retire com cuidado a ponta do aplicador e enrolá-lo sobre uma lâmina de microscópio pré-rotulados. Evite pressioná muito difícil como muito líquido no slide pode fazer identificação de fase difícil, uma vez seco. NOTA: Um slide pode conter vários dias para cada animal, embora isso possa ser feito de acordo com as preferências individuais. </li><li> Certifique-se que as transferências de amostra para o slide. Coleta de amostras para Several dias consecutivos em uma lâmina para ser capaz de melhor acompanhar e identificar fases estral diárias alterações. NOTA: Se possível, também é ideal se as pessoas que coletam amostras de continuar a ser a mesma para todos os animais. </li><li> Uma vez que a lâmina é seco, comece o protocolo de coloração para a identificação da fase. Usando o kit de coloração (ver Tabela de Materiais), mergulhar slides de 10 vezes no fixador (azul claro), 10 vezes em solução corante (cor de rosa), e 5 vezes em solução counterstain (roxo). Lavar as lâminas com cuidado em água corrente. Vamos lâminas completamente ar seco antes de ver ao microscópio. NOTA: O longo ciclo estral tipicamente 4-5 dias consiste de (nesta ordem): estro (E), metaestro (M), diestro (D), e proestro 26 (P). O estro é caracterizado por células azuis, cornificado, metaestro por leucócitos e uma combinação de células cornificadas e nucleadas, diestro é semelhante ao metaestro na presença de tipos de células excepto eles são muito escassos, e por agregados proestro roxo-coradascélulas de nucleadas (Figura 1). Existem vários procedimentos de coloração, em adição às descritas acima, que são igualmente eficazes para citologia vaginal esfregaço. </li><li> Recolha de amostras para, pelo menos, dois ciclos completos (~ 8-10 dias), a fim de controlar com precisão as fases antes da experimentação. Seja consistente com a hora do dia da colheita de amostras. Coletar amostras de esfregaço vaginal diariamente durante e até o final do experimento. </li></ol> 3. Pré-exposição <ol><li> Antes do início do experimento, pré-expor os animais ao condicionamento câmaras que os animais possam se adaptar ao contexto (câmaras de condicionamento) antes de qualquer teste comportamental. <ol><li> Pré-expor as fêmeas para as câmaras de condicionamento (localizados em caixas atenuantes de sons), com as luzes da casa por 20-30 min por dia durante 3 dias antes de qualquer experimentação. Atribuir a caixa eles são pré-expostos a como a sua câmara para o estudo. Limpe bem tele caixas (paredes e bandejas) entre as sessões e animais para remover os odores, pois podem afetar o comportamento e ciclo estral. </li></ol></li></ol> 4. Dia 1: Habituação / Medo Condicionado <ol><li> Uma vez que os animais tenham sido verificada na fase do estro dos seus ciclos estrais, começar a fase de habituação / condicionamento da experiência de 3 dias. <ol><li> Tome pré-tom medidas iniciais de congelamento prévio para o estímulo condicionado primeiro tom (CS) apresentações em cada dia do experimento. Faça isso por meio da aquisição pontuações por cento de congelamento (calculado dividindo o segundos gastos imóvel pela duração do julgamento, multiplicado por 100) durante o intervalo de tempo de estímulo ausente no início do primeiro julgamento CS-alone antes do início CS. NOTA: Estas medidas podem ser usados ​​para avaliar e comparar os níveis de congelamento da linha de base com aquelas durante habituação, condicionado, extinção, e recall. </li><li> Para realizar o treinamento extinção durante a fase de metaestro,condicionar os ratos no seu último dia de estro. Swab e identificar fase de estro (passo 2) todos os dias antes de iniciar o protocolo experimental (condicionado / extinção / chamada). Como a fase do cio pode durar mais de um dia, o uso história ciclo de prever duração das fases para determinar quando os animais estão prontos para começar a treinar. </li></ol></li><li> Nas câmaras condicionado, ligue o chão grade pé-choque para um gerador de estimulação elétrica. Usar um nível de estimulação de 0,5-0,6 mA como o estímulo não condicionado (US). Use um kHz 4, 80 dB tom como o estímulo condicionado (CS). NOTA: Estes parâmetros podem variar entre laboratórios e podem ser modificados para o condicionamento ideal. <ol><li> Se o programa de análise de congelação requer sinais visuais (em oposição a temporal), co-activar uma luz LED com o tom. Posicionar a luz do lado de fora da câmara operante, dentro do quadro de vídeo. No início de cada ensaio, activar o diodo emissor de luz iluminada e mantê-lo até que a extremidade do the julgamento. NOTA: Esta luz não é visível pelo animal e serve apenas como um marcador para o início e final do julgamento dentro dos arquivos de vídeo gravados (a ser usado para medir o comportamento de congelamento). </li></ol></li><li> Coloque os animais para dentro das câmaras de condicionamento para 5 ensaios CS-alone de habituação. Imediatamente após a sessão de habituação, executar 7 ensaios CS-americanas de medo condicionado emparelhados. Certifique-se de que o tom CS tem a duração de 30 segundos e coterminates com o choque sec US 0,5. Ensaios são executados em todas as sessões (habituação, condicionado, extinção, e de recall), com um intervalo entre variável média de 3 minutos. </li><li> No fim da sessão de condicionamento, os animais regressar às suas gaiolas de alojamento e à instalação para animais até ao dia seguinte. </li></ol> 5. Dia 2: Estradiol Preparação <ol><li> Swab e identificar a fase de estro para todos os animais que foram submetidos Dia 1 do presente protocolo. Prepare o estradiol (também conhecida como E2, 17beta-estradiol, oubeta-estradiol) para a 15 ug / kg de dose de injecção subcutânea utilizando óleo de sésamo ou de 0,9% solução salina como veículo. </li><li> Para calcular a quantidade de estradiol para se preparar para injeções, use os pesos corporais de todos os animais, que foram medidos e registados quando eles foram condicionados no dia 1 deste protocolo. </li><li> Faça os cálculos para padronizar o volume administrado de estradiol (ou seja, 0,2 ml) por rato. Dado que o estradiol é de difícil dissolução, devido à sua insolubilidade em água e requer um grande volume de solvente para a dose pequena, preparar uma solução de reserva por mistura de estradiol em óleo de sésamo sobre o calor até se dissolver. A solução pode então ser passada através de um filtro de 0,22 um, para remover contaminantes. Por exemplo, adicionar um volume calculado de a / 1 ml de solução de óleo de sésamo 3,000 ug de estradiol para o volume total necessário de óleo de sésamo, a fim de atingir um 15 ug / kg num volume de 0,2 ml injecção por animal. NOTA: Como alternativa, utilizar outras formas de estrogênio tha<html> t são solúveis em água e mais fácil de dissolver. </li></ol> 6. Dia 2: Administração Estradiol / Formação Extinction <ol><li> Administrar o estradiol subcutaneamente. Levante a pele solta entre a escápula pelo pescoço em uma pitada suave e inserir a agulha da seringa no triângulo que é formada pelas dobras. </li><li> 30 minutos após as injecções subcutâneas de estradiol, colocar os animais nas câmaras de condicionamento e de novo começar a formação de extinção. Nesta sessão extinção, realizar 20 CS-alone ensaios, com cada ensaio que consiste em um 30 seg, 4 kHz, 80 tom dB, apresentado em um intervalo entre variável média de 3 min. NOTA: O efeito do estradiol na recordação ocorre quando o estradiol é administrado antes da formação extinção ou imediatamente após a extinção. O efeito não é observado 4 horas após a extinção, por isso é recomendado para injetar próximo da hora de início ou no final da sessão de treinamento 15. </li></ol>. le &quot;&gt; 7 Day 3: Extinction recall <ol><li> 24 horas após o treinamento extinção, pincelar os animais que Dia 1 e 2 do presente protocolo concluídas. </li><li> Coloque os animais em suas câmaras de condicionamento atribuídos (o mesmo que o dia 1 e 2). Inicie a sessão recordação extinção, apresentando 3 CS-alone ensaios (os três ensaios de recordação extinção), que consiste de apenas 3,80 dB CS-alone ensaios com intervalos entre tentativas semelhantes às 20 ensaios administrados para o treinamento extinção como descrito no passo 6.2. </li><li> Após a conclusão da sessão de recall, retornar os animais para suas gaiolas. </li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Adquirir dados comportamentais através de vídeo e analisá-los utilizando programas de computador. NOTA: Congelamento pontuações também podem ser contadas manualmente por um experimentador que é cego para o tratamento medicamentoso cronometrando episódios de congelamento durante a apresentação CS de cada julgamento, expresso em percentagem do tempo gasto congelamento durante o tom. O congelamento édefinido pela completa falta de movimento, com excepção da respiração durante os ensaios 30 sec CS-americanos. Calcule por cento congelamento dividindo os segundos gastos congelamento (imóvel) por 30 segundos (duração do julgamento) multiplicado por 100. </li></ol>

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Os autores deste manuscrito não tem concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse a divulgar.

Extinção do medo tem sido extensivamente estudada em ratos machos com os mecanismos neurais que medeiam extinção medo condicionado identificados e avaliados sob várias manipulações. Relativamente poucos estudos analisaram ratas ou o papel das hormonas sexuais na extinção do medo. Para estudar especificamente os efeitos do estrogénio sobre a extinção do medo, naturalmente ciclagem ratas são submetidos a um paradigma comportamental de três dias. Este procedimento consiste em fases habituação / condicionado...

Diferenças sexuais inerentes são observados em vários comportamentos cognitivos e paradigmas de aprendizagem em humanos e roedores. Por exemplo, foi relatado que as mulheres geralmente têm habilidades verbais e orientada para o detalhe mais fortes, enquanto os homens têm melhores habilidades espaciais 1-3. Estas diferenças entre os sexos pode ser em parte devido à influência dos hormônios sexuais. Altos níveis de estradiol melhorar o desempenho em tarefas em que as mulheres são melhores, mas pioram o desempenho em tarefas que os homens geralmente fazem bem 4-6. Embora esta evidência é convincente, a capacidade limitada de controlar completamente ambientes experimentais em estudos humanos torna difícil determinar se esses efeitos sobre o comportamento pode ser atribuído especificamente aos hormônios. Os estudos em animais, em contraste, permite a circunstâncias totalmente controladas. Embora os mecanismos neurais básicos de extinção do medo, foram identificados e são bem estudada em machos, não é claro seestes sistemas são os mesmos em fêmeas ou como eles mudam ao longo do ciclo estral. O condicionamento do medo e extinção são amplamente utilizados paradigmas comportamentais em roedores e humanos para realizar estudos relacionados a transtornos de ansiedade. Dado que as mulheres têm um maior risco de transtornos de ansiedade, bem como a duração dos sintomas e a gravidade maior 7-13, é crítico para incluir fêmeas nestes estudos. A sub-representação das mulheres na pesquisa pode ser atribuída aos desafios de monitoramento fase de estro e contábil para os efeitos comportamentais de hormônios sexuais. Laboratórios que fazem examinar fêmeas nesta problemas encontro em conta que muitas vezes passam não declarada ou não estão descritos nos métodos para seus estudos. Emergentes evidência em roedores sugere que as diferenças sexuais em extinção do medo são modulados por hormonas sexuais 14-18. Com medo condicionado, os animais são treinados para temer um estímulo particular. Depois de uma série de apresentações de unreinforcedo estímulo, os animais aprendem a não temer a sugestão, um processo chamado de extinção. Como bem o animal aprende e consolida a memória de aprender esta tarefa pode ser observado durante um teste de recordação extinção dado algum tempo após o treinamento extinção. Menos expressão medo durante a chamada extinção demonstra boa consolidação da memória extinção. Descobertas recentes de nosso laboratório sugerem que o estrogênio pode modular a consolidação da memória de extinção do medo e melhorar a recordação extinção. Especificamente, os ratos fêmeas que são extintas em proestro, a fase do ciclo estral, durante o qual os níveis circulantes de estrogênio pico, apresentam uma melhor retenção de memória extinção. Em contraste, as mulheres que se extinguem no visor fase metaestro baixo estrogênio relativamente pobre recordação extinção, o que pode ser melhorado com a administração de estradiol exógeno antes ou imediatamente após o treino extinção 15,16. Os mecanismos neurais da extinção consolidação da memória (including o papel dos hormônios sexuais) em fêmeas não são claras. Em animais de laboratório, o papel dos hormônios pode ser investigado utilizando procedimentos de remoção cirúrgicos invasivos, como a castração e ooforectomia. Após a recuperação da cirurgia, os hormônios sexuais são frequentemente exogenamente manipulada durante a realização de uma tarefa comportamental 19. Esta abordagem tem fornecido informações importantes sobre os hormônios sexuais e é útil porque permite manipulações bem controlados de hormônios sexuais (em termos de tempo e dose) 20-23. Esta abordagem, no entanto, não se avaliar a influência das flutuações naturais que ocorrem em todo o ciclo estral nem representam animais &quot;normais&quot;, limitando assim o potencial de translação para estudos em seres humanos. Tem sido bem documentado que os níveis das hormonas sexuais femininas pico e declínio em fases específicas do ciclo estral, e as alterações de expressão de receptor de estrogénio no ciclo, ae 24 após a ovariectomia. Assim, existe a necessidade de realizar estudos sobre as fêmeas com gônadas intactas e refinar modelos experimentais para estudar com segurança os efeitos que os estados altos e baixos de estrogênio pode ter sobre as mulheres ao longo da sua vida útil. Este protocolo incide sobre o efeito do estrogênio sobre os sistemas neurobiológicos envolvidos na extinção do medo. Ele descreve como: 1) monitorar cuidadosamente o ciclo estral, 2) preparar as doses eficazes de estradiol para administração sistêmica, e 3) seguem um paradigma comportamental que inclui o condicionamento do medo, extinção, e recordar na naturalmente ciclismo ratas. Este protocolo pode ser modificado com outras manipulações farmacológicas e ferramentas celulares e moleculares para auxiliar estudos para compreender melhor as diferenças de sexo que são observados no medo condicionado comportamento extinção. Note-se que os procedimentos descritos abaixo são aqueles utilizados no nosso laboratório, e existe uma série de variações destes procedimentos in literatura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="613">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog number</td>
			<td style="width:199px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Fear conditioning chamber</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Graphic State</td>
			<td style="width:159px;">Coulbourn Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Sound-attenuating box</td>
			<td style="width:159px;">Med Associates, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">NIR-022MD</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Estradiol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">E1024</td>
			<td style="width:199px;">In sesame oil for subcutaneous injection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Sesame oil</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S3547-250ML</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Freezescan</td>
			<td style="width:159px;">Cleversys, Inc.</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Dip quick stain</td>
			<td style="width:159px;">Jorgensen Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">J0322A1, J0322A2, J0322A3</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Cotton-tipped applicators</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">23-400-114</td>
			<td style="width:199px;">6-inch, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">0.9% saline</td>
			<td style="width:159px;">LabChem, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">LC23460-2</td>
			<td style="width:199px;">Sodium chloride w/v</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Selectfrost microscope slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-550-003</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:120px;">Virex II 256</td>
			<td style="width:159px;">Diversey, Inc.</td>
			<td style="width:135px;">5019317</td>
			<td style="width:199px;">Dilute 1:256 with water</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:120px;">Luer-Lok Tip 1ml Syringes</td>
			<td style="width:159px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:135px;">309628</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:120px;">Hypodermic disposable needles</td>
			<td style="width:159px;">Exelint International, Co.</td>
			<td style="width:135px;">26402</td>
			<td style="width:199px;">26-gauge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for studying extinction of conditioned fear in naturally cycling female rats

A extinção do medo condicionado tem sido extensivamente estudada em roedores machos. Recentemente, tem havido um número crescente de estudos que indicam que os mecanismos neurais para certas tarefas comportamentais e comportamentos de resposta são diferentes em fêmeas e machos. Usando fêmeas em estudos de pesquisa pode representar um desafio por causa da variação de hormônios sexuais durante o ciclo estral. Este protocolo descreve procedimentos bem estabelecidos que são úteis para investigar o papel do estrogénio na extinção medo a consolidação da memória em ratos fêmeas. Fase do ciclo estral e administração de estrogênio exógeno antes do treino extinção pode influenciar recordação extinção 24 horas mais tarde. A técnica de swab vaginal para identificação fase de estro descrito aqui ajuda o exame e manipulação de ciclismo naturalmente hormônios sexuais. O uso deste modelo básico roedor pode delimitar melhor os mecanismos pelos quais o estrogênio podem modular memória extinção do medo emfêmeas.

Neste protocolo recordação extinção do medo, por cento congelamento foi medida como um indicador do medo. Animais que extinguiu bem e retidos a memória da formação extinção exibiu baixa medo no último dia do teste comportamental durante a chamada extinção. Ratos machos e fêmeas não apresentam diferenças significativas na expressão de medo condicionado durante o condicionamento, extinção, e recordar as fases (Figura 2). No entanto, a diferença entre os sexos se torna evidente quando os...

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Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Protocolo de Estudos de Extinção do medo condicionado em Naturally Ciclismo ratas

Extinction of conditioned fear has been extensively studied in male rodents. Recently, there have been an increasing number of studies indicating that ...

protocol-for-studying-extinction-conditioned-fear-naturally-cycling

Research

JoVE Journal

Behavior

13.1K visualizações.  Massachusetts General Hospital. Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Vídeo: Protocol for Studying Extinction of Conditioned Fear in Naturally Cycling Female Rats

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Comportamento

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during abstinence. Moreover, various environmental challenges can exacerbate this effect, as well as increase ongoing drug intake.
The procedure we describe here highlights the impact of a common environmental challenge, food restriction, on drug craving that is expressed as an augmentation of drug seeking in abstinent rats.
Rats are implanted with chronic intravenous i.v. catheters, and then trained to press a lever for i.v. heroin over a period of 10-12 days. Following the heroin self-administration phase the rats are removed from the operant conditioning chambers and housed in the animal care facility for a period of at least 14 days. While one group is maintained under unrestricted access to food (sated group), a second group (FDR group) is exposed to a mild food restriction regimen that results in their body weights maintained at 90% of their nonrestricted body weight. On day 14 of food restriction the rats are transferred back to the drug-training environment, and a drug-seeking test is run under extinction conditions (i.e.&#160;lever presses do not result in heroin delivery).
The procedure presented here results in a highly robust augmentation of heroin seeking on test day in the food restricted rats. In addition, compared to the acute food deprivation manipulations we have used before, the current procedure is a more clinically relevant model for the impact of caloric restriction on drug seeking. Moreover, it might be closer to the human condition as the rats are not required to go through an extinction-training phase before the drug-seeking test, which is an integral component of the popular reinstatement procedure.

A procedure that allows a demonstration of robust augmentation of drug seeking in food-restricted rats is described. Following heroin self-administration training, rats go through an abstinence period, in a drug-free environment, during which they are mildly food restricted. Drug seeking is then tested in the drug-associated environment.

Um procedimento para estudar o efeito da restrição alimentar prolongada em heroína Buscando em ratos abstinentes

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association between environmental cues and aversive experiences. In this test, mice are placed into a conditioning chamber and are given parings of a conditioned stimulus (an auditory cue) and an aversive unconditioned stimulus (an electric footshock). After a delay time, the mice are exposed to the same conditioning chamber and a differently shaped chamber with presentation of the auditory cue. Freezing behavior during the test is measured as an index of fear memory. To analyze the behavior automatically, we have developed a video analyzing system using the ImageFZ application software program, which is available as a free download at http://www.mouse-phenotype.org/. Here, to show the details of our protocol, we demonstrate our procedure for the contextual and cued fear conditioning test in C57BL/6J mice using the ImageFZ system. In addition, we validated our protocol and the video analyzing system performance by comparing freezing time measured by the ImageFZ system or a photobeam-based computer measurement system with that scored by a human observer. As shown in our representative results, the data obtained by ImageFZ were similar to those analyzed by a human observer, indicating that the behavioral analysis using the ImageFZ system is highly reliable. The present movie article provides detailed information regarding the test procedures and will promote understanding of the experimental situation.

This article presents a protocol for a contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system to assess fear learning and memory in mice.

Contextual e Cued Medo Condicionado Teste Usando um sistema de análise de vídeo em Ratos

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Traçar medo condicionado em ratos

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate drug-seeking behavior and prompt relapse in abstinent drug users. We have developed a procedure to study the behavioral and neural processes that mediate the impact of context on alcohol-seeking behavior in rats. Following acclimation to the taste and pharmacological effects of 15% ethanol in the home cage, male Long-Evans rats receive Pavlovian discrimination training (PDT) in conditioning chambers. In each daily (Mon-Fri) PDT session, 16 trials each of two different 10 sec auditory conditioned stimuli occur. During one stimulus, the CS+, 0.2 ml of 15% ethanol is delivered into a fluid port for oral consumption. The second stimulus, the CS-, is not paired with ethanol. Across sessions, entries into the fluid port during the CS+ increase, whereas entries during the CS- stabilize at a lower level, indicating that a predictive association between the CS+ and ethanol is acquired. During PDT each chamber is equipped with a specific configuration of visual, olfactory and tactile contextual stimuli. Following PDT, extinction training is conducted in the same chamber that is now equipped with a different configuration of contextual stimuli. The CS+ and CS- are presented as before, but ethanol is withheld, which causes a gradual decline in port entries during the CS+. At test, rats are placed back into the PDT context and presented with the CS+ and CS- as before, but without ethanol. This manipulation triggers a robust and selective increase in the number of port entries made during the alcohol predictive CS+, with no change in responding during the CS-. This effect, referred to as context-induced renewal, illustrates the powerful capacity of contexts associated with alcohol consumption to stimulate alcohol-seeking behavior in response to Pavlovian alcohol cues.

A procedure to study the capacity of an alcohol associated environmental context to trigger the renewal of alcohol-seeking behavior in rats is described.

Um procedimento para Observar Renovação induzida por Contexto de pavloviano condicionado Comportamento Álcool-seeking em Ratos

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

A Treatment Package without Escape Extinction to Address Food Selectivity

Feeding difficulties and feeding disorders are a commonly occurring problem for young children, particularly children with developmental delays including autism. Behavior analytic interventions for the treatment of feeding difficulties oftentimes include escape extinction as a primary component of treatment. The use of escape extinction, while effective, may be problematic as it is also associated with the emergence of challenging behavior (e.g., extinction burst). Such challenging behavior may be an acceptable side effect in treatment cases where feeding problems are severe and chronic (e.g., failure to thrive). However, in more acute cases (e.g., selective eating), the negative side effect may be unwarranted and undesired. More recent research on the behavioral treatment of food selectivity has begun to evaluate treatments for feeding difficulties that do not include escape extinction (e.g., demand fading, behavioral momentum), with some success. However, research to date reveals individual differences in responsiveness to such treatments and no clear preferable treatment has emerged. This manuscript describes a multi-component treatment package that includes shaping, sequential presentation and simultaneous presentation, for the treatment of food selectivity in four young children with developmental delays. This treatment package extends the literature on the behavioral treatment for food selectivity and offers a multi-component treatment protocol that may be clinically applicable across a range of treatment scenarios and settings.

Feeding difficulties are a common problem for children with developmental disorders, including autism, and behavioral interventions often include escape extinction. Recent research has begun to evaluate treatments that do not include escape extinction. This manuscript describes a multicomponent treatment package that does not use escape extinction to treat feeding difficulties.

Um pacote de tratamento, sem escapar da extinção a Morada Food Seletividade

Feeding difficulties and feeding disorders are a commonly occurring problem for young children, particularly children with developmental delays including ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the attribution of incentive salience, or the transformation of neutral stimuli into attractive, &#34;wanted&#39; stimuli capable of motivating behavior. Pavlovian conditioned approach (PCA) develops after the response-independent presentation of a conditioned stimulus (CS; e.g., a lever) that predicts the delivery of an unconditioned stimulus (US; e.g., a food pellet) and can be used to measure incentive salience. During training, three patterns of conditioned responses (CRs) can develop: sign-tracking behavior (CS-directed CR), goal-tracking behavior (US-directed CR), and an intermediate response (both CRs). Sign-trackers attribute incentive salience to reward-related cues and are more vulnerable to cue-induced reinstatement of drug-seeking as well as other addiction-related behaviors, making PCA a potentially valuable procedure for studying addiction vulnerability. Here, we describe materials and methods used to elicit PCA behavior from rats as well as analyze and interpret PCA behavior in individual experiments.

Here, we present a protocol to elicit Pavlovian conditioned approach behavior in rats. This procedure can be used to measure individual differences in the tendency to approach and attribute incentive salience to reward-related cues and investigate addiction vulnerability.

Formação Abordagem Condicionada pavloviano em Ratos

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Stress-Enhanced Fear Learning, a Robust Rodent Model of Post-Traumatic Stress Disorder

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders such as post-traumatic stress disorder (PTSD). To understand the biological mechanisms of fear dysregulation in PTSD, it is important to start with a valid animal model of the disorder. This protocol describes the methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of PTSD, in both rats and mice. SEFL was developed to recapitulate critical aspects of PTSD, including long-term sensitization of fear learning caused by an acute stressor. SEFL uses aspects of Pavlovian fear conditioning but produces a distinct and robust sensitized fear response far greater than normal conditional fear responses. The trauma procedure involves placing a rodent in a conditioning chamber and administering 15 unsignaled shocks randomly distributed over 90 minutes (for rat experiments; for mouse experiments, 10 unsignaled shocks randomly distributed over 60 minutes are used). On day 2, rodents are placed in a novel conditioning context where they receive a single shock; then, on day 3 they are placed back in the same context as on day 2 and tested for changes in freezing levels. Rodents that previously received the trauma display enhanced levels of freezing on the test day compared to those that received no shocks on the first day. Thus, with this model, a single highly stressful experience (the trauma) produces extreme fear of the stimuli associated with the traumatic event.

Here we describe the detailed methodology required to conduct stress-enhanced fear learning (SEFL) experiments, a preclinical model of post-traumatic stress disorder, in both rats and mice. The model utilizes aspects of Pavlovian fear conditioning and freezing as an index of enhanced fear in rodents.

Aprendizagem avançada stress medo, um modelo robusto de roedor do transtorno de estresse pós-traumático

Fear behaviors are important for survival, but disproportionately high levels of fear can increase the vulnerability for developing psychiatric disorders ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed incubation of drug craving. Here, we describe a morphine conditioned place preference (CPP) protocol for measuring the incubation of craving in rats. In this protocol, a CPP paradigm mainly employing somatosensory cues is used to establish a long-term reward memory of morphine. A three-chamber CPP box that differs in the texture of the chamber floor is constructed. First, the animals are tested for their baseline preference to the two side chambers for three consecutive days. Then, they are injected intraperitoneally with morphine/saline and put into their non-preferred/preferred chamber for 45 min. After 6 days of conditioning, their preference to the side chambers is tested for 15 min at different time points after the last conditioning session. With this paradigm, the reward memory of morphine could last for at least 18 days. To test whether the above-mentioned protocol can model increased craving, the number of entrances into the two side chambers are counted during the abstinence period. The results show that the entrances increased, suggesting that the CPP paradigm could mimic the incubation of craving. Future studies can employ this model to study neural mechanisms underlying long-term memory and incubation of craving.

Here, a morphine conditioned place preference (CPP) protocol is described to measure incubation of craving in rats.

Um protocolo de preferência condicionada lugar para medir a incubação do desejo em ratos

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...