The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

NOTA: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o cuidado e uso de animais Comitê Institucional (IACUC) da Universidade do Arizona. Uma lista de materiais e equipamentos recomendados podem ser encontrados na Tabela 1. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Perfusão <ol><li> Eutanásia roedor com uma overdose de pentobarbital de sódio (25 mg / kg, IP), e perfundir transcardíaca com solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de completamente sangrados (3-5 min) a um caudal de 8 ml / min. Para obter instruções de perfusão em profundidade, ver Gage et al 2012 9. </li><li> Imediatamente após a descarga de PBS, fixar o tecido irrigando com paraformaldeído a 4% em PBS durante 15-20 min a um caudal de 8 ml / min. </li><li> Remover cérebro e em lugar de 4% de paraformaldeído durante 24 horas, seguido de soluções de sacarose graduadas (15%, 30%, 30%, em sequência; preparado em solução salina tamponada com Tris) a 4 ° C. Transferir o cérebro para o subsequente solução de sacarose óomente depois que o cérebro tem afundado em cada solução. Nota: Normalmente, 5 dias em cada solução é tempo suficiente para que o tecido a afundar. </li></ol></li><li> Congelamento do tecido e cryosectioning <ol><li> Inserir o cérebro em meio de inclusão, tal como o composto outubro e submergir em isopentano a uma temperatura de -35 ° C. Permitir que o cérebro de congelamento por um período mínimo de 10 minutos, e, em seguida, armazena-se a -80 ° C. Problemas podem surgir se a diligência temperatura não é tomada; por favor, veja a discussão para solucionar problemas de informações. </li><li> Os cortes coronais em série com uma espessura de 20 um e uma temperatura de -20 ° C. Recolha tecido em lâminas carregados positivamente. Secções do cérebro pode ser colocado em uma caixa corrediça envolvido em folha de um saco de correr superior e armazenada a longo prazo a -80 ° C. Este método de armazenamento cria um limite duplo para evitar a exposição ao ar e geada. </li></ol></li></ol> 2. Processamento de Tecidos NOTA: equipamentos e materiais Exemplo required para a coloração são mostrados na Figura 3. As alternativas estão disponíveis, no entanto, essas imagens vão ajudar aqueles novos para coloração imuno-histoquímica de visualizar itens apropriados antes de comprar. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Figura 3: Exemplo de itens necessários para coloração imuno-histoquímica A caixa preta mostrado em (A) é uma câmara de umidade ideal para imunofluorescência, como lâminas são protegidas da luz sem a necessidade de envolver a caixa na folha.. Após corte, as lâminas podem ser armazenadas numa caixa tal como a caixa de amarelo mostrado em (B). Envolvendo a caixa firmemente em papel alumínio e colocar em um saco zip-top antes do congelador ajuda a proteger as amostras de tecido do freezer queimar. Um exemplo de lâminas é dada em (C), com diferentes pratos de coloração descritos em (D) e (E </strong&gt;). As lamelas podem variar em tamanho e espessura (F), no entanto 1.2 lamelas grossas proporcionam bons resultados de imagem na maioria dos microscópios confocais e verticais. Um lápis tal como o representado em (G) pode ser utilizado para rotular os slides. Marcadores permanentes devem ser evitados como a tinta pode correr, afetando tanto a coloração ea capacidade de determinar que a amostra é. Uma caneta PAP de mini tal como o mostrado em (H) permite uma borda repelente para ser desenhada em lâminas. <ol><li> Preparação da lâmina <ol><li> Retirar as lâminas do congelador e descongelamento à temperatura ambiente. <ol><li> Opcional: Se as secções foram previamente flutuou de lâminas, colocar as lâminas descongeladas num forno a 60 ° C durante não mais de 4 horas para ajudar a prevenir a partir de secções de tecido flutuando lâminas. </li></ol></li><li> Colocar as lâminas em um rack de slides e correspondente prato. </li><li> Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada, solução entre lavagens mudando. A partir deste passo em frente, evite ter seçons sem líquido por longos períodos de tempo. Nota: Se seções secar, coloração de fundo é aumentada e dados significativos não pode ser obtida de forma confiável. </li></ol></li><li> A coloração de tecidos <ol><li> Em uma caixa de coloração à prova de luz, criar uma &quot;câmara de umidade&quot;, com tecidos sem fiapos umedecido com água deionizada. </li><li> Seque as bordas do slide com um tecido que não solte fiapos, use um mini caneta pap para fazer uma fronteira repelente líquido bem na borda do slide, longe de cortes de tecido. Esta fronteira devem assegurar suficiente espaço entre o menisco do líquido e a borda do tecido de modo que a tensão superficial não afecta a coloração. NOTA: O repelente fronteira caneta PAP pode ser aplicado antes 2.1.3 se os anticorpos de interesse não precisa de recuperação de antigénios microondas. Se a caneta pap tem sido aplicado antes da lavagem em PBS, a integridade da fronteira repelente de líquido deve ser verificado nesta etapa. Use uma caneta mini-pap para preencher eventuais lacunas na fronteira. </li><li&gt; Com as lâminas colocado horizontalmente, a ligação não específica de antigénio bloco por incubação em 4% v / v de soro em PBS (solução bloqueadora). Pipetar 300 ul de solução de bloqueio, por lâmina, durante 1 hora à temperatura ambiente. Certifique-se a solução de bloqueio estende-se para a caneta PAP na borda da lâmina e cobre completamente o tecido para evitar a coloração desigual provocado por tensão superficial perto do tecido. <ol><li> Use soro da mesma espécie em que o anticorpo secundário é feito. Nota: Neste processo, os anticorpos secundários são feitos em burro, e, assim, é utilizado soro de burro. Se forem utilizados anticorpos secundários a partir de duas ou mais espécies diferentes, incluem soro de cada espécie. </li></ol></li><li> Pipeta anticorpo primário em lâminas. Nota: As concentrações de anticorpos para esta coloração foram otimizados em 1: 5.000 e 1: 500 para Iba1 e pan-neuronal, respectivamente. Estas concentrações foram encontrados para mostrar a coloração significativa com uma ausência de coloração de fundo. <ol><li> Solução diluída de bloco para1% de soro em PBS e adicionar anticorpos primários. Pipetar 300 ul de solução de anticorpo primário em 1% de soro, por lâmina. Mais uma vez, é assegurar que o fluido para a extremidade da caneta PAP. Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Incluem três lâminas de controlo: uma que contém anticorpos nem Iba1 nem Pan-neuronais, um com Iba1 sem anticorpo pan-neuronal, e outro com anticorpos pan-neuronal sem Iba1. Mancha estas lâminas na mesma corrida com as mesmas soluções, no entanto omitir os anticorpos primários para testar a ligação não específica de anticorpos secundários. </li></ol></li><li> Na manhã seguinte, lavagem das lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada, solução entre lavagens mudando. </li><li> Anticorpos fluorescentes são sensíveis à luz, portanto, a partir deste passo em frente, minimizar a exposição à luz, garantindo recipientes de lavagem são envoltos em papel alumínio e caixas de hibridação são preto ou incubadas no escuro. Pipetar os anticorpos secundários apropriados em todos os slides e incubar por60 min à temperatura ambiente a uma concentração de 1: 250 em solução de bloqueio (ver o passo 2.2.3) em uma &quot;câmara de humidade&quot; à prova de luz (ver o passo 2.2.1). <ol><li> Use anticorpos secundários de diferentes comprimentos de onda. Aqui, para o anticorpo primário de coelho anti-Iba1, utilizar coelho de burro anti-594 como o anticorpo secundário adequado. Para o rato anticorpo primário anti-Pan-neuronal, utilizar de burro anti-ratinho de 488 como o anticorpo secundário adequado. Alternativamente, usam anti-coelho 488 e 594 anti-rato. </li></ol></li><li> Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada. </li><li> Opcional: executar coloração nuclear. <ol><li> Colocar em Hoechst (ou outro corante nuclear) a uma concentração de 0,03 ug / ml em H2O destilada dupla para 0 exactamente 60 segundos. </li><li> Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada. </li></ol></li><li> Lavar em DDH 2 0. </li></ol></li><li> Lamínula <ol><li> Lâminas lamela com um meio de montagem aquoso, tal como Fluoromount-G ou ProlongGold. Tome o cuidado de remover todas as bolhas usando um aplicador com ponta de algodão. Nota: Outros agentes de montagem poderia ser usado, por mais alto bleed-through entre corantes tem sido observado por alguns poucos dias de lamínulas. </li><li> Use clara unha polonês para selar as bordas, evitando as seções de secar devido à evaporação. Permitir unha polonês para secar em um recipiente à prova de luz, enquanto desliza permanecer plana e à temperatura ambiente, e, em seguida, armazenar em um recipiente à prova de luz envolvido em folha a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Imaging o tecido manchado <ol><li> Microscopia <ol><li> Permitir a unha polonês para secar por pelo menos uma hora antes de começar microscopia, o que deve ocorrer em uma sala escura. </li><li> Adquirir microfotografias usando um microscópio confocal ou pesquisa com uma fonte de luz fluorescente e um anexo de câmera digital. Usando o software que acompanha, definir a exposição para cada comprimento de onda - 405, 488, e 594 - separadamente. Nota: em profundidade instruções de imagem deve estar disponível on-line a partir do fabricante microscópio. </li><li> Adquirir microfotografias em cada canal, sem mover as seções ou ajustar o foco. Tire fotos em cor, ou alternadamente em escala de cinza e converter para colorir depois. Observação: As imagens em escala de cinza de cada canal de cor ou pode ser agrupada em pós-processamento. </li><li> Assegurar que as secções de tecidos não são expostas à luz ambiente ou luz de microscópio, para longos períodos de tempo, como foto-branqueamento das secções ocorrerá. Para evitar isso, aumentar o tempo de exposição, em vez de aumentar a intensidade de luz / laser. </li><li> Não desligue a fonte de luz fluorescente dentro de 30 min de ser ligado. Nota: Alterar a origem de ligar e desligar em rápida sucessão pode diminuir a vida útil da lâmpada fluorescente. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+antigens+and+antibodies.">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li><li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods.">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li><li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies:+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis.">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li><li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-labeled+antibodies:+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens.">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li><li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application.">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li><li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. , (1983).</li><li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Junqueira's basic histology : text and atlas. , (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).</li><li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy).">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li><li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+sections+of+70-100+mum:+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system.">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O objectivo global desta comunicação era introduzir procedimentos de imuno-histoquímica para o leitor. Para isso, o exemplo da rotulagem de casal com Iba1 e antígenos Pan-neuronais para observar microglia e neurônios em paraformaldeído perfusão, foi utilizado sacarose cérebro crioprotegidos, rato criosseccionada. Esta técnica pode ser adaptado para servir finalidades infinitas. Uma matriz de antigénios diferentes numa variedade de tipos de tecidos tais como, mas não limitado para ...

<html> A imuno-histoquímica é um processo para a detecção de antigénios (por exemplo, proteínas) em secções de tecido utilizando anticorpos primários que se ligam especificamente aos antigénios de interesse. A imuno-histoquímica foi lançada pela JR Marrack em 1934, quando ele determinou que os anticorpos poderiam localizar antígenos com grande especificidade 1. A partir de 1942, alguns dos primeiros estudos in vitro, utilizando anticorpos fluorescentes para visualizar imuno-histoquímica, foram publicadas 2,3, após o que o primeiro estudo in vivo histoquímica foi publicado em 4. Durante a década de 1960, três décadas após o início dos métodos imuno-histoquímica, os anticorpos conjugados com enzimas começou a ser usado como reagentes secundários. Estes métodos foram simultaneamente e independentemente desenvolvido na França e os EUA 5,6. Hoje, uma grande variedade de anticorpos oferece infinitas possibilidades para estudos de imunohistoquímica 7. &quot;&gt; O objetivo geral desta correspondência é fornecer uma breve introdução sobre coloração imuno-histoquímica, não pretende ser uma análise abrangente e exaustiva desta técnica No método descrito, técnicas de imunohistoquímica para dois antígenos são apresentados (marcadores para microglia e. neurónios) para a coloração de paraformaldeído perfundido, sacarose crioprotegidos, criosseccionada cérebro de rato. coloração imuno-histoquímica começa com o bloqueio de ligação para reduzir a coloração de fundo não específica de antigénio. Em seguida, a incubação com anticorpo primário permite a ligação a um antigénio específico no tecido. Após o anticorpo primário, outro anticorpo, denominado anticorpo secundário, é aplicado para ligar o anticorpo primário a um sinal de visualização conjugado 8. O anticorpo secundário tem como alvo a imunoglobulina G (IgG) de domínio específico para as espécies em que o anticorpo primário foi levantadas. O anticorpo secundário amplifica o sinal do anticorpo primário, uma vez as regiões Fab de tque se ligam ao anticorpo secundário múltiplos locais no domínio de IgG do anticorpo primário. Enzimas ou moléculas fluorescentes conjugados com as regiões C F do anticorpo secundário permitir a visualização. Por exemplo, um anticorpo primário de coelho anti-Iba1 é uma molécula de IgG de coelho específico para Iba1. Quando burro anti-IgG de coelho é aplicado como anticorpo secundário, ele irá reconhecer e ligar-se a várias regiões do anticorpo anti-IgG de coelho Iba1 (ver Figura 1). O anticorpo de burro pode ser visualizado através de vários métodos. Esta correspondência se concentra na detecção de um fluoroforo conjugado com o anticorpo secundário, o qual reconhece o anticorpo primário, para a visualização por microscopia fluorescente. Em imuno fluorescente, um corante nuclear tal como Hoechst DAPI ou pode ser usado para visualizar todos os núcleos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Figura 1: SchEmatic de representação directa vs. indirecta técnicas de marcação de anticorpos. Os anticorpos ligam-se ao antigénio de interesse e podem ser amplificados por anticorpos secundários dirigidos contra as espécies de os anticorpos primários. Esta técnica pode ser realizada utilizando complexo de avidina-biotina (ABC) para a amplificação e para a visualização DAB (A), ou um anticorpo secundário fluorescente directamente conjugado (B). Alternativamente, os anticorpos primários podem ser directamente conjugado com muitas marcas diferentes, incluindo biotina ou um fluoróforo (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Um método alternativo para a visualização de coloração imuno-histoquímica utiliza 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB; ver Figuras 1 e 2). Isso é diferente de fluorescência usando um biotinilado ouperoxidase de rábano (HRP) conjugado com anticorpo secundário, o qual fornece uma enzima para converter DAB a um precipitado que é visível sob microscopia de campo claro. Nos casos em que um único antígeno é de interesse ou coloração é necessário para ser duradouro, DAB pode ser mais apropriado do que a coloração fluorescente. No entanto, a coloração DAB não é bem adequada para a diferenciação entre vários marcadores, especialmente se dois antigénios nucleares são de interesse. Para obter informações sobre materiais DAB e modificações do protocolo, consultar Tabela 1. Em alternativa, cloreto de nitro azul de tetrazólio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (NBT / BCIP) pode ser usado para visualizar uma fosfatase alcalina (AP) secundário conjugado anticorpo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Imagens representativas de cortes de tecido cerebral de níquel reforçada DAB individuais marcado Rato Rato cérebro ifficções que são rotulados com DAB-níquel reforçada para Iba1 (A) e pan-neuronal (B) permitir a análise de longa duração da microglia ou neurônios sozinho. Barra de escala de 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Deve-se considerar a abundância estimado do antigénio de interesse dentro do tecido a ser analisado. Os métodos indirectos (como descrito acima) são úteis para alvos com baixa abundância. Quando o antigénio de interesse é em grande abundância, métodos directos podem ser aplicados. Os métodos directos envolvem um anticorpo primário que é conjugado directamente a um sinal de visualização, e, portanto, não é necessária qualquer anticorpo secundário. Este método simplifica o processo de coloração, mas elimina a amplificação alcançado por métodos indirectos. Usando um anticorpo primário conjugado directamente elimina também a reactividade cruzada de anticorpos secundáriosquando a rotulagem dupla. Esta comunicação detalha o protocolo para a rotulagem de casal com Iba1 e Pan-neuronais (detalhes na Tabela 1). Iba1 manchas microglia em muitos estados de ativação, incluindo ramificados, hiper-ramificado, ativado, amebóides, ea vara. Manchas Pan-neuronais neuronal axônios, dendritos, e Soma. Desde Iba1 manchas mais microglia e metas Pan-neuronais do neurônio, esta combinação de manchas é útil na obtenção de um amplo entendimento das interações microglia-neurônio. Em suma, a coloração imuno-histoquímica conta com a seleção cuidadosa de anticorpos. Como a questão de pesquisa se torna mais específica, os anticorpos produzidos contra antígenos alternativas pode ser desejado. Para atingir um estado de ativação microglial específico, pode-se optar pelo uso de anticorpos CD45 ou CD68, ao invés de Iba1. Além disso, ao trabalhar com camundongos, F4 / 80 pode obter os resultados necessários. Da mesma forma, os elementos neuronais pode ser dirigida especificamente com anticorpos razada contra o núcleo, sinapse (pré ou pós), axônio, e crescimento cone. Além disso, há outros marcadores que distinguem a idade do neurónio (duas vezes Cotrin, NeuN), e a regeneração neuronal (GAP-43).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

A imuno-histoquímica é uma técnica amplamente utilizada para detectar a presença, localização e abundância relativa de antigénios in situ. Este protocolo nível introdutório descreve os reagentes, equipamentos e técnicas necessárias para concluir coloração imuno-histoquímica de tecido cerebral dos roedores, utilizando marcadores para microglia e elementos neuronais como um exemplo. Especificamente, este documento é um protocolo passo-a-passo para visualização fluorescente de microglia e neurônios via imunohistoquímica para Iba1 e pan-neuronal, respectivamente. Fluorescência-marcação dupla é particularmente útil para a localização de várias proteínas dentro da mesma amostra, proporcionando a oportunidade de observar com precisão interacções entre tipos de células, receptores, ligandos, e / ou a matriz extracelular em relação um ao outro, bem como co-proteína localização dentro de uma única célula. Ao contrário de outras técnicas de visualização, a intensidade da coloração imuno-histoquímica de fluorescência pode diminuir emas semanas a meses após a coloração, a menos que sejam tomadas precauções apropriadas. Apesar desta limitação, em muitas aplicações de rotulagem de fluorescência dupla é preferida em relação às alternativas tais como tetracloridrato de 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) ou fosfatase alcalina (AP), como fluorescência é mais eficaz do tempo e permite a diferenciação mais precisa entre dois ou mais marcadores. A discussão inclui dicas de solução de problemas e conselhos para promover o sucesso.

Este protocolo de coloração resulta em cortes de tecido de cérebro de rato que microglia com marcação fluorescente no canal 594 (vermelho) e neurónios marcados no canal 488 (verde; ver Figura 4). Se uma mancha nuclear tem sido feito, ele irá mostrar no canal 405 (azul). As imagens podem ser tomadas em diferentes canais e sobrepostos para comparação directa dos três canais, ou entre quaisquer dois canais. Muitos pacotes de software de aquisição digitais incluir essa funcionalidade. Double-mar...

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K visualizações.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

Vídeo: Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Neurociência

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.