Suporte parcial para este trabalho foi fornecida pelo Instituto Nacional de Saúde (R01GM100470 e 1R01GM095959-01A1; a MA e JDS) e uma subvenção Núcleo Facility do Instituto de Ciências clínica e translacional Indiana (financiado em parte pelo NIH conceder # UL1 TR000006; a JDS).

1. Swarm Ensaio Mídia Preparação e inoculação 4,5,7,8,11 <ol><li> Preparação de Mídia NOTA: A composição do meio descrito a seguir é aplicável a P. aeruginosa estudos de formação de mecha. Por favor, consulte as especificações de mídia da Tabela 1 para P. aeruginosa, B. subtilis, e M. xanthus ensaios de motilidade superfície. <ol><li> Misturar 200 ml de FAB-menos (NH 4) 2 SO 4 médias enxame (Materiais Tabela), 0,9 g de agar Noble, e 0,2 g de casaminoácidos (Tabela 1) por agitação com uma barra de agitação magnética. Use pequenos volumes (100-300 ml) para melhorar a consistência entre os experimentos. </li><li> Autoclave a mistura 200 ml de ágar / meio utilizando um tempo de exposição de 22 min, temperatura de exposição de 121,1 ° C, e uma opção de ventilação rápida. As configurações de autoclave vai permitir a esterilização adequada e de fusão de agar, mas impedir caramelização ágar. NOTA: agar Noble está propenso a carameloização; motilidade bacteriana é alterada em agar caramelizado. </li><li> Imediatamente após o ciclo de esterilização foi finalizado, feche a tampa da garrafa de mídia para evitar a perda de água por evaporação. No entanto, note que tampar apertado pode causar um &quot;vácuo de vedação&quot; efeito -como na garrafa. </li><li> Arrefece-se a meios para 50 ° C enquanto se agitava à temperatura ambiente (TA) e adicionar 2 ml de glicose 1,2 M estéril. Alternativamente, coloque a mídia em uma incubadora ou água de banho de 60 ° C até que esteja pronto para usar (até 15 horas mais tarde), e prosseguir como indicado. Para evitar a formação de bolhas na mídia, misture bem usando a barra magnética; bolhas na superfície do agar irá evitar mesmo enxame. NOTA: Para outros ensaios, adicionar a este passo os componentes sensíveis ao calor, que não pode ser autoclavado, tal como nutrientes ou corantes adicionais, conforme necessário (por exemplo, a adição de 8 ul Invitrogen Syto 63 corante por 100 ml de ágar derretido a imagem de M. xanthus como mostrado em representative resultados, abaixo). A adição de alguns corantes podem afetar o comportamento de enxame de base, que deve ser verificado com um controle não-dye. </li><li> Em uma capa de laboratório, alíquota de 7,5 ml de meio estéril por 60 milímetros de diâmetro poliestireno placa de Petri e manter as placas em uma única camada (não empilhados). Para a superfície swarming maior, alíquota de 25 ml de meio por 100 mm de diâmetro placa de Petri. É importante para encher os pratos sobre uma superfície plana horizontal. Use o nível de um olho de boi para verificar se a superfície está nivelado. NOTA: Para P. ensaios aeruginosa, utilizando um volume de mídia específicos por placa irá melhorar a consistência e reprodutibilidade. Para B. subtilis e M. ensaios xanthus, derramando mão produz resultados comparáveis ​​aos alíquotas de volume específicos. </li></ol></li><li> Placa de cura <ol><li> No caso de pequenas placas (60 mm), permitir que o meio de agar derretido para curar (definidas como o excesso de líquido semi-sólido e seco) na capa descoberto (isto é, sem tampas) durante 30 min. Maiorplacas (100 mm) exigem um maior tempo de cura (ver Discussão). NOTA: Como alternativa, alguns ensaios pode exigir placas para curar no topo de bancada durante a noite (20-24 h) coberta (isto é, as tampas nos) em uma única camada (Tabela 1). Pulular é sensível tanto ao excesso de humidade e inadequada. A umidade, fluxo de ar e temperatura de qualquer laboratório pode necessitar de variação para a chapa de cura para promover swarming ideal de você bactéria. </li><li> Inocular placas imediatamente após o período de secagem é longo. Não guarde as placas para posterior utilização. <ol><li> Realizar o &quot;teste de difusão de tinta&quot; através da identificação de uma placa de ensaio com 10 ul de mistura de 0,50% (vol / vol) Higgins UV Índia tinta preta e 11 inoculo bacteriano. Se a mistura de tinta / inóculo se espalha rapidamente (ou seja, não retém a forma de gota) na superfície dos meios de comunicação, a mídia vai precisar de mais tempo para secar. NOTA: Para as espécies que são particularmente sensíveis à umidade (&lt;em&gt; por exemplo, P. aeruginosa), realizar um &quot;teste de tinta propagação&quot; quick 11 para determinar se as placas são suficientemente seca. </li></ol></li></ol></li><li> Swarm Ensaio Inoculação <ol><li> Inocular 6 ml de meio de cultura de caldo (ver Tabela 1 para detalhes) com uma colónia isolada fresca a partir de uma (&lt;5 dias de idade, se deixada à temperatura ambiente) Lisogenia Broth (LB) placa de cultura. Incubar durante a noite culturas em caldo (≤18 hr) a 30 ° C ou 37 ° C com agitação horizontal (240 rpm). </li><li> Inocular placas enxame manchando com 1-5 mL de caldo de cultura durante a noite, ou por &quot;cutucar&quot; o agar com um dente estéril escolher ou agulha de inoculação fio. NOTA: Nós preferimos este último método, porque diminui o risco de salpicos de inoculo e evita a adição de humidade adicional à área de superfície enxame. </li></ol></li><li> Swarm Ensaio Incubação <ol><li> Para o ensaio geral, incubar placas de ensaio enxame em 30 °C ou 37 ° C (ou até mesmo 42 ° C para B. subtilis; Tabela 1) -isto é bactéria específica. Inverter as placas durante a incubação, de modo que o excesso de humidade condensa-se sobre a tampa, não o ágar. NOTA: A temperatura pode afectar o fenótipo bem como a cinética. Para P. enxames aeruginosa, incubação a 37 ° C conduz ao crescimento e expansão enxame mais rápido do que a incubação a 30 ° C; no entanto, a morfologia destas enxames difere frequentemente com esta mudança na temperatura. </li><li> Para imagens de time-lapse, incubar as placas enxame à temperatura adequada antes de serem transferidos para a estação de imagens (ver Tabela 1 para detalhes). NOTA: Esta incubação pré-imaging permite enxames para começar o seu desenvolvimento e se estabelecer antes de ser transferido para um novo ambiente, que pode ou não ser o ideal para a enxameação. </li></ol></li></ol> 2. imagem macroscópica de Superfície Motilidade Ensaios 7,8 &lt;ol&gt; <li> Para geração de imagens de lapso de tempo, após os pré-imagem placas de ensaio enxame período de incubação lugar em uma placa de imagem clara dentro de uma estação de imagens in vivo comercial. Imagem até seis, 60 mm de diâmetro ou quatro, placas de 100 mm de diâmetro de cada vez. Dado que a câmara capta imagens de baixo do plano de imagem, inverter as placas de modo a que o percurso óptico não é obstruída 8. Alternativamente, incuba-se a 30 ° C ou 37 ° C (Tabela 1) para a duração da experiência, e remover as placas a ser trabalhada a partir da incubadora em intervalos de tempo definidos. </li><li> Coloque as tampas das caixas de Petri na posição vertical no topo da contraparte placa que contém o meio inoculado. Encha as tampas das caixas de Petri com água para evitar o ressecamento excessivo durante o exame, e colocar todo o conjunto acima de usar outra bandeja clara para manter a umidade durante todo o experimento. </li><li> Usando Imagem Molecular (MI) software 12, ensaio executado (s) em temperatura ambiente usando o imenvelhecimento configurações descritas na Tabela 2. Para imagens de lapso de tempo, estabelecer um protocolo com os passos e as especificações necessárias. </li></ol> 3. Processamento de Dados e Interpretação 7,8 <ol><li> Processamento De Imagem <ol><li> Use software MI para exportar imagens em lote como arquivos TIFF de 16 bits: Arquivo&gt; Exportar ou exportar várias&gt; Selecione o arquivo (s) para exportar e local de exportação. </li><li> Use ImageJ para abrir uma única imagem ou importar uma série time-lapse: <ol><li> Abra uma única imagem: File&gt; Open </li><li> Importação de lapso de tempo seqüência de imagens: File&gt; Import Sequence, e selecione &quot;Classificar nomes numericamente&quot;. <ol><li> Para arquivos de lapso de tempo maiores, selecione &quot;Usar pilha virtual&quot; na janela &quot;Importar Sequence&quot; para empilhar as imagens exportadas em categorias apropriadas (ie, GFP, RFP, etc.). </li></ol></li></ol></li><li> Se necessário, alterar imagens de arquivos de 16 bits para arquivos de 8 bits: Imagem&gt; Tipo&gt; 8-bit NOTA: Algumas ferramentas ImageJ exigem imagens de 8 bits. </li><li> Determinar se a intensidade do sinal para uma sequência de imagens ou de lapso de tempo tem de ser invertida. Coloque o cursor em um ponto brilhante na imagem (por exemplo, o crescimento marcado por fluorescência) e anote a intensidade do sinal &quot;Valor&quot; na barra de ferramentas ImageJ. Em seguida, coloque o cursor em um local escuro fora da área de placa e observar a intensidade do sinal. Se a intensidade do sinal para o ponto escuro é maior do que a intensidade para o ponto brilhante, a intensidade de sinal de imagem tem de ser invertida (siga subpassos 1-2 abaixo). <ol><li> Inverta os sinais de intensidade: Editar&gt; Invert </li><li> Inverta a tabela de referência: Imagem&gt; Tabelas de Pesquisa&gt; Invert LUT </li></ol></li><li> Subtrair o background: Processo&gt; Subtrair fundo, e usar um &quot;raio de rolamento bola&quot; com um raio de pixel que é metade de uma dimensão de imagem (por exemplo, 1.000 pixels para um 2000 x 2000 pimagem Ixel). </li><li> Artificialmente colorir uma imagem ou time-lapse sequência: Imagem&gt; tabelas de pesquisa e selecione a cor apropriada entre as opções da lista. </li><li> Para filmes com dois ou mais canais, fundir e equilibrar as cores antes de salvar como um filme (Processamento de Imagem, Passo 8). Para mesclar imagens juntas, aberto todos os pilhas de imagens em ImageJ, em seguida, selecione Imagem&gt; Cor&gt; Mesclar Canais, e atribuir a cada pilha para um canal de cor. </li><li> Salve seqüência de lapso de tempo como AVI ou QuickTime Filme: Arquivo&gt; Salvar como e escolher o formato e especificações desejadas. </li></ol></li><li> Análise De Dados <ol><li> Adquirir bacteriana da área de superfície do Crescimento para Quantificar taxa de expansão <ol><li> Abrir imagem (s) em ImageJ </li><li> Para calcular o diâmetro da placa em pixels, desenhe uma linha que atravessa o centro de uma placa de ensaio com a ferramenta &quot;Straight&quot; do e medir seu comprimento: Analisar&gt; Medida </li><li> A unidade de medida padrão no ImageJ é o pixel. Obter um factor de conversão, dividindo o diâmetro da placa de ensaio (por exemplo, 60 para uma placa de 60 mm) do comprimento do pixel obtido na etapa anterior. </li><li> Alterar a unidade de medida de pixel para mm: Imagem&gt; Propriedades <ol><li> Altere a &quot;unidade de comprimento&quot; para &quot;mm&quot;, e do &quot;Pixel Largura&quot;, &quot;Altura Pixel&quot; e &quot;Voxel Profundidade&quot; para o fator de conversão calculado na etapa anterior. Marque a caixa &quot;Global&quot; para manter esse fator de conversão através de várias imagens. NOTA: Se ImageJ é fechado e reaberto, ou o campo de visão de uma imagem é alterada (ou seja, uma imagem é ampliada em mais de um outro), o fator de conversão deve ser recalculado. Como alternativa, realizar todas as análises em pixels e depois convertido para mm. </li></ol></li><li> Para cada quadro, rastrear e medir a área de enxame utilizando a ferramenta &quot;Freehand Selections&quot; na barra de ferramentas para rastrear a UOtline do enxame e medir a área usando: Analisar&gt; Medida. Isso irá gerar um medições log que pode ser guardado para posterior análise no Microsoft Excel ou programas similares: Arquivo&gt; Salvar como </li></ol></li><li> Adquirir bacteriana Intensity superfície de crescimento para Quantificar Superfície Taxa de Crescimento <ol><li> Uma vez que o fundo é subtraído (Processamento de Imagem, Passo 5), use o último quadro da seqüência para determinar a área máxima de enxame (Análise de Dados, Passo 1). </li><li> Use a ferramenta de seleção &quot;Oval&quot; na barra de ferramentas para desenhar uma caixa em torno do crescimento de superfície bacteriana. </li><li> Defina a medida de intensidade de pixels na caixa usando dizer: Analisar&gt; Definir Medidas, e selecione &quot;valor de cinza média&quot;. </li><li> Para obter medições de intensidade de sinal para cada quadro na seqüência de lapso de tempo, enquanto no primeiro quadro da seqüência acesse: Analisar&gt; Medida. Isso irá gerar um medições log que pode ser guardado para posterior análise em Microsoft Excel ou programas similares: Arquivo&gt; Salvar como </li></ol></li><li> Alternativa para a seção anterior (Análise de Dados, Passo 2). Use o plugin ImageJ Macros de configurar e executar um crescimento de superfície medida de intensidade de roteiro Macros. <ol><li> Setup um script de medição automatizada para analisar vários quadros simultaneamente: Plugin&gt; New&gt; Macro, e cole o script fornecido (abaixo) na caixa e salvar como um arquivo de texto ImageJ Macros: File&gt; Save, e salvar a pasta do aplicativo ImageJ sob &quot; macros &quot;. numberOfFrames = N for (i = 0; i &lt;numberOfFrames; i ++) { executar (&#39;Medida&#39;); executar (&#39;Next Slice [&gt;]&#39;); } NOTA: Aqui, a variável &quot;N&quot; é para um número indefinido de quadros. </li><li> Edite os &quot;numberOfFrames&quot; no plugin Macros para cada experimento para refletir o número de quadros na seqüência de imagens antes de executar o script. Use: Plugin&gt; Macros&gt;Editar e digite o número correto de quadros na seqüência e salvar (Arquivo&gt; Salvar). </li><li> Siga subetapas 1-3 em Análise de Dados-Step 2, e enquanto no primeiro quadro da seqüência de executar o plugin Macros: Plugin&gt; Macros&gt; Executar. Isso irá gerar um medições log que pode ser guardado para posterior análise no Microsoft Excel ou programas similares: Arquivo&gt; Salvar como </li></ol></li></ol></li></ol>

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Taxas de publicação deste artigo foram parcialmente patrocinado pela Bruker Corporation.

Alcançar swarming reproduzível em laboratório pode ser um desafio, como ensaios enxame são altamente sensíveis a fatores ambientais, tais como umidade e nutrientes disponíveis. O aspecto mais crítico de um ensaio de placa de motilidade superfície humidade na superfície do agar. Antes da inoculação, media enxame deve estar seco o suficiente para evitar que as células bacterianas de nadar em todo o líquido da superfície, mas não tão seco como para inibir a enxameação 5. A incubação deve ocorrer em um ambiente suficientemente úmido: muito pouca umidade pode resultar no ensaio de secagem durante a incubação, enquanto muita umidade pode levar a superfície artificial ou artifactual espalhando. A menos que uma incubadora de umidade controladas está à mão, incubadora e laboratórios umidade pode variar drasticamente. Por conseguinte, um reservatório de água adicional, um humidificador ou um desumidificador dentro da incubadora pode ser necessário para evitar o excesso de secagem ou a acumulação de excesso de humidade, mantendo o Relative umidade perto de 80%. A manutenção dessa umidade ideal pode ser um desafio, se mudanças de umidade sazonais são significativas. Se este for o caso, o protocolo de ensaio enxame vai exigir alguns ajustes para explicar as mudanças sazonais na umidade. Descobrimos que modificar o tempo de secagem da mídia enxame é a maneira mais simples para ajustar para mudanças de umidade sazonais. Monitoramento de umidade constante, tanto dentro como fora da incubadora, é recomendado. Além disso, recomenda-se que os pesquisadores calibrar e validar os seus instrumentos, incubadoras, balanças, etc. erros como menores na temperatura, volume ou quantidade de componentes de mídia pode afetar a reprodutibilidade destes ensaios. Deve também ser notado que o tipo e tamanho da placa utilizada no ensaio pode afectar a placa de humidade, e, assim, enxame. Placas hermeticamente fechados não desabafar o excesso de umidade, assim motilidade natação encorajador. Em contraste, as placas de face aberta permitem muita umidade para escapar. Uma placa de Petrifornece um ambiente ideal porque desabafa off suficiente excesso de umidade para evitar que o líquido se acumulam, mas retém a umidade suficiente para impedir a mídia de secar. Este método detalha um protocolo de ensaio de motilidade superfície que permite a imagem de alta qualidade. Para manter o agar clara para pratos de imagem 60 milímetros de diâmetro são preenchidos com 7,5 ml de ágar. Se imagiologia detalhada não é necessária, os volumes de até 20 ml, também pode proporcionar resultados reprodutíveis. Enquanto motilidade enxame pode ser conseguida através de uma ampla gama de concentrações de ágar, a gama óptima de ágar necessária para enxame depende das espécies. No geral, mais elevadas concentrações de ágar inibem enxameação e, conseqüentemente, o tempo necessário para produzir uma imagem pronta enxame aumenta. P. aeruginosa geralmente pulula sobre as concentrações de ágar entre 0,4-0,7% 1, no entanto, descobrimos que swarming ideal ocorre em uma faixa muito estreita (0,4-0,5%). Outros, como B. subtilis e S. entéricoum enxame de 0,6% de ágar e Vibrio parahaemolyticus em 1,5% agar 10. A concentração necessária de ágar também é determinada pelo tipo e marca de ágar. Maiores agares de pureza, como agar Noble, fortemente aprimorar pululando em P. aeruginosa e são preferidos em relação granulado ágar 13,14. No entanto, estas versões purificadas de ágar são também mais propensas a caramelização durante o ciclo de esterilização em autoclave; dependendo do instrumento, um encurtado / sequência de esterilização modificado (para possivelmente alterar o ciclo de escape para evitar a exposição prolongada do calor) pode ser necessária para preparar a mídia enxame utilizando ágar Noble. Composição de mídia também desempenha um papel no fenótipo enxame observado 3. P. aeruginosa estudos da motilidade swarming geralmente são realizadas por meio de nutrientes mínimos. Nós preferimos FAB médio de 4,8 (Tabela de Materiais), mas outros meios de comunicação, tais como M9, LB, ou pequenas variações para essas mídias comuns,têm sido utilizados com sucesso 9,15,16. Formação Rebento é melhor conseguida em FAB meio mínimo suplementado com glucose como fonte de carbono e de casaminoácidos (CAA), mas sem uma fonte de azoto adicional (ou seja, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Se a formação do cacho ou morfologia não é o foco principal do estudo, então FAB meio mínimo (Tabela de Materiais; Tabela 1) desprovida de CAA é recomendado para que os efeitos das fontes de carbono específicos e / ou nutrientes adicionais podem ser estudados em detalhe. Outras espécies, tais como B. subtilis (apresentado aqui), são swarmers versáteis, capazes de pululando em LB e agar granulado. Estas espécies enxame facilmente, necessitando apenas de ~ 10 horas para desenvolver um enxame inteiro. Esta taxa rápido swarming faz seguindo a progressão do enxame potencialmente difícil, mas nosso protocolo faz tal rastreamento muito viável. A capacidade de realizar enxame de lapso de tempo de imagem fornece uma substancial facilidade na aquisição de dados enxame, particularmente a partir de tais swarmers ávidos. Nós introduzimos um, abrangente protocolo de duas fases robusto e orientações destinadas a melhorar a execução e reprodutibilidade da pesquisa motilidade superfície bacteriana e têm enfatizado principalmente aspectos importante examinar swarming mediada por flagelar. Este protocolo de ensaio enxame detalhes importantes aspectos da composição do meio e manuseio de placas de motilidade superfície para dar uma maior consistência e reprodutibilidade dentro e entre os grupos de pesquisa. Isto irá melhorar a base de comparação entre os diferentes estudos de investigação. Além disso, a abordagem apresentada e protocolo fornece meios para fazer pesquisa sobre swarming e superfície motilidade menos suscetíveis a variações ambientais, fazendo pesquisadores cientes de que tais fatores afetam o seu trabalho e fornecimento de soluções possíveis (por exemplo, como pequenas mudanças na agar afetar swarming 4,5 ). Além disso, o protocolo fornecido paraquantificar aspectos macroscópicos da swarming, oferece uma oportunidade para medir muitos atributos de crescimento da superfície bacteriana que antes eram inquantificável. Nós não examinaram todas as bactérias de superfície motilidade no desenvolvimento deste protocolo. Como tal, espera-se que as modificações do protocolo irá ser necessária para espécies não apresentados aqui. A eficiência deste protocolo será restringido pelos limites inerentes ao equipamento e os materiais utilizados. Por exemplo, estudos de temperatura relacionado não são possíveis ainda com a estação de imagens Bruker, uma vez que o controlo de temperatura não é uma característica do equipamento. Além disso, a utilização de corantes (tal como Vermelho do Nilo para corar rhamnolipídeos) pode ter limitações cinéticas e de concentração 8. Esta técnica baseia-se fortemente sobre o processamento e análise de imagens digitais; melhor automação de análise de dados (por exemplo, usando Macros adicionais de função script no ImageJ) reduziria o tempo necessário para análisee expandir a utilidade dos dados. Finalmente, devido à robustez do protocolo de imagem, aplicações futuras devem visar a expansão dessa técnica para examinar as superfícies de crescimento menos uniformes que são mais relevantes para superfícies colonizados por bactérias ambientais e patogênicos.

Muitas bactérias movem em superfícies utilizando vários meios de auto-propulsão. Alguns fenótipos motilidade pode ser pesquisado em laboratório, utilizando ensaios de placas que são afetados pelo ambiente líquido associado à composição ensaio de placas semi-sólido. Um subconjunto de superfície útil ensaios em placa motilidade envolver ainda uma sala de ar gás fase normalmente. Assim, o resultado de qualquer ensaio de motilidade superfície particular, exige um cuidadoso controle da interface de três fases: a superfície sólida ambiental local, meio líquido, e propriedades do ambiente gás. O modo de motilidade mais vulgarmente estudada em tal ensaio de três fases é conhecido como enxame. Enxameação é o movimento do grupo coordenado de células bacterianas que são movidos por seus flagelos através de filmes líquidos finos em superfícies 1. É tipicamente estudada em laboratórios usando ensaios em placa de semi-sólidos contendo 0,4% -0,8% (p / vol) de ágar 1. Uma matriz depatógenos humanos explorar esse comportamento motilidade para explorar e colonizar o hospedeiro humano. Por exemplo, Proteus mirabilis usa enxameação para subir na uretra, atingindo e colonizar a bexiga e os rins 2. Motilidade Enxameando é geralmente considerado um passo precursor para a formação de biofilme, a principal causa de patogénese em muitos patogénios humanos 3. O fenótipo swarming é muito variada entre espécies bacterianas; sucesso experimental e reprodutibilidade dependem fortemente de factores como a composição de nutrientes, tipo agar e composição, protocolo de esterilização (por exemplo, autoclavagem), a cura meios semi-sólidos e umidade do ambiente (por exemplo, mudanças sazonais), entre outros 3-5. A variabilidade das respostas da motilidade superfície enfatiza os desafios encontrados nestes estudos e os meios de comunicação influência significativa e ambiente pode exercer. Para algumas espécies que pululam, tais como Pseudomonas, pululando motilid pode ocorrer em uma variedade de composições de meio, embora o fenótipo observado e que acompanha taxa de expansão enxame irá variar grandemente 3. Combinados, esses fatores podem fazer estudos de motilidade superfície extremamente desafiador. Variabilidade sazonal dentro de um laboratório pode influenciar estes ensaios trifásicos: ensaios podem funcionar melhor no-ar úmido do verão e pior no ar seco do inverno. Aqui apresentamos as diretrizes gerais para contornar alguns dos desafios mais notáveis ​​quando se realiza estudo placa motilidade superfície. Para alguns estudos da motilidade de superfície, o desenvolvimento de fenótipos específicos é de grande interesse. A maioria, mas não todos, os estudos, publicados examinar swarming de P. aeruginosa mostram a formação de rebentos ou fractais que irradiam a partir de um centro de inoculação 3-9. As diferenças entre P. estirpes aeruginosa têm sido documentados 5,8, mas em muito da presença ou ausência de gavinhas pode ser atribuído ao específic médio e protocolo utilizado para estes ensaios em placa de motilidade enxame. Aqui vamos incluir detalhes sobre como promover a formação de enxames tendril para P. aeruginosa. Porque P. aeruginosa é apenas uma das muitas bactérias que pululam, nós também incluem detalhes para o nosso método para examinar swarming de Bacillus subtilis e deslizamento de Myxococcus xanthus. Como P. aeruginosa, a pesquisa atual sobre B. subtilis e M. xanthus abrange uma variedade de tópicos como os pesquisadores estão trabalhando para discernir os aspectos da esporulação, motilidade, resposta ao estresse, e comportamento de transição de 1,10. Existe uma necessidade de quantificar e os padrões de comportamento dinâmica do (s) específico para estas células em grupos que infestam. Aquisição de dados motilidade Surface, análise e interpretação pode ser complicado e qualitativa. Nós desenvolvemos um protocolo para a análise macroscópica detalhada dos enxames bacterianas que fornece, além de enxame morfologia zona e sIze (por exemplo, de diâmetro), a informação dinâmica quantitativa em relação à taxa de expansão enxame e bacteriana ou densidade bioprodutos distribuição 7. Além disso, este método pode tirar vantagem das proteínas fluorescentes disponíveis, luminescência, e corantes para obter uma visão global de interacções bacterianas 8, bem como para controlar a síntese de bioprodutos (por exemplo, P. aeruginosa ramnolipido 7,8) dentro de um enxame.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Amount</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagentsa:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAB Minimal Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td>2 g</td>
			<td>Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td>9 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace metal solution (see below)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metal Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaSO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255548</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4 x H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 x 5H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C493</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6768</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74</td>
			<td>5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTT Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0234</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>0.1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casitone</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>225930</td>
			<td>1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>240230</td>
			<td>2 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media</td>
			<td>Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids (CAA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>0.10 % (wt/vol)</td>
			<td>Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5431</td>
			<td>0.45 % (wt/vol)</td>
			<td>Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10907</td>
			<td>1.50 % (wt/vol)</td>
			<td>Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>0.60 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Higgins Waterproof Black India Ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>HIG44201</td>
			<td>0.50 % (vol/vol)</td>
			<td>Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO&#174; 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-11346</td>
			<td></td>
			<td>Use 4 &#956;l (for P. aeruginosa) or 8 &#181;l (for M. xanthus) of SYTO&#174; 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relevant Materials and Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Vivo Xtream</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker MI software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays

Motilidade superfície bacteriana, tal como enxame, é geralmente avaliada em laboratório usando ensaios em placa, que exigem a concentrações específicas de agar e, por vezes, a inclusão de nutrientes específicos no meio de crescimento. A preparação de tais meios explícitos e condições de crescimento superfície serve para fornecer as condições favoráveis ​​que permitam não só o crescimento bacteriano mas motilidade coordenada de bactérias sobre estas superfícies dentro filmes líquidos finos. Reprodutibilidade da placa enxame e outros ensaios em placa de motilidade superfície pode ser um grande desafio. Especialmente para mais &quot;Swarmers temperados&quot; que exibem motilidade apenas dentro de intervalos de agar de 0,4% -0,8% (p / vol), pequenas alterações no ambiente de laboratório ou protocolo pode influenciar grandemente os resultados do ensaio do enxame. &quot;Molhabilidade&quot;, ou do teor de água na interface líquido-sólido ao ar destes ensaios em placa, é muitas vezes uma variável chave para ser controlado. Um desafio adicional para a avaliação swarming é como quantificar observed diferenças entre duas (ou mais) experiências. Aqui nós detalhe um protocolo de duas fases versátil para preparar e ensaios imagem enxame. Nós incluem orientações para contornar os desafios comumente associados à preparação de meios ensaio enxame e quantificação de dados destes ensaios. Nós especificamente demonstrar o nosso método que utiliza bactérias que expressam repórteres genéticos fluorescentes ou bioluminescentes, como proteína fluorescente (GFP), luciferase (operon lux), verde ou manchas celulares para permitir imageamento óptico time-lapse. Demonstramos ainda mais a capacidade do nosso método para controlar as espécies que pululam competindo no mesmo experimento.

Variação da placa preparação pode influenciar bastante enxameação. A cura ou secagem tempo após o vazamento de meio agar derretida afeta o filme fino líquido presente nos ensaios de motilidade de superfície e da motilidade bacteriana ao longo do tempo. Alterações na composição nutriente também afectar enxame para várias bactérias. A Figura 1A mostra um efeito de curto prazo de tempo de secagem mediante espalhamento da tinta da índia e propagação de um inoculo inicial de Bacillus subtilis 11. A Figura 1B mostra o efeito do tempo de secagem e a Figura 1C mostra os efeitos do sulfato de amônio [(NH4) 2 SO 4] sobre o desenvolvimento posterior mecha por swarming P. aeruginosa 5. Dados quantificáveis ​​podem ser obtidas a partir de imagens de ponto de extremidade de motilidade superfície usando várias estratégias de imagem. A Figura 2 mostra resultados representativos de crescimento superfície para <em&gt; P. sua imagem de fluorescência da GFP associado aeruginosa pululando e; B. sua imagem de bioluminescência associada subtilis swarming e; ea imagem de fluorescência vermelha associada de SYTO Myxococcus xanthus crescimento de superfície e as células de 64 vitrais. Expansão de aquisição de dados para além de apenas inspecção e de resultados de imagem de pontos de extremidade permite o estudo do comportamento dinâmico (s) para o crescimento de bactérias na superfície. A Figura 3 7 mostra um exemplo de P. aeruginosa swarming (fotografada por células expressando GFP) e sua produção ramnolipido associado (fotografada usando Nile Red manchas de gorduras) -o quantificação de dados destas imagens também é exibido para mostrar a taxa de expansão do P. aeruginosa enxameação. Video 1 mostra um lapso de tempo de B. subtilis swarming fotografada usando luminescência de um -expressing estirpe lux. Video 2 8 mostra um lapso de tempo de P. aeruginosa </em&gt; Typhimurium (verde-expressando GFP) e Salmonella enterica sorotipo (lux red-expressando) em um ensaio enxame competitivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig1.jpg" /> Figura 1: Exemplos de fatores na preparação ensaio de motilidade superfície que afetam resultado ensaio Efeito de (A) o tempo de secagem em agar agar umidade da superfície e espalhando de inóculo para B.. subtilis (Ref 8), (B) o tempo de secagem em agar e P. aeruginosa swarming (Reproduzido de Ref 5 com permissão), e (C) presença ou ausência de sulfato de amônio em P. aeruginosa swarming e formação de mecha. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig2.jpg" /> Figura 2: Alternative abordagens para o crescimento da superfície de imagem e motilidade de bactérias usando uma estação de imagens Bruker. Side imagem ao lado de uma câmera (à esquerda) e por imagem Bruker (direita) que mostram (A) P. aeruginosa expressando (B) B. usando as configurações de Fluorescência verde, fotografada-GFP subtilis expressando lux bioluminescência usando as configurações de luminescência, e fotografada-repórter (C) M. xanthus corados com SYTO 64 fotografada usando configurações Red Fluorescência II. Ver Tabela 2 para definir detalhes. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig3.jpg" /> Figura 3:. A análise qualitativa e quantitativa de uma superfície de ensaio de motilidade (A) análise de lapso de tempo de distribuição da densidade de células, a produção de ramnolipido (mancha vermelha do Nilo lipídico fotografada usando a fluorescência vermelhaI configurações; barra de escala = 15 mm), e (B) quantificação da taxa de expansão a partir de imagens de distribuição de densidade de células de uma P. aeruginosa enxame. (Reproduzido de Ref 6 com permissão.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid1.mov" target="_blank">Video 1.</a> Time-lapse imagem de um B. subtilis enxame. B. subtilis expressando lux e gravados usando as definições de luminescência. Ver Tabela 2 para definir detalhes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid2.mov" target="_blank">Video 2.</a> competição Interspecies visualizado por imagem time-lapse. Enxames de P. aeruginosa (verde; expressando GFP e gravados usando as definições Fluorescência verde) e S. enterica sorotipo Typhimurium (vermelho; exprescantar lux e gravados usando as definições de luminescência). Ver Tabela 2 para definir detalhes. (Reimpressão com permissão de Ref. 7) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> P. aeruginosa </td><td> P. aeruginosa estudos de formação tendril </td><td> B. subtilis </td><td> M. xanthus </td></tr><tr><td> Meios de cultura caldo Overnight </td><td> FAB mais 30 mM de glicose </td><td> FAB mais 30 mM de glicose </td><td> LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td> Caldo de cultura durante a noite a temperatura de incubação </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 h a 30 ° C </td></tr><tr><td> Media Enxame </td><td> FAB </td><td> FAB menos (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2% (p / vol) LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td>Media Enxame: componentes adicionais </td><td> 12 mM de Glicose um </td><td> 10% (peso / vol) CAA, 12 mM de Glicose um </td><td> n / d </td><td> SYTO® 64 um </td></tr><tr><td> Tipo de Agar </td><td> Agar, Noble </td><td> Agar, Noble </td><td> Agar Granulated </td><td> Agar, Noble Affymetrix </td></tr><tr><td> Concentração de agar (p / v) </td><td> 0,45% </td><td> 0,45% </td><td> 0,60% </td><td> 1,50% </td></tr><tr><td> Tamanho da placa Swarm </td><td> 60 milímetros </td><td> 60 milímetros </td><td> 100 milímetros </td><td> 150 milímetros </td></tr><tr><td> Volume de mídia por placa </td><td> 7,5 ml </td><td> 7,5 ml </td><td> Mão Derramado </td><td> Mão Derramado </td></tr><tr><td> Configuração de mídia Enxame método / secagem </td><td> Exaustor; placas descoberto </td><td> Exaustor; placas descoberto </td><td> De bancada; placas cobertas </td><td> De bancada; placas cobertas </td></tr><tr><td> Configuração de mídia Enxame / tempo de secagem </td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> Overnight (20 -24 h) </td><td> Overnight (20 -24 h) </td></tr><tr><td> Swarm temperatura ensaio de incubação </td><td> 30 ou 37 ° C </td><td> 30 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> Incubação de lapso de tempo de imagem </td><td> 30 ° C durante pelo menos 4 h </td><td> 30 ° C durante pelo menos 4 h </td><td> 37 ° C durante 2 hr </td><td> RT durante 12 hr </td></tr><tr><td> Time-lapse comprimento captura </td><td> 24 hr </td><td> 24 hr </td><td> 10 hr </td><td> 66 hr </td></tr><tr><td> Configuração Time-lapse </td><td> 1 frame / 10 min </td><td> 1 frame / 10 min </td><td> 1 frame / 6 min </td><td> 1 frame / 10 min </td></tr><tr><td colspan="3"> Adicionado após a autoclavagem. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Especificações para Superfície Motilidade Ensaio preparação inclui superfícieespecificações de preparação do ensaio de motilidade para P. aeruginosa, B. subtilis, e M. xanthus. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Sinal </td><td> Fluorescência Verde </td><td> Red Fluorescência I </td><td> Red Fluorescência II </td><td> Luminescência </td></tr><tr><td> Proteína ou corante </td><td> Proteína de Fluorescência Verde (GFP) </td><td> proteína mCherry ou Nile Red ramnolipido mancha </td><td> SYTO® 64 </td><td> Luciferase de lux operon </td></tr><tr><td> Comprimento de onda de excitação (nm) </td><td> 480 ± 10 </td><td> 540 ± 10 </td><td> 590 ± 10 </td><td> Fora </td></tr><tr><td> Comprimento de onda de emissão (nm) </td><td> 535 ± 17,5 </td><td> 600 ± 17,5 </td><td> 670 ± 17,5 </td><td> Sem filtro </td></tr><tr><td> O tempo de exposição (seg)</td><td> 30 </td><td> 60 </td><td> 60 </td><td> 240 </td></tr><tr><td> parada f- </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2,5 </td><td> 1.1 </td></tr><tr><td> FOV (mm) </td><td> 190 </td><td> 190 </td><td> 140 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Plano focal (mm) </td><td> 27,5 </td><td> 27,5 </td><td> 12.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Binning (pixels) </td><td> Nenhum </td><td> 2 x 2 </td><td> Nenhum </td><td> 8 x 8 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Geração de Especificação especificações estação Bruker imaging para fluorescência vermelha e verde, e luminescência de imagem de crescimento de superfície bacteriana..

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Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K visualizações.  University of Notre Dame. Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques. 

Vídeo: Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Biologia

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Monitor de motilidade gastrointestinal (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidez baseado Triagem Interação Extracelular (AVEXIS) para a detecção escalável de baixa afinidade Extracelular receptor-ligante Interações

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

Imagem de lapso de tempo de enxames bacterianos e a resposta ao estresse coletivo

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Imagem e Análise Automatizada para a Quantificação de Macropinoss fluorescentes rotulados

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

Quantificação da Competição Interbacteriana usando imagens de fluorescência unicelular

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualizando a motilidade bacteriana com base em uma reação de cor

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...